L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le cellule mononucleari che risiedono nella lamina propria del colon dalla digestione enzimatica del tessuto usando il collagenae. Questo protocollo consente l'isolamento efficiente delle cellule mononucleari con conseguente sospensione a singola cellula che a sua volta può essere utilizzata per l'immunofenofizzazione robusta.
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Articolo metodologico
Isolamento delle cellule mononucleari Di Lamina propria dal colon Murine utilizzando Collagenase E
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'intestino è la casa del maggior numero di cellule immunitarie nel corpo. Il piccolo e grande sistema immunitario intestinale polizia l'esposizione a antigeni esogeni e modula le risposte a potenti stimoli immunitari microbicamente derivati. Per questo motivo, l'intestino è un importante sito bersaglio di disregolazione immunitaria e infiammazione in molte malattie tra cui, ma, non limitato a malattie infiammatorie intestinali come la malattia di Crohn e la colite ulcerosa, innesto contro l'ospite (GVHD) dopo l'osso trapianto di midollo (BMT), e molte condizioni allergiche e infettive. I modelli Murine di infiammazione gastrointestinale e colite sono pesantemente utilizzati per studiare le complicazioni GI e per ottimizzare pre-clinicamente le strategie per la prevenzione e il trattamento. I dati ricavati da questi modelli attraverso l'isolamento e l'analisi fenotipica delle cellule immunitarie dall'intestino sono fondamentali per un'ulteriore comprensione immunitaria che può essere applicata per migliorare i disturbi infiammatori gastrointestinali e sistemici. Questo rapporto descrive un protocollo altamente efficace per l'isolamento delle cellule mononucleari (MNC) dal colon utilizzando un'interfaccia mista di gradiente di densità basata sulla silice. Questo metodo isola riproducibilmente un numero significativo di leucociti vitali riducendo al minimo i detriti contaminati, consentendo la successiva fenotipizzazione immunitaria mediante citometria di flusso o altri metodi.
Introduzione
Sebbene il tratto gastrointestinale (GI) sia principalmente dedicato alla lavorazione e al riassorbimento dei nutrienti dagli alimenti, il tratto GI mantiene anche un ruolo centrale nell'integrità del sistema vascolare, linfatico e nervoso e di numerosi altri organi attraverso il suo sistema immunitario mucosale e submucosale1. Il sistema immunitario GI ha un ruolo influente nella salute gastrointestinale e sistemica a causa della sua costante esposizione a antigeni estranei da alimenti, batteri commensici o agenti patogeni invasori1,2. Pertanto, il sistema immunitario GI deve mantenere....
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Protocollo
Tutti gli studi sono stati condotti nell'ambito di protocolli di ricerca sui roditori esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della University of Miami Miller School of Medicine, che soddisfa gli standard veterinari stabiliti dall'American Association per laboratorio di scienza animale (AALAS).
1. Preparazione delle soluzioni
- Come descritto nella Tabella 1, preparare il buffer del colon, il supporto di separazione della densità basata su Silica 100%, il supporto di separazione della densità basata su Silica 66%, il supporto di separazione della densità basato su Silica 44%, il buffer....
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Risultati
Quando si lavora con modelli di malattia del colon murino, è utile essere in grado di quantificare e valutare qualitativamente, tra il MNC del colon, più sottoinsiemi di cellule immunitarie coinvolti nel processo infiammatorio. La sospensione a singola cellula di MNC ottenuta attraverso l'applicazione di questo protocollo facilita tale caratterizzazione fenotipica in modo robusto e riproducibile. Come prova di principio per l'applicazione di questo metodo di isolamento in diverse impostaz.......
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Discussione
Questo protocollo visivo descrive metodi ben tollerati per l'isolamento delle cellule mononucleari coloniche, tra cui i linfociti propria di lamina (LPL). Dato che questo protocollo è stato ottimizzato nella valutazione di modelli di colite murina pre-trapianto in cui le citochine infiammatorie e le lesioni tissutali si prestano alla scarsa redditività della MNC recuperata, prevediamo che questi metodi possono essere tradotti in altri applicazioni che richiedono l'analisi fenotipica del MNC colonico. Questi includono, ma.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni #1K08HL088260 e #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), e dalla Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). I topi C57BL/6 e BALB/c utilizzati in questo studio sono stati allevati nella nostra struttura o forniti da Jackson Labs o Taconic.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Petri DIsh | Thermo Scientific | da | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| Pipetta sierologica monouso da 10 mL | Corning | 4100 | |
| Siringa da 10 mL | Becton Dickinson | 302995 | |
| Provette coniche non sterili da 15 mL | TruLine | TR2002 | |
| 18 G Ago smussato | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 ml Pipetta sierologica monouso | Corning | 4250 | |
| 40 μ m dimensione dei pori Filtro cellulare | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Tampone di fissazione | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenasi E da Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0,5 M Sterile Soluzione | Amresco | E177-500ML | |
| Siero fetale bovino | Thermo / Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide VWR | Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan blu | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
Riferimenti
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation<....
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Ristampe e permessi
