Preparazione di un campione di plasma per la spettrometria di massa mediante una workstation automatizzata

Sommario

Qui, presentiamo un metodo automatizzato di digestione delle proteine plasmatiche per l'analisi proteomica quantitativa basata sulla spettrometria di massa. In questo protocollo, le fasi di trasferimento e incubazione di liquidi per la denaturazione delle proteine, la riduzione, l'alchilazione e le reazioni di digestione della cipina sono semplificate e automatizzate. Ci vogliono circa cinque ore per preparare una piastra da 96 pozze con la precisione desiderata.

Abstract

La preparazione del campione per l'analisi della spettrometria di massa in proteomica richiede scissione enzimatica delle proteine in una miscela di peptidi. Questo processo comporta numerose fasi di incubazione e trasferimento liquido al fine di ottenere la denaturazione, riduzione, alchilazione, e scissione. L'adattamento di questo flusso di lavoro su una workstation automatizzata può aumentare l'efficienza e ridurre i coefficienti di varianza, fornendo così dati più affidabili per confronti statistici tra tipi di campione. In precedenza abbiamo descritto un flusso di lavoro di preparazione automatica del campione proteomico¹. Qui, riportiamo lo sviluppo di un flusso di lavoro più efficiente e meglio controllato con i seguenti vantaggi: 1) Il numero di fasi di trasferimento liquido è ridotto da nove a sei combinando reagenti; 2) Il tempo di pipettaggio si riduce mediante il pipettaggio selettivo della punta utilizzando una testina di pipettaggio a 96 posizioni con più canali; 3) La produttività potenziale è aumentata dalla disponibilità di un massimo di 45 posizioni del ponte; 4) l'involucro completo del sistema fornisce una migliore temperatura e un controllo ambientale e riduce il potenziale di contaminazione di campioni o reagenti; e 5) L'aggiunta di peptidi stabili con etichettaisti isotopi, così come di proteine di galactosidasi, per ogni campione rende possibile il monitoraggio e il controllo della qualità durante l'intero processo. Questi miglioramenti hardware e di processo forniscono una buona riproducibilità e migliorano la precisione intra-analisi e inter-saggio (CV inferiore al 20%) per la quantificazione di proteine e peptidi a base di LC-MS. L'intero flusso di lavoro per la digestione di 96 campioni in una piastra di 96 pozzetto può essere completato in circa 5 ore.

Introduzione

La quantificazione di proteine e peptidi a base di spettrometria di massa (MS) viene sempre più applicata come strumento bioanalitico per l'analisi del plasma nella ricerca di base e nei laboratori clinici^2,3. La strumentazione e l'informatica necessarie sono progredite rapidamente in quanto la SM è diventata il metodo di scelta per quantificare le proteine o le proteine modificate prendendo di mira specifiche sequenze di peptidi a causa della sua capacità di quantificare centinaia di peptidi in una singola corsa MS⁴. La preparazione del campione serve come base per qualsiasi analisi proteomica. Prima dell'analisi della SM, le proteine in un campione biologico sono tipicamente denaturate, ridotte, alchilate, digerite in peptidi a prova, e dissalate⁵. L'alchilizzazione blocca i cistein per prevenire modifiche incontrollate e garantire che tutti i cistein abbiano la stessa massa. Successivamente, la trypsina viene aggiunta per digerire le proteine nei peptidi. Ognuno di questi passaggi richiede l'ottimizzazione e l'intero processo viene tradizionalmente eseguito manualmente, consentendo l'introduzione di errori analitici.

La pipeline di sviluppo di biomarcatori tradizionale è costituita da due processi principali: la proteomica del fucile per la scoperta globale delle proteine per creare un inventario proteico approfondito⁶ e una proteomica mirata per la verifica e la convalida finalizzata alla quantitazione delle proteine ad alta precisione e ad alta velocità^{7 .} Indipendentemente dall'approccio della SM, la preparazione del campione è la stessa e si concentra sulla scissione enzimatica delle proteine in una miscela di peptidi. Come proposto da Van Eyk e Sobhani⁸, avendo un metodo che permette un'analisi precisa, precisa e riproducibile sia per la scoperta che per i saggi mirati si desidera spostare efficacemente i biomarcatori di scoperta nei saggi clinici implementati. A tale scopo, l'automazione della preparazione dei campioni sarà utile e fornirà la possibilità di aumentare l'efficienza per l'analisi ad alta velocità effettiva. I metodi manuali introducono in genere errori analitici oltre i limiti accettabili specificati dalla Food and Drug Administration (FDA) nella revisione bioanalitica Method Validation Guidance, che include biomarcatori e diagnostica^2,9. Lo sviluppo di un flusso di lavoro di preparazione dei campioni di proteine MS veloce, altamente accurato e vivavoce sarà necessario per facilitare la ricerca sui biomarcatori, che richiede la preparazione e l'analisi di migliaia di campioni biologici. La preparazione del campione MS prevede molti passaggi in cui è possibile introdurre errori e il processo è noioso e dispendioso in termini di tempo.

Nel nostro metodo migliorato, è stata programmata una workstation automatizzata per eseguire tutte le procedure necessarie di preparazione del campione di plasma in un totale di 6 passaggi (Figura 1) per garantire: 1) trasferimenti accurati di liquidi; 2) la reazione viene avviata e interrotta in un momento coerente; 3) la reazione viene eseguita a temperatura controllata (cioè incubatrice); e 4) la reazione ha una miscelazione uniforme per tutte le reazioni. Abbiamo inoltre implementato l'aggiunta di proteine di controllo qualità esogene e standard interni (standard di peptidi con etichetta isotopo stabile) per garantire una qualità e una produttività riproducibile della quantificazione di proteine e peptidi a base di LC-MS in un formato di 96 pozzi. Per la preparazione del reagente, l'orario di lavoro e un totale di 1.000.000 di fasi di pipettaggio sarebbero necessarie per elaborare 96 campioni in singoli tubi. L'automazione riduce il tempo pratico e il numero di interazioni umane coinvolte.

Protocollo

1. Programmazione per il gestore automatico di liquidi

1. Creare un nuovo metodo dal menu File (File Nuovo metodo)
   NOTA: completare i passaggi nell'ordine indicato. Il carattere corsivo indica il testo da digitare nel software Biomek. Si prega di contattare gli autori per informazioni riguardanti le tecniche di pipettaggio e modelli.
2. Digitare Le variabili del passaggio iniziale e i relativi valori nel passaggio iniziale, come indicato nella tabella 1.
3. Impostare le colonne per la pipettatura delle punta selettiva. Per i passaggi 1.3-1.7, fare clic sul passaggio Imposta globale nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo.
   1. Utilizzando il passaggio Imposta globale, impostare il valore di "FirstColumn" sulla variabile FirstColumn_Global, il valore della variabile LastColumn_Global, il valore di "LastColumn-FirstColumn" per la variabile Columnse il valore di Columns 8 per la variabile Wells.
   2. Selezionare l'istruzione Script nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarla nel metodo. Digitare lo script VB come indicato nella Figura 2.
4. Impostazione dei volumi per le miscele Imposta globale e soluzioni.
   1. Utilizzando il passo Imposta globale, impostare i valori corrispondenti per le variabili di combinazione di volume come mostrato nella tabella 2.
   2. Fare clic sul passaggio Se nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo. In condizioni, digitare Autosampler.
   3. In Quindifare clic sul passaggio Imposta globale nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo nel metodo.
   4. Utilizzando il passaggio Imposta globale , impostare il valore =(MobilePhase ))10 per la variabile MobilePhaseWell.
   5. In Altro, fare clic sul passaggio Imposta globale nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo .
   6. Utilizzando il passo Imposta globale, impostare il valore 0 sulla variabile MobilePhaseWell
5. Configurazione dell'impostazione guidata dei labware (GLS)
   1. Fare clic sul passaggio Editor deck nella barra degli strumenti in Utilità. Creare un nuovo mazzo che corrisponda al layout del mazzo in Figura 3 ed etichettarlo come Deck 1.
   2. Fare clic sul passaggio Configurazione guidata nella barra degli strumenti in Configurazione e dispositivi e trascinarlo nel metodo. Trascinare e rilasciare i tipi di labware nelle posizioni del deck come indicato nella tabella 3. Successivamente, compilare le schede nella tabella come illustrato nella tabella 3 e nella figura 4 (Impostazione dell'impostazione guidata).
6. Impostazione della procedura per il conteggio delle manches
   1. Fare clic sul passaggio Definisci procedura nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo. Procedura del nome come TipCount.
   2. Fare clic sull'istruzione Script nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo nel metodo. Digitare lo script VB come indicato nella Figura 5 (script di conteggio dei suggerimenti).
   3. Fare clic sul passaggio Se nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo.
   4. In condizioni, digitare TL5 : 0.
   5. In Quindifare clic sul passaggio Sposta Labware nella barra degli strumenti in Configurazione e passaggi dispositivo e trascinarlo nel metodo. Spostare il labware da TL5 a TR3. Fare clic sul passaggio Sposta Labware nella barra degli strumenti, in Configurazione e passaggi dispositivo e trascinarlo nel metodo. Spostare i labware da TL2 a TL5. Infine, fare clic sul passaggio Sposta Labware nella barra degli strumenti in Configurazione e passaggi dispositivo e trascinarlo sul metodo. Spostare i labware da BC90 a TL2.
7. Definizione della procedura per l'incubatore
   1. Fare clic sul passaggio Definisci procedura nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo. Procedura del nome come Incubatore.
   2. Digitare HalfTime come nome variabile e 1800 come valore predefinito.
   3. Digitare NextTemp come nome variabile e 22 come valore predefinito.
   4. Digitare temp come Nome variabile e 60 come Valore predefinito.
   5. Fare clic sul passaggio Enhanced Move Labware nella barra degli strumenti in Installazione e passaggi dispositivo e trascinarlo sul metodo. Spostare il labware da P11 a INHECO1.
   6. Fare clic sul passaggio Esegui procedura nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo. Procedura del nome come TipCount.Name procedure as TipCount.
   7. Fare clic sul passaggio InHECO Incubate nella barra degli strumenti in Integrazioni e trascinarlo sul metodo. Digitare INHECO1 per l'uso del dispositivo in posizione, HalfTime for 3 Incubate for, .Temp for . Selezionate l'opzione Scuoti durante l'incubazione e lo stile di agitazione orbitale (in senso orario). Per le impostazioni, digita 1,00 mm da un lato all'altro, 6,6 volte al secondo, 1,00 mm in avanti dell'annuncio all'indietro e 6,6 volte al secondo.
      NOTA: Assicurarsi che il software INHECO Incubator sia installato.
   8. Fare clic sul passaggio InHECO Incubate nella barra degli strumenti in Integrazioni e trascinarlo sul metodo. Digitare INHECO1 per l'uso del dispositivo in posizione, HalfTime for 3 Incubate for, .Temp for . Selezionate l'opzione Scuoti durante l'incubazione e lo stile di agitazione orbitale (in senso antiorario). Per le impostazioni, digitare 1,00 mm da un lato all'altro, 6,6 volte al secondo, 1,00 mm avanti e indietro a 6,6 volte al secondo.
   9. Fare clic sul passaggio Pausa nella barra degli strumenti in Configurazione e passaggi dispositivo e trascinarlo sul metodo. Mettere in pausa l'intero sistema per 1 s.
   10. Fare clic sul passaggio Definisci procedura nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo. Procedura del nome come Incubatore.
   11. Fare clic sul passaggio InHECO Incubate nella barra degli strumenti in Integrazioni e trascinarlo sul metodo. Digitare INHECO1 per l'uso del dispositivo in posizione, 1 per Incubazione per, NextTemp per C e 3 per la temperatura di destinazione.
8. Procedura di definizione per Orbital.
   1. Fare clic sul passaggio Enhanced Move Labware nella barra degli strumenti in Installazione e passaggi dispositivo e trascinarlo sul metodo. Spostare il labware da P11 a Orbital1.
   2. Fare clic sul passaggio Esegui procedura nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo. Selezionare la procedura TipCount.Select procedure TipCount.
   3. Fare clic sul passaggio Azione dispositivo nella barra degli strumenti in Configurazione e passaggi dispositivo e trascinarlo nel metodo. Selezionare Dispositivo OritalShaker0, Comando TimedShake. Entrare velocità di agitazione 1000, Tempo di raggiungere la piena velocità 2, Tempo di agitare 30.
   4. Fare clic sul passaggio Enhanced Move Labware nella barra degli strumenti in Installazione e passaggi dispositivo e trascinarlo sul metodo. Spostare il labware Orbital1 in P11.
9. Impostazione del primo mix
   1. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimento nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo. Selezionare Ridisponi posizione TL4.
   2. Fare clic sul passaggio InHECO Incubate nella barra degli strumenti in Integrazioni e trascinarlo sul metodo. Digitare in INHECO1 per l'uso del dispositivo in posizione, 1 per Incubazione per, 60 per C e 3 per la temperatura di destinazione.
   3. Fare clic sul passaggio Ciclo nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo, all'interno del passaggio Seleziona suggerimento. Digitare col come variabile : FirstColumn come Start, LastColumn come End e 1 come Increment.
   4. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti di caricamento suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo nel metodo, all'interno del passaggio del ciclo. Selezionare Suggerimenti BC90, Posizione TL5 e Posizione suggerimenti di backup TL2 dal menu a discesa. Selezionare Colonna/e singola/e e digitare 1.
   5. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti aspirate nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del passaggio del ciclo. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reagent Plate Position . Digitate il volume "FirstMix",Aspirate nella colonna 1 e nella riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
   6. Fare clic sul passaggio Seleziona dispense suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del passaggio del ciclo. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reagent Plate Position . Digitate il volume "FirstMix",eroga nella colonna "col" e alla riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
   7. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti Scarica nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del passaggio del ciclo. Selezionare Scarica suggerimenti su TR1.
10. Impostazione degli esempi
    1. Fare clic sul passaggio Se nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo. Digitare SamplePlate come condizione.
    2. In Quindi, fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti di caricamento suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione dei liquidi e trascinarlo sul metodo . Selezionare Suggerimenti BC90, Posizione TL5 e Posizione suggerimenti di backup TL2 dal menu a discesa. Selezionare Colonne singole e digitare in Colonne di pin.
    3. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti aspirate nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, entro di che. Selezionare Greiner96RoundPS Labware Type e Samples Position. Digitare il volume , Esempio, Aspirate nella colonna FirstColumn e la riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    4. Fare clic sul passaggio Seleziona dispense suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno di quindi. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reaction Plate Position. Digitare il volume diesempio , dispensare nella colonna , FirstColumn e la riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    5. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti Scarica nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, entro di che. Selezionare Scarica suggerimenti su TR1.
    6. Dopo la fine del passaggio If, fare clic sul passaggio Esegui procedura nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo nel metodo. Selezionare la procedura Incubatrice. Digitare HalfTime come nome variabile e 1800 come valore predefinito. Digitare NextTemp come nome variabile e 22 come valore predefinito. Digitare temp come Nome variabile e 60 come Valore predefinito.
11. Impostazione del blocco Cysteine
    1. Fare clic sul passaggio Ciclo nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo, all'interno del passaggio Seleziona suggerimento. Digitare col come variabile , FirstColumn come Start, LastColumn come End e 1 come Increment.
    2. In Ciclo ,fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti di caricamento suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione dei liquidi e trascinarlo sul metodo . Selezionare Suggerimenti BC90, Posizione TL5 e Posizione suggerimenti di backup TL2 dal menu a discesa. Selezionare Colonna/e singola/e e digitare 1.
    3. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti aspirate nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del ciclo. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reagent Plate Position . Digitate il volume "CysteineMix", aspirate alla colonna 2 e alla riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    4. Fare clic sul passaggio Seleziona dispense suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del ciclo. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reaction Plate Position. Digitare il volume , CysteineMix, dispensare nella colonna , col e riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    5. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti Scarica nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, entro di che. Selezionare Scarica suggerimenti su TR1.
    6. Dopo la fine del ciclo If, fare clic sul passaggio Esegui procedura nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo nel metodo. Selezionare la procedura Incubatrice. Digitare HalfTime come nome variabile e 300 come valore predefinito. Digitare NextTemp come nome variabile e 43 come valore predefinito. Digitare temp come Nome variabile e 25 come Valore predefinito.
12. Impostazione del secondo mix
    1. Fare clic sul passaggio Ciclo nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo, all'interno del passaggio Seleziona suggerimento. Digitare col come variabile , FirstColumn come Start, LastColumn come End e 1 come Increment.
    2. In ciclo, fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti di caricamento suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione liquidi e trascinarlo sul metodo. Selezionare Suggerimenti BC90, Posizione TL5 e Posizione suggerimenti di backup TL2 dal menu a discesa. Selezionare Colonna/e singola/e e digitare 1.
    3. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti aspirate nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del ciclo. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reagent Plate Position . Digitate il volume "SecondMix",Aspirate alla colonna 3 e alla riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    4. Fare clic sul passaggio Seleziona dispense suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del ciclo. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reaction Plate Position. Digitare il volume , SecondMix, Distribuisci nella colonna , col e riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    5. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti Scarica nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, entro di che. Selezionare Scarica suggerimenti su TR1.
    6. Dopo la fine del ciclo If the, fare clic sul passaggio Esegui procedura nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo . Selezionare la procedura orbitale.
    7. Fare clic sul passaggio Pausa nella barra degli strumenti in Configurazione e passaggi dispositivo e trascinarlo sul metodo. Mettere in pausa l'intero sistema per 1 s.
13. Configurazione dell'aggiunta Di Trypsin
    1. Fare clic sul passaggio Ciclo nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo, all'interno del passaggio Seleziona suggerimento. Digitare col come variabile , FirstColumn come Start, LastColumn come End e 1 come Increment.
    2. In Ciclo ,fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti di caricamento suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione dei liquidi e trascinarlo sul metodo . Selezionare SUGGERIMENTI BC90, Posizione TL5 e Posizione suggerimenti di backup TL2 dal menu a discesa. Selezionare Colonna/e singola/e e digitare 1.
    3. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti aspirate nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del ciclo. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reagent Plate Position . Digitate il volume "Trypsin, Aspirate alla colonna 4 e alla riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    4. Fare clic sul passaggio Seleziona dispense suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo nel metodo all'interno del ciclo. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reaction Plate Position. Digitate il volume "Trypsin, Distribuisci in corrispondenza della colonna ) e della riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    5. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti Scarica nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, entro di che. Selezionare Scarica suggerimenti su TR1.
    6. Dopo la fine del ciclo If, fare clic sul passaggio Esegui procedura nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo nel metodo. Selezionare la procedura Incubatrice. Digitare HalfTime come nome variabile e 3600 come valore predefinito. Digitare NextTemp come nome variabile e 25 come valore predefinito. Digitare temp come Nome variabile e 43 come Valore predefinito.
    7. Fare clic sul passaggio InHECO Incubate nella barra degli strumenti in Integrazioni e trascinarlo sul metodo. Assicurarsi che il software INHECO Incubator sia installato. Digitare INHECO1 per l'uso del dispositivo in posizione, 1 per Incubazione per, 25 per C e 5 per c della temperatura di destinazione.
14. Impostazione dell'accodamento
    1. Fare clic sul passaggio Ciclo nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo, all'interno del passaggio Seleziona suggerimento. Digitare col come variabile , FirstColumn come Start, LastColumn come End e 1 come Increment.
    2. In Ciclo ,fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti di caricamento suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione dei liquidi e trascinarlo sul metodo . Selezionare Suggerimenti BC90, Posizione TL5 e Posizione suggerimenti di backup TL2 dal menu a discesa. Selezionare Colonna/e singola/e e digitare 1.
    3. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti aspirate nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del ciclo. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reagent Plate Position . Digitate il volume "Quench",Aspirate alla colonna 5 e alla riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    4. Fare clic sul passaggio Seleziona dispense suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del ciclo. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reaction Plate Position. Digitare il volume "Quench "Quench", Distribuisci in corrispondenza della colonna ) e della riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    5. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti scarica nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo , all'interno di Then. Selezionare Scarica suggerimenti su TR1.
    6. Dopo la fine del ciclo If the, fare clic sul passaggio Esegui procedura nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo . Selezionare la procedura orbitale.
    7. Fare clic sul passaggio Pausa nella barra degli strumenti in Configurazione e passaggi dispositivo e trascinarlo sul metodo. Mettere in pausa l'intero sistema per 1 s.
    8. Fare clic sul passaggio Pausa nella barra degli strumenti in Configurazione e passaggi dispositivo e trascinarlo sul metodo. Selezionare Sospendi l'intero sistema e visualizzare questo messaggio. Digitare il messaggio 'Continua dopo la centrifugazione'.
15. Impostazione della piastra per autocampionatore
    1. Fare clic sul passaggio Se nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo sul metodo, all'interno del passaggio Seleziona suggerimento. Digitare Autosampler come condizione.
    2. In Quindifare clic sul passaggio Ciclo nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo nel metodo . Digitare col come variabile , FirstColumn come Start, LastColumn come End e 1 come Increment.
    3. In Ciclo ,fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti di caricamento suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione dei liquidi e trascinarlo sul metodo . Selezionare BC230 Tips(BC230 Tips), TL6 Location (Posizione TL6) e TL2 backup Tips Location (Posizione dei suggerimenti di backup TL2) dal menu a discesa. Selezionare Colonna/e singola/e e digitare 1.
    4. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti aspirate nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del ciclo. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reagent Plate Position. Digitate il volume MobilePhase, Aspirate alla colonna 6 e alla riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    5. Fare clic sul passaggio Seleziona dispense suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del ciclo. Selezionare Bio_RadPCR96 Tipo di labista e Posizione piastra autocampione. Digitare il volume , MobilePhase, Dispense nella colonna , e nella riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    6. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti scarica nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo , all'interno di Then. Selezionare Scarica suggerimenti su TR1.
    7. Dopo la fine del ciclo If, fare clic sul passaggio Esegui procedura nella barra degli strumenti in Passaggi di controllo e trascinarlo nel metodo. Selezionare la routine TipCount.
    8. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti di caricamento suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo. Selezionare SUGGERIMENTI BC90, Posizione TL5 e Posizione suggerimenti di backup TL2 dal menu a discesa. Selezionare Colonne singole e digitare in Colonne di pin.
    9. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti aspirate nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo nel metodo all'interno del ciclo. Selezionare BCDeep96Round Labware Type e Reaction Plate Position. Digitare il volume , Aspirate,nella colonna "firstcolumn" e nella riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    10. Fare clic sul passaggio Seleziona dispense suggerimenti nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo, all'interno del ciclo. Selezionare Bio_RadPCR96 Tipo di labista e Posizione piastra autocampione. Digitate il volume MobilePhase, Dispense nella colonna "FirstColumn" e alla riga 1. Selezionare una tecnica ottimizzata dal menu a discesa della tecnica.
    11. Fare clic sul passaggio Seleziona suggerimenti scarica nella barra degli strumenti in Passaggi di gestione del liquido e trascinarlo sul metodo all'interno di Then. Selezionare Scarica suggerimenti su TR1. Il passaggio dei suggerimenti di selezione termina qui.
    12. Salvare e assegnare un nome al metodo.

2. Preparare campioni, labware e reagenti

1. Trasferire 5 l. di plasma umano sano in pool in un Polypropylene, 96-Round Deep Well Plate.
   NOTA: vedere Tabella dei materiali per i reagenti e i materiali utilizzati in questo protocollo. TPCK Treated Trypsin è stato acquistato e trypsin al rapporto substrato e il tempo di incubazione è stato ottimizzato specificamente. Se viene utilizzato un diverso grado di trypsin, come la trypsina ricombinante di grado di sequenza, l'enzima al rapporto substrato e il tempo di incubazione devono essere testati e ottimizzati.

3. Procedura operativa

1. Fare doppio clic sull'icona del software.
2. Nella scheda Metodo, selezionare Home tutti gli assi per orientare e preparare il gestore liquido automatizzato. Assicurarsi che tutte le siringhe della stazione di lavoro non contengano bolle d'aria visibili.
3. In File, selezionare Apri Metodo.
4. Selezionare il metodo (Figura 6).
5. Iniziare il metodo facendo clic sull'icona Di seguito a forma di triangolo verde.
6. Per preparare una piastra autosampler alla fine del metodo, immettere il valore 'true' nel prompt Immettere un valore da utilizzare per 'Autosampler' e quindi fare clic su OK. Se non viene preparata una piastra di campionamento automatico, immettere il valore 'false' e quindi fare clic su OK.
7. Immettere il valore '1' nel prompt Immettere un valore da utilizzare per 'firstcolumn' e quindi fare clic su OK.
8. Immettere il valore '12' nel prompt Immettere un valore da utilizzare per 'ultima colonna' e quindi fare clic su OK.
   NOTA: questo passaggio e 4.7 indicano alla stazione di lavoro di eseguire una digestione su 12 colonne di una piastra di 96 pozze, con conseguente utilizzo di tutti i pozze della piastra per la digestione
9. Se una piastra campione viene utilizzata con volumi campione di almeno 20 , immettere il valore 'true' nel prompt Immettere un valore da utilizzare per 'SamplePlate' e quindi fare clic su OK. Se non viene utilizzata una piastra di esempio, immettere il valore 'false' e quindi fare clic su OK.
   NOTA: Se non si utilizza una piastra campione, aggiungere 5 l. di campione ad ogni pozzetto corrispondente della piastra di reazione.
10. Seguire le istruzioni nella finestra Configurazione labware guidato e fare clic su Continua.
    NOTA: nella finestra successiva viene descritto il layout della "Piastra reagente" da preparare (Figura 7, Tabella supplementare 1). I seguenti volumi saranno suddivisi in ciascuno degli 8 pozze di una singola colonna nella piastra profonda 1 mL del 26:
    Colonna 1: 540 lofs of Reaction Mix 1.
    Colonna 2: 50 L di Cysteine Block.
    Colonna 3: 730 L di Reaction Mix 2.
    Colonna 4: 130 l di Trypsin.
    Colonna 5: 130 l di Quench Solution.
    Colonna 5: 1090 l di Mobile Phase Solution (se l'utente ha immesso 'true' nel passaggio 6).
11. Fare clic su Avanti e nella finestra seguente viene descritto il volume minimo (20 - L) che deve essere inserito nella piastra campione. Se l'utente ha immesso il valore 'false' per il prompt che coinvolge la piastra di campionamento (passaggio 9), all'utente verrà richiesto di aggiungere 5 campioni ll alla piastra di reazione.
12. Fare clic su Avanti.
    NOTA: La finestra successiva mostra che una casella di punta vuota da 90
13. Fare di nuovo clic su Avanti, che illustra il mazzo del gestore di liquidi automatizzato come specificato e illustrato (Figura 8) includendo la piastra di reagente, la piastra di reazione, la piastra di campionamento, la piastra Autocampionatoratrice, 6 caselle di punta complete da 90 l', una casella vuota di punta di 90 l e una casella di punta completa di 230.
14. Fare clic su Fine per iniziare il metodo.
    NOTA: dopo aver fatto clic su Fine, l'utente non può accedere al gestore automatico dei liquidi. Questo "romperà la cortina luminosa" della macchina e fermerà il gestore del liquido come precauzione di sicurezza.
15. Al prompt Continua dopo la centrifuga, recuperare la Piastra di Reazione e centrifugarla per 30 minuti a 3.000 giri/min.
16. Una volta completata la centrifugazione, riportare la Piastra di Reazione al gestore liquido automatizzato nella posizione in cui si trovava prima della centrifugazione e fare clic su Continua.
    NOTA: il gestore liquido automatico si arresterà nuovamente al termine del metodo. Se l'utente ha immesso "true" per il passaggio 6, la piastra Autosampler può essere rimossa dalla workstation e inserita nel campione automatico di uno strumento di cromatografia liquida per l'analisi.

4. LC-MSMS

1. Risolvere i peptidi su un HPLC ad alto flusso che comprende uno spettrometro di massa triplo quadruplo 2,1 mm x 100 mm, 3,5 m con una portata di 0,25 mL/min e analizzato in linea su uno spettrometro di massa triplo quadruplo.
   NOTA: dopo la digestione dei peptidi, il metodo LC-MSMS mirato per quantificare i peptidi da campioni robotici preparati è descritto nel dettaglio¹ dopo una breve descrizione di LC-MSMS.
2. Impostare la temperatura del forno della colonna a 40 gradi centigradi. Utilizzare il buffer A (2% ACN, 98% acqua, 0,1% acido formic) e il buffer B (95% ACN, 5% acqua, 0,1% acido formic) come due fasi mobili.
3. Equilibrate la colonna con 5% B per 5 minuti dopo il caricamento. Elute i peptidi oltre 30 minuti con un gradiente lineare dal 5% al 35% del buffer B.
   1. Riciclare la colonna prima di caricare il campione successivo lavando con 98% B per 10 minuti e poi 5% B per 5 minuti.
   2. Per la deviazione on-line, deviare l'eluente post-colonna sui rifiuti prima che entri nella sorgente iossiritale utilizzando una valvola di commutazione a due fasi.
4. Elaborare i dati di Gestione record di messaggistica.

Risultati

Il flusso di lavoro di preparazione automatizzato del campione di proteomica sulla workstation automatizzata è stato adattato dal nostro precedente protocollo automatizzato con un robusto metodo di acquisizione LC-SRM-MS¹ per l'albumina, la proteina plasmatica selezionata e la proteina esogena utilizzata per il controllo di qualità. Dopo l'elaborazione, i campioni sono stati eseguiti su un triplo quadrupolo LC-MS in un saggio SRM che prende di mira l'albumina del siero, la z-galactosidase. Il coefficiente di variazione (CV) del segnale SRM per ogni transizione è stato utilizzato per monitorare la riproducibilità del protocollo di digestione automatizzata.

Abbiamo automatizzato l'aggiunta del reagenti e la procedura di miscelazione per una digestione di 5 campioni di plasma con un'incubazione a prova di 2 ore su ponte. Per determinare la riproducibilità, 5 -L di una pozza di plasma sono stati pipettati in più pozzetti di una piastra di reazione con una testa multicanale (96 pin). Per monitorare la consistenza, abbiamo aggiunto la proteina z-gal prima delle reazioni di riduzione e alchilazione. Il flusso di lavoro automatizzato di preparazione del campione proteomico è stato testato con un robusto metodo di acquisizione LC-SRM-MS che include l'albumina, la proteina plasmatica più elevata, e la proteina z-gal, utilizzata per il controllo della qualità. Tre peptidi z-gal e due peptidi albumina sono stati monitorati da proteine trasformate di albumina al plasma e proteina a spillo(tabella 4).

Nel tentativo di risparmiare tempo e semplificare la procedura, abbiamo ridotto le fasi di trasferimento del liquido di aggiunta/miscelazione/incubazione della miscela di reagente e reazione con la workstation da un flusso di lavoro in nove fasi a un flusso di lavoro in sei fasi (Figura 1). Il flusso di lavoro proteomico totale è stato composto da due componenti sperimentali: la preparazione automatica dei campioni e LC-MS/MS. In primo luogo, abbiamo valutato la precisione dell'acquisizione dei dati LC-MS/MS SRM con otto iniezioni consecutive dallo stesso pozzo di digestione della piastra autocampionatore. La precisione del flusso di lavoro di preparazione automatica dei campioni è stata calcolata in base alla percentuale di coefficiente di varianza (%CV) del flusso di lavoro SRM proteomico totale meno%CV del Sistema LC-MS/MS (Figura 9B). Con la procedura di digestione del plasma semplificata sulla postazione di lavoro automatizzata, la precisione sperimentale della preparazione automatica dei campioni era inferiore all'11,4% per le proteine esogene di z-gal (10,0% come media), e meno del 14,9% per l'albumina di siero umano più abbondante (9,9% in media) (Figura 9). Sono state osservate buone intensità di segnale sia per l'albumina del siero umano che per le proteine z-gal come previsto (Figura 9C).

Per ogni fase di pipettaggio e trasferimento di liquidi, le tecniche sono state specificamente ottimizzate. Per monitorare la precisione dei passi di trasferimento di liquidi, abbiamo aumentato gli standard di peptide con etichetta isotopi stabili (SIL) per la proteina endogena della proteina endogena di siero in siero umano e la proteina esogena-gal in tre fasi di trasferimento reagenti indipendenti: Reaction Mix 1, Cysteine Blocker e Reaction Mix 2 (Figura 10). I segnali MRM provenienti da questi cinque peptidi SIL sono stati acquisiti per monitorare la precisione delle fasi di trasferimento automatico dei liquidi. La media di %CV per i peptidi, DDNPNLPR, e GDFQFNISR (il valore rappresenta l'amminoacido etichettato N15) da Reaction Mix 1 passo variava dall'1,8% all'11,2%. La media %CV di un peptide (IDPNAWVER) del passo di Cysteine Blocker variava dal 6,6 all'8,8%. La media di due peptidi (WVGYGQDSR e LVNEVTEFAK) variava dal 6,2% all'11,9% (Figura 10).

Per convalidare il flusso di lavoro automatizzato di preparazione del campione di proteomica, abbiamo valutato la riproducibilità tra più proteine e più giorni per l'albumina del siero umano, l'esogeno z-gal e 40 proteine plasmatiche aggiuntive. Abbiamo elaborato 21 campioni di replica (plasma umano normale in pool), ben posizione mostrato Figura 11A, in tre giorni diversi. I CV intra-day sono stati calcolati su 21 pozzi preparati nello stesso giorno. La media intra-day %CV per 40 proteine variava dal 4% al 20% (Figura 11B). Per valutare l'effetto bordo del flusso di lavoro automatizzato basato su piastre, %CV è stato calcolato da pozzi specifici all'interno di colonne e righe designate(Figura 12A per la mappa di colonne e righe). L'intensità dei segnali MRM era simile in tutte le configurazioni di colonne e righe, con %CV che andava dal 3% al 22% (Figura 12B).

In sintesi, il flusso di lavoro automatizzato ottimizzato produce 96 campioni elaborati uniformemente in meno di cinque ore con un'eccellente precisione sperimentale. Per la compatibilità con un flusso di lavoro automatizzato, abbiamo selezionato reagenti con reazioni laterali non specifiche trascurabili, sono stabili nella luce ambientale, sono compatibili con LC-MS/MS e possono essere conservati come aliquote congelate.

Figura 1: Schema del flusso di lavoro di preparazione di esempio. Sono elencate le 6 principali fasi di trasferimento dei liquidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Script di caricamento suggerimento. I dettagli dello script VB sono riportati qui. Lo script specifica le condizioni di caricamento dei suggerimenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Layout del deck della workstation automatizzata. Il ponte è composto da ALPI 1x1, ALP tip Loading, Cestino, Lavaggio tip, Peltier e un incubatore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Proprietà della piastra reagente. Le proprietà visualizzate sono necessarie per il labware Reagent Plate quando vi si accede tramite l'installazione di Guided Labware. Selezionare la colonna corrispondente e digitare le variabili come indicato nella figura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Script di conteggio dei suggerimenti. Questo script aiuta a tenere traccia del numero di suggerimenti sul mazzo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Panoramica del metodo per la digestione e l'installazione di campioni di plasma. Passaggi per i calcoli dei reagenti, la configurazione dei labware e le manipolazioni di liquidi nel metodo del gestore liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Layout della piastra reagente. Sono mostrati i reagenti chimici necessari per la digestione del plasma e la preparazione dell'autocampione e distribuiti attraverso il labware della piastra reagente. Questa cifra è stata modificata da una nota tecnica¹⁰. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Layout per il labware sul ponte della workstation automatizzata. Mostrato è il layout del ponte per il metodo di digestione del plasma per il gestore del liquido. Questa cifra è stata modificata da una nota tecnica¹⁰. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: La precisione del flusso di lavoro proteomico totale è costituita da CV workstation e LC MS/MS CV mirati.
Sono stati monitorati cinque peptidi provenienti da z-gal e albumina, sono stati mostrati i cromatogrammi e il tempo di ritenzione dei peptidi per ogni peptide(A), Precision è stata determinata da 30 pozzi / campioni esperimento rappresentativo di elaborazione, CV% per il flusso di lavoro proteomico totale, l'analisi LC MS/MS e l'elaborazione automatica dei campioni sono stati calcolati (B). Nel complesso, i peptidi digeriti hanno mostrato buoni segnali variavano da 1x10⁵ fino a 1x10⁸. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Determinazione della precisione per le fasi di trasferimento dei liquidi. I peptidi sintetici sono stati a spillo in reagenti specifici e il trasferimento automatico di liquidi è stato determinato dal totale%CV. Da 30 pozzi/campioni esperimento meno% CV LC MSMS (determinato da 8 ripetizioni iniezioni di LC MSMS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: Riproducibilità di più giorni del flusso di lavoro automatizzato di preparazione dei campioni proteomici con 42 analisi MRM proteiche. (A) La mappa delle piastre di reazione per ciascuno dei tre giorni è in mostra qui, è stato aggiunto il plasma 5 a 1l a ciascuno dei 21 pozzi. 3 pozzi ricevuti 5 ul di acqua sono stati utilizzati come controlli negativi / vuoti. (B) L'intensità media di 190 transizioni comprende 75 peptidi e 42 proteine (a sinistra) e %CV per ogni transizione MRM è stata calcolata dalla digestione di 21 pozzi per ogni giorno (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 12: Riproducibilità di posizioni specifiche di pozzi (posizione di colonne e righe). (A) La posizione delle colonne e delle righe con una mappa di lamiera sono mostrate qui. (B) Posizione di colonna e riga specifica dei segnali MRM specifici di intensità medie da pozzi specificati (a sinistra) e cv% (a destra) da una digestione a piastra singola. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 13: Cattura di schermata dell'editor di tecniche. Per ogni modello di pipettatura, definire le proprietà del rilevamento del livello del liquido, rilevamento del lotto, Piercing, tipo di liquido, generale, aspirato, dispense, mix e calibrazione. Il modello e le tecniche utilizzati in questo protocollo sono riportati nella Tabella supplementare 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Variabile	Variabile	Valore	Descrizione
Autosampler	Boolean	Vero	Usare autosampler
Betagala	Intero	5	Volume Betagal
BG1 (in questo stato del sistema)	Intero	0.8	Volume BG1
BG2 (in questo	Intero	0.8	Volume BG2
BG3 (in questo modo)	Intero	0.8	Volume BG3
CysteinBlocker	Intero	1.25	Volume blocco Cysteine
CysteineBuffer	Intero	0.45	Volume buffer Cysteine
Denaturante	Intero	5	Volume denaturante
DigestTransfer	Intero	10	Volume di trasferimento del digest
Primo buffer	Intero	25.9	Volume del primo buffer
Prima colonna	Intero	1	Prima colonna
HSA1	Intero	0.8	Volume HSA1
HSA2	Intero	0.8	Volume HSA2
lastcolumn	Intero	12	Ultima colonna
MobileFase	Intero	90	Volume fase mobile
Placare	Intero	10	Colonna Quench
ReducingAgent	Intero	5	Riduzione della colonna dell'agente
Esempio	Intero	5	Colonna di esempio
SamplePlate (Piatta campionato)	Boolean	Vero	Utilizzare la piastra campione
SecondBuffer (Buffer)	Intero	58.4	Volume del secondo buffer
Tripsina	Intero	10	Colonna Trypsin

Tabella 1: Variabili del passaggio iniziale

Valore	Variabile
-FirstBuffer- Denaturant, ReducingAgent, Betagal, BG1, HSA1	FirstMix
-CysteineBlocker,CysteineBuffer, BG2	CysteineMix
	SecondMix (in mix)
(FirstMix, Colonne)	FirstMixWell
(CysteineMix)Colonne)	CisteineBene
(SecondMix, Colonne)	SecondMixWell
( Colonne (Trypsin)	TrypsinWell
(Quench: Colonne) - 10	QuenchBene
(FirstMixWell) , 8 , 100	FirstMixStock
CisteinePozzo 8 x 20	CysteineMixStock
(SecondoMixWell 8) , 100	SecondMixStock

Tabella 2: Variabili di combinazione di volumi

digitare	Nome	Posizione	Profondità	Proprietà	Utilizzare?
BCDeep96Round (a0)	Piastra reagente	P5 (in via in stato di	1(in alto)	#	: non SamplePlate
BCDeep96Round (a0)	Piastra reagente	P5 (in via in stato di	1(in alto)	#	- SamplePlate (Piatta Campionata)
BCDeep96Round (a0)	Piastra di reazione	P11 (in via p.	1(in alto)		Vero
Bio_RadPCR96	Campioni	P9 (in via in e	1(in alto)		- SamplePlate (Piatta Campionata)
Bio_RadPCR96	Piastra Autosampler	P10 (in via p10)	1(in alto)		- Autocampionatore
BC90 (informazioni in due)	Vuoto		1(in alto)		Vero
BC90 (informazioni in due)			1(in alto)		Vero
BC90 (informazioni in due)			1(in alto)		Vero
BC230 (inn: BC230)			1(in alto)		- Autocampionatore
BC90 (informazioni in due)			1(in alto)		Colonne>1
BC90 (informazioni in due)			1(in alto)		Colonne>3
BC90 (informazioni in due)			1(in alto)		Colonne>5
BC90 (informazioni in due)			1(in alto)		Colonne>7
BC90 (informazioni in due)			1(in alto)		Colonne>9
Nota: : Corrisponde alla piastra Bio-Rad ben 96. : fare clic su proprietà e quindi immettere le variabili di volume come indicato nella Figura 6.

Tabella 3: Impostazione della configurazione guidata

Proteina ID	Sequenza di peptide	Q1 Massa (Da)	Q3 Massa (Da)	Tempo (min)	Ione di Frammento	Potenziale di declustering	Energia da collisione	Potenziale uscita cella di collisione
sp P00722 BGAL_ELOCI	GDFQFNISR	542.3	262.1	19.7	2anni2 2anni2	61	21	8
		542.3	636	19.7	2anni5 USD	61	25	12
		542.3	764.2	19.7	2anni6 USD6	61	25	18
	IDPNAWVER	550.3	436.1	18.1	2anni7,2 USD	61	23	8
		550.3	871.2	18.1	2anni7 USD7	61	25	18
		550.3	774.2	18.1	2anni6 USD6	61	33	8
	WVGYGQDSR	534.3	782.1	12.1	2anni7 USD7	51	25	6
		534.3	562.1	12.1	2anni5 USD	51	27	6
		534.2	505.2	12.1	2anni4 4 USD	90	25	8
sp P02768 ALBU_HUMAN	DDNPNLPR	470.8	596.2	9.2	2anni5 USD	61	27	16
		470.8	499.3	9.2	2anni4 4 USD	61	27	18
		470.8	710.4	9.2	2anni6 USD6	61	27	18
	LVNEVTEFAFaK	575.3	694.4	18.2	2anni6 USD6	73.1	29.6	18
		575.3	937.5	18.2	2anni8 USD8	73.1	29.6	18
		575.3	823.4	18.2	2anni7 USD7	73.1	29.6	18

Tabella 4: Parametri di Gestione record di messaggistica

Tabella supplementare 1: Piastra reagente Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 2: modello di protocollo Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussione

La lavorazione dei campioni per la spettrometria di massa richiede la denaturazione, la riduzione e l'alchilazione delle proteine per bloccare i cistein, e la digestione della metapsina per fendere le proteine nei peptidi. Ogni reazione chimica o ezimatica deve essere avviata in un momento designato ed eseguita a una temperatura controllata, e ogni fase del processo comporta più fasi di trasferimento di liquidi in cui può essere introdotta la variazione sperimentale. L'elaborazione automatizzata dei campioni fornisce una soluzione a questo dilemma. I sistemi di movimentazione dei liquidi attualmente disponibili hanno la capacità di trasferire i reagenti in piastre di 96 pozze con una precisione inferiore al 5%, a seconda della testa e del tipo di punta utilizzata, e di incubare i campioni, con agitazione se lo si desidera, a temperature controllate che vanno dai 14 ai 70 gradi centigradi. Abbiamo usato un gestore liquido automatizzato per elaborare il plasma per i saggi SRM in un formato di 96 pozze.

Ci sono molte migliaia di siti di scissione proteasi all'interno delle complesse miscele di proteine nel siero, nel plasma e in altri campioni biologici; e ognuna di queste proteine ha proprietà uniche che influenzano l'accessibilità del sito di scissione e la stabilità dei peptidi risultanti. È quindi impossibile progettare una procedura di elaborazione del campione ottimale per ogni proteina. L'alternativa migliore è quella di essere il più coerente possibile.

Per ottenere la coerenza, abbiamo ottimizzato ogni passo di pipettaggio eseguito dal gestore automatico del liquido. In primo luogo abbiamo considerato il volume richiesto e i vincoli imposti dal tipo di liquido (plasma, acquoso o organico) e dalle proprietà corrispondenti (viscosità, coesione e volatilità), hardware (testa di tubi di linea e bracci di cattura delle lastre) e labware. Abbiamo quindi variato la velocità e l'indagatore per l'aspirazione, la velocità e il volume di esplosione per l'erogazione, e la forza e la durata della miscelazione, incorporando un tocco di punta dopo l'aspirazione e/o l'erogazione, se necessario, per eliminare il liquido aderente all'esterno delle punte (Figura 13, Tabella supplementare 1). Un peptide SIL unico, pre-schermato per la stabilità, è stato a spillo in ogni reagente per rendere possibile monitorare la precisione di ogni fase di movimentazione dei liquidi. Dopo l'ottimizzazione, i CV di processo per la maggior parte delle transizioni erano inferiori al 10%, dimostrando una buona riproducibilità con la workstation automatizzata (Figura 9, Figura 10, Figura 11 e Figura 12).

Il flusso di lavoro automatizzato presentato qui fornisce una digestione ezimatica coerente con una migliore riproducibilità e velocità effettiva rispetto ai metodi manuali (Figura 9, Figura 10). Questo approccio promette di migliorare l'accuratezza e l'affidabilità della scoperta e della convalida dei biomarcatori mediante spettrometria di massa.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Un pool di plasma umano sano	Bioreclamation Inc.		plasma umano testato nel manoscritto
Acetonitrile, HPLC Grade	Thermo Fisher Scientific	A998SK1	LC MS/MS solvente
B-Galattosidasi Ricombinante da E.Coli	Sigma-Aldrich	G3153-5MG	proteine di controllo esogene.
Stazione di lavoro automatizzata Biomek i7	Beckman Coulter, Inc.		La stazione di lavoro per la preparazione dei campioni proteomici: le stazioni di lavoro automatizzate Biomek non sono destinate o convalidate per l'uso nella diagnosi di malattie o altre condizioni
Suggerimenti Biomek i-Series 230µ L Non sterile	Beckman Coulter, Inc.	B85903	Suggerimenti, consumabile i7
Punte Biomek i-Series 90µ L Non sterile	Beckman Coulter, Inc.	B85881	Suggerimenti, consumabile i7
FG, Kit Tripsina TPCK	Sciex	4445250	Tripsina utilizzata nella digestione
Piastre PCR a 96 pozzetti, a basso profilo, parete sottile, bordate, verdi/trasparenti	Bio-Rad	#hsp9641	Piastra per autocampionatore
Octyl B-D-Glucopyranoside	Sigma-Aldrich	O9882-5G	detergente utilizzato nella digestione
Polipropilene, piastre a pozzetti profondi a 96 rotonde sterili	Beckman Coulter, Inc.	267007	Reagenti e piastra di digestione
Prominence UFLCXR Sistema HPLC	Shimadzu, Giappone		Sistema LC ad alto flusso
QTRAP 6500	SCIEX		Spettrometro di massa
Acqua, grado HPLC Thermo	Fisher Scientific	W54	LC Solvente MS/MS
Xbridge BEH30 C18 2,1 mm x 100 mm	Waters	186003564	colonna LC MSMS