Articolo metodologico

Indurre e caratterizzare la vesapica steatosi nelle celle HepaRG differenziate

DOI:

10.3791/59843

⸱

18 luglio 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, Sapienza University, 2Department of Internal Medicine - DMISM, Sapienza University, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia, 4Pasteur Institute Italy-Fondazione Cenci Bolognetti, 5INSERM U1052-Cancer Research Center of Lyon, 6Department of Hepatology, Croix Rousse Hospital, Hospices Civils de Lyon

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, descriviamo un protocollo dettagliato per indurre la steatosi vescicolare del fegato in cellule HepaRG differenziate con l'oleate di sodio acido grasso e impieghiamo metodi per il rilevamento e la quantificazione dell'accumulo di lipidi, compresi gli anti-Stokes coerenti Microscopia a dispersione Raman (CARS), analisi citofluorimetrica, colorazione Oo rosso olio e qPCR.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La steatosi epatica rappresenta una disfunzione metabolica che deriva da un accumulo di goccioline di lipidi trigliceridi contenenti epatociti. L'eccessivo accumulo di grasso porta alla malattia del fegato grasso non alcolico (NAFLD), che è potenzialmente reversibile e può evolvere in steatoepatite analcolica (NASH) e infine cirrosi e carcinoma epatocellulare (HCC). I meccanismi molecolari che collegano l'accumulo di lipidi negli epatociti con la progressione alla NASH, danni epatici irreversibili, fibrosi, cirrosi, e anche HCC rimane ancora poco chiaro. A tal fine, sono stati sviluppati diversi modelli in vitro e in vivo per chiarire i processi patologici che causano NAFLD. Nel presente studio, descriviamo un modello cellulare per l'induzione della steatosi vescicolare del fegato che consiste di cellule Epatiche Epatiche Epatiche EpaRG epatiche differenziate d'AmSO trattate con l'acido grasso sale oleume di sodio. Infatti, le cellule HepaRG trattate con oleato di sodio accumulano goccioline lipidiche nel citoplasma e mostrano caratteristiche tipiche della steatosi. Questo modello umano in vitro rappresenta una valida alternativa ai modelli di topi in vivo e ai primari epediti umani. Presentiamo anche un confronto di diversi metodi per la quantificazione e la valutazione dell'accumulo di grasso nelle cellule HepaRG, tra cui la colorazione ORossa dell'olio, la misurazione citofluorimetrica del Bodipy, l'analisi metabolica dell'espressione genica da parte di qPCR e anti-Stokes coerenti microscopia a dispersione Raman (CARS). L'imaging CARS combina la specificità chimica della spettroscopia Raman, una tecnica di analisi chimica nota nelle applicazioni scientifiche dei materiali, con i vantaggi delle microscopie ottiche non lineari ad alta velocità e ad alta risoluzione per consentire quantificazione dell'accumulo di lipidi e della dinamica delle goccioline lipidiche. L'istituzione di un efficiente modello in vitro per l'induzione della steatosi vescicolare, insieme a un metodo accurato per la quantificazione e la caratterizzazione dell'accumulo di lipidi, potrebbe portare allo sviluppo di una diagnosi in fase iniziale di NAFLD tramite il l'identificazione dei marcatori molecolari e la generazione di nuove strategie di trattamento.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La steatosi epatica è definita come accumulo di grasso intraepatico, all'interno di goccioline di lipidi contenenti trigliceridi, di almeno il 5% del peso del fegato. L'immagazzinamento prolungato di lipidi epatici è un processo potenzialmente reversibile, tuttavia, può portare a disfunzione metabolica del fegato epatico, infiammazione e forme avanzate di malattia epatica grassa non alcolica (NAFLD), la causa predominante della malattia cronica del fegato in molte parti il mondo1,2. NAFLD è una malattia multifattoriale che può evolvere verso la steatoepatite non alcolica più aggressiva (NASH), che a sua volta può progredire in cirrosi e, in una piccola percentuale di pazienti, al carcinoma epatocellulare (HCC)1,3. Nessuna terapia approvata è attualmente disponibile come trattamento specifico per NAFLD e la combinazione di modifiche di dieta e stile di vita rimane il pilastro della gestione NAFLD e NASH4,5,6.

I meccanismi molecolari che portano allo sviluppo della steatosi epatica nella patogenesi del NAFLD rimangono ancora da chiarire7. In questo contesto, sono stati sviluppati modelli murini per studiare la progressione della malattia da steatosi umana. Esiste una miriade di modelli diversi, ognuno dei quali ha i suoi vantaggi e svantaggi, compresi i modelli genetici, nutrizionali e indotti chimicamente che combinano approcci diversi. I topi geneticamente modificati (transgenici o knockout) sviluppano spontaneamente malattie epatiche. Tuttavia, va notato che queste mutazioni sono molto rare nell'uomo e la delezione o sovraespressione di un singolo gene (ad esempio, topo ob/ob) non può imitare l'eziologia della malattia umana multifattoriale al livello molecolare8,9. Allo stesso modo, la malattia acquisita dai topi dopo la manipolazione dietetica o farmacologica non può imitare gli effetti delle diete umane associate allo sviluppo di NAFLD nell'uomo8. I modelli animali, tuttavia, hanno facilitato gli sviluppi nella comprensione del NAFLD e questo approccio è attualmente la strategia attualmente più utilizzata nella ricerca di laboratorio. Tuttavia, la replicazione negli esseri umani dei risultati ottenuti in modelli animali ha ripetutamente fallito, causando una cattiva traduzione nella clinica10.

Pertanto, i modelli in vitro di NAFLD possono svolgere un ruolo fondamentale nel chiarire i meccanismi molecolari della progressione NAFLD e rappresentano uno strumento prezioso per vagliare un gran numero di composti. Colture cellulari primarie, linee cellulari immortalate e biopsie epatiche sono state ampiamente utilizzate per scopi di ricerca11. Gli epatociti umani primari assomigliano molto alle condizioni cliniche umane, ma c'è un numero limitato di donatori, e le colture cellulari primarie mostrano scarsa riproducibilità a causa della variabilità delle cellule. Queste osservazioni, insieme a questioni etiche e logistiche, hanno portato all'uso di equali primari umani limitati12. Così, le linee cellulari epatiche rappresentano una comoda alternativa, avendo diversi vantaggi essenziali rispetto alla cultura primaria, poiché le linee cellulari epatiche crescono costantemente, hanno una durata di vita quasi illimitata e hanno un fenotipo stabile. Inoltre, le linee cellulari sono facilmente accessibili e le condizioni di coltura delle linee cellulari epatiche sono più semplici di quelle degli epediti primari e sono standardizzate tra diversi laboratori.

Qui, descriviamo in dettaglio un modello in vitro basato sulle cellule di steatosi epatica, rappresentato da cellule HepaRG differenziate epatiche trattate con l'oleato di sodio acido grasso. La linea cellulare HepaRG è stata stabilita da una paziente donna affetto da infezione da epatite C e da un tumore al fegato di Edmondson di grado I ben differenziato14. La linea cellulare HepaRG è una linea cellulare del progenitore biformicello umana in grado di differenziare l'esposizione al 2% di solforo dimetilo (DMSO) verso due diversi fenotipi cellulari: cellule biliari ed epatocitiche. Le cellule HepaRG differenziate (dHepaRG) condividono alcune caratteristiche e proprietà con gli epatociti adulti e possiedono la capacità di esprimere stabilmente geni specifici del fegato come Albumin, AldolaseB, Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) e Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4)13 (passaggio 3). Il trattamento delle cellule dHepaRG con l'acido grasso sale sodio oleate (250 m) per 5 giorni porta alla generazione di goccioline lipidici citoplasmiche, imitando gli effetti del fegato grasso14,15,17,18 ( al punto 4). L'accumulo di goccioline lipidiche può essere facilmente rilevato dalla colorazione Oil Red O (fase 5), un colorante liposocroso solubile che macchia trigliceridi neutri e lipidi rosso-arancione. Per quantificare in modo efficiente i lipidi nel dHepaRG grasso, qui illustriamo l'analisi citofluorimetrica dopo la colorazione con 4,4-difluoro-1,3,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (Bodipy 505/515) (passaggio 6), un lipofilificante locale ai corpi lipidici intracellulari ed è stato utilizzato per etichettare le goccioline di lipidi19. Inoltre, qui mostriamo come valutare la steatosi mediante reazione quantitativa della catena di polimerasi (qPCR) (passaggio 7) la deregolazione dell'espressione genica di diversi geni metabolici nelle cellule dHepaRG. Per caratterizzare ulteriormente e quantificare l'accumulo di goccioline di lipidi dopo il trattamento dell'oleate di sodio, abbiamo eseguito una microscopia coerente anti-Stokes Raman scattering (CARS) (fase 8), una tecnica innovativa che consente la visualizzazione e la quantificazione goccioline lipidiche senza etichettare20,21.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione dei mezzi di coltura e dei reagenti

  1. Mezzo proliferante: supplemento E medio di William con GlutaMAX, 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina / streptomicina, 5 g / mL di insulina e 0,5M di idrocortisone emisuccinato.
  2. Mezzi di differenziazione: supplemento E medio di William con GlutaMAX, 10% FBS, 1% penicillina / streptomicina, 5 g / mL di insulina, 50 emisuccinato idrocortisone M e 2% DMSO.
  3. Mezzo di congelamento: integrare il mezzo proliferante con 10% DMSO.
  4. Oleate di sodio: sciogliere nel 99% metanolo a una concentrazione di 100 mM, mescolare O/N, e conservare a -20 gradi centigradi.
  5. Petrolio Red O: preparare una soluzione stock. Pesare 0,35 g di Olio Rosso O e sciogliere in 100 mL di isopropanol. Mescolare O/N, filtrare (0,2 m) e conservare presso RT. Preparare una soluzione funzionante: mescolare 6 mL di soluzione O Stock di olio con 4 mL di ddH2O. Lasciare seduto a temperatura ambiente (RT) per 20 min, quindi filtrare con un filtro di 0,2 m. Una corretta filtrazione è altamente raccomandato per una colorazione di successo per evitare lo sfondo.
  6. Bodipy (505/515): dissolvere bodipy (505/515) colorante in DMSO ad una concentrazione di 100 m di stock, conservare a -20 gradi centigradi al buio, e utilizzare ad una concentrazione finale di 100 nM.
  7. Acquisire piatti trasparenti con fondo in vetro per esperimenti CARS.

2. Scongelamento, amplificazione e crioconservazione delle cellule HepaRG

  1. Scongelare le cellule HepaRG crioconservate di azoto immergendo un lotto in un bagno di 37 gradi centigradi fino a quando non viene scongelato. Selezionare un batch di passaggio basso (<20). Le cellule HepaRG sono disponibili in commercio.
  2. Trasferire rapidamente le cellule in un tubo da 15 mL contenente 10 mL di mezzo proliferante e centrifugare per 5 min (200 xg, 4 gradi centigradi).
  3. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule con 5 mL di mezzo proliferante.
  4. Contare le celle e diluire in modo da piastra 2,5 x 104 cellule / cm2.
  5. Rinnovare il supporto ogni 2 o 3 giorni. Le cellule proliferano con un tempo di raddoppio di circa 24 ore.
  6. Staccare le cellule HepaRG quando a 80% confluenza da 3-5 min incubazione con soluzione trypsin 0.05%. Raccogliere le cellule nel mezzo proliferare e centrifugare per 5 min (200 x g, 4 gradi centigradi).
  7. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule con 5 mL di mezzo proliferante.
  8. Contare le celle e diluire in modo da piastra 2,5 x 104 cellule / cm2.
  9. In questa fase, amplificare le cellule ripetendo i passaggi 2.5-2.8 per raggiungere un numero appropriato di cellule per avviare esperimenti, o crioconservare come nel passaggio 2.10.
  10. Per crioconservare le cellule HepaRG, staccare le cellule 24 h dopo la placcatura di 3-5 min incubazione con soluzione trypsin 0.05%. Raccogliere le cellule nel mezzo proliferare e centrifugare per 5 min (200 x g, 4 gradi centigradi). Scartare il supernatante, riutilizzare le cellule in 1 mL/lotto di mezzo di congelamento, 1,5 x 106 cellule/lotto e crioconservare i lotti in azoto liquido.

3. Differenziazione delle celle HepaRG (giorno 0–21) (Figura1A)

  1. Giorno 0. Seme cellule HepaRG a bassa densità (2,5 x 104 cellule/cm2) in piatti trattati in coltura con volume appropriato di mezzo di proliferazione (Figura 1B). Due piatti devono essere placcati per ogni saggio (colorazione Oil Red O, analisi FACS, qPCR): uno per le cellule di controllo e uno per le cellule trattate con oleati. Se si eseguono misurazioni CARS (passaggio 8), semina le celle in parallelo in piatti trasparenti con fondo in vetro. Come controllo, raccogliere un piatto non trattato (cellule proliferanti Giorno 0) per eseguire l'analisi dell'espressione genica dei geni dei marcatori di differenziazione (vedere il passaggio 3.6).
  2. Giorno 2 e Giorno 4. Cambiare il mezzo con il volume appropriato di mezzo di proliferazione e lasciare che le cellule crescono fino alla confluenza.
  3. Giorno 7. Le celle devono avere un confluente al 100% (Figura 1C). Lavare le cellule una volta con 1x salina tampone fosfato (PBS). Rimuovere 1x PBS e aggiungere un volume appropriato di supporto di differenziazione.
  4. Giorno 8, 9, 12, 15, 18.  Lavare le cellule una volta con 1x PBS. Rimuovere 1x PBS e aggiungere un volume appropriato di supporto di differenziazione.
  5. Giorno 21. Osservare le cellule HepaRG al microscopio e assicurarsi che le cellule siano colture differenziate confluente (Figura 1D).
  6. Come controllo, raccogliere una parabola di controllo (cellule differenziate Giorno 21) per eseguire l'analisi dell'espressione genica (passaggio 7) dei geni dei marcatori di differenziazione (Figura 1E).
  7. Al giorno 21, le cellule HepaRG differenziate possono essere crioconservate in azoto liquido.

4. Induzione della steatosi vescicolare (giorno 21–26)

  1. Giorno 21. Oleate disuso di sodio (100 mM) con un volume appropriato di supporto di differenziazione completo ad una concentrazione finale di 250 m (1:400). Aggiungere il 99% di metanolo 1:400 (stesso volume di quello dell'oleate di sodio) in un'altra aliquota di supporto di differenziazione per effettuare il trattamento di controllo del veicolo. (Ad esempio: aggiungere 25 lofo di oleate di sodio a 10 mL di media e in parallelo aggiungere 25 - L del 99% di metanolo a 10 mL di mezzo). Lavare le cellule una volta con 1x PBS e aggiungere veicolo o mezzo di oleate di sodio.
  2. Giorno 23 e giorno 25. Cambiare il supporto con il volume appropriato di mezzo appena preparato come nel punto 4.1.
  3. Giorno 26. Osservare al microscopio ottico che le goccioline lipidiche si accumulano nelle cellule trattate con oleate di sodio e sono facilmente visibili come goccioline traslucide nel citoplasma come nella Figura 2A.

5. Valutazione del sovraccarico lipidico e dell'induzione della steatosi: colorazione dell'olio Rosso O

  1. Lavare le cellule una volta con 1x PBS e rimuovere completamente 1x PBS.
  2. Aggiungere il 4% di paraformaldeide (diluito in 1x PBS) e incubare per 15 min a RT.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica, quindi questo passaggio deve essere eseguito in un cofano di fumi, con attrezzature protettive, tra cui guanti, un camice da laboratorio e una maschera.
  3. Rimuovere la paraformaldeide e lavare le cellule due volte con 1x PBS. Le cellule possono essere conservate in 1x PBS a 4 gradi centigradi per un paio di giorni prima di colorare. Avvolgere con parafilm e coprire con un foglio di alluminio per evitare che le cellule si asciughino.
  4. Rimuovere 1x PBS. Incubare le cellule con il 60% isopropanolo per 5 min a RT.
  5. Rimuovere l'isopropanolo e lasciare asciugare completamente le cellule a RT.
  6. Aggiungere la soluzione di lavoro Oil Red O e incubare a RT per 30 min. Il volume della soluzione di lavoro richiesta per ogni campione corrisponde al volume dei supporti utilizzati per la coltura delle cellule.
  7. Rimuovere la soluzione Oil Red O e aggiungere immediatamente ddH2O. Lavare le cellule 4 volte con ddH2O.
  8. Acquisire immagini al microscopio per l'analisi (Figura 2B).
  9. Per eluire il tinrio Olio Red O: togliere tutta l'acqua e lasciare asciugare; aggiungere 1 mL di isopropanolo 100% e incubare per 10 min con agitazione delicata a RT.
  10. Pipet l'isopropanol con olio eluito olio red O dye su e giù più volte, assicurando che tutto l'Olio Rosso O è nella soluzione. Trasferire la soluzione in una cuvette. Misurare oD500 nm per spettrofotometria e utilizzare 100% isopropanol come vuoto (Figura 2C).

6. Valutazione del sovraccarico dei lipidi e dell'induzione della steatosi: colorazione bodipy e analisi citofluorimetrica

  1. Lavare le cellule una volta con 1x PBS. Incubare con 100 nM di Bodipy diluito in 1x PBS al buio per 40 min a 37 gradi centigradi. Un controllo non macchiato deve essere incluso nelle misurazioni della citometria di flusso. Da questo punto, proteggere i campioni dalla luce il più possibile.
    NOT: Il volume della soluzione di colorazione necessaria per ogni campione corrisponde al volume dei supporti utilizzati per le cellule di coltura.
  2. Rimuovere la soluzione di colorazione e lavare le cellule una volta con 1x PBS. Procedere ai passaggi 6.3-6.6. per l'analisi FACS (Fluorescence-activated cell sorting) o per il passaggio 6.7 per la imaging al microscopio.
  3. Raschiare delicatamente le cellule con 1x PBS e trasferirle in un tubo da 15 mL. Centrifuga per 10 min (200 x g,4 gradi centigradi).
  4. Rimuovere delicatamente i supernatanti senza disturbare i pellet e lavare con 3 mL di 1x PBS. Centrifuga per 5 min (200 xg, 4 gradi centigradi).
  5. Rimuovere i supernatanti e risospendere in 300 gradi l di 1x PBS, quindi trasferire in un tubo FACS.
  6. Misurare immediatamente l'intensità della fluorescenza bodipy mediante analisi citofluorimetrica con lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 505/515 nm (Figura 3A,B).
  7. Lavare le cellule una volta con 1x PBS e rimuovere completamente PBS.
  8. Aggiungere il 4% di paraformaldeide (diluito in 1x PBS) e incubare per 15 min a RT.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica, quindi questo passaggio deve essere eseguito in un cofano di fumi, con attrezzature protettive, tra cui guanti, un camice da laboratorio e una maschera.
  9. Rimuovere la paraformaldeide e lavare i campioni 3x per 5 min in PBS. Le celle possono essere conservate in 1x PBS a 4 gradi centigradi o immagini immediatamente (Figura 3C). Per lo stoccaggio, avvolgere con parafilm e coprire con un foglio di alluminio per evitare che le cellule si allineino.

7. Valutazione del sovraccarico di lipidi e dell'induzione della steatosi: qPCR

  1. Lavare le cellule una volta con 1x PBS. Raschiare le cellule con 1x PBS, centrifugare a 200 x g, e scartare il supernatante. A questo punto, le cellule possono essere raccolte a -80 gradi centigradi o lavorate come nel passaggio 7.2.
  2. Eseguire l'isolamento totale dell'RNA con metodi standard utilizzando reagenti commerciali seguendo le istruzioni del produttore.
  3. Valutare la concentrazione di RNA mediante misurazione spettrofotometrica UV, assicurando che la purezza dell'RNA sia elevata (vicino a 2,0) in base alla lettura A260/A280.
  4. Sintetizza cDNA da 1 g di RNA totale con un kit di sintesi cDNA standard.
  5. Diluire il cDNA fino a un volume finale di 50 gradi con H2O.
  6. Analizzare ogni campione di cDNA in triplice copia per qPCR: preparare un master mix qPCR (Tabella 1) che è sufficiente per le reazioni necessarie per ogni primer, compresi i primer specifici per i tre geni di pulizia come controlli: gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), actinB e ribosomal 18S (vedi Tabella dei materiali per sequenze di primer):
  7. Distribuisci 18 l di master mix per pozzo in una piastra multiwall PCR.
  8. Aggiungere 2 l di campione di cDNA in ogni pozzo. Sigillare il piatto.
  9. Eseguire i campioni in base all'istruzione Thermal Cycler.

8. Valutazione del sovraccarico dei lipidi e dell'induzione della steatosi: CARS

  1. Fissare le celle precedentemente preparate su piatti dal fondo di vetro, come descritto nei passaggi 5.1-5.3.
  2. Accendere un sistema laser a impulsi picosecondi regolabile commerciale, sintonizzandolo per ottenere due uscite di diverse lunghezze d'onda. La differenza di frequenza tra le uscite deve essere 2.840 cm-1 per generare il segnale luminoso CARS intenso corrispondente allo stretching simmetrico di metilene; per un'uscita a lunghezza d'onda fissa a 1.064 nm ("luce "Stokes"), l'altra lunghezza d'onda deve essere sintonizzata su 817 nm (luce "pompa").
  3. Assicurarsi che l'output di 817 nm sia spazialmente e temporalmente sovrapposto all'output di 1.064 nm: utilizzare uno specchio dicroico appropriato (ad esempio, con un taglio compreso tra 817 e 1.064 nm) per combinare spazialmente i fasci e utilizzare una linea di ritardo ottica per ottenere la sovrapposizione temporale del laser legumi mpl secchi.
  4. Assicurarsi che i due fasci di copropagazione siano entrambi collimati e che i loro diametri abbiano valori simili appropriati per il sistema ottico all'interno del microscopio che li concentrerà sul campione; se necessario, collitri separatamente le travi prima dello specchio dicroico che li combina.
  5. Accendere un sistema commerciale di microscopio invertito, che dovrebbe includere un'unità di scansione laser a infrarossi e un'unità di rilevamento epi esepistico rosso/verde a doppio canale e allineare i raggi laser copropaganti all'unità di scansione.
  6. Apertura dell'unità di rilevamento epi a doppio canale, rimozione del cubo del filtro e sostituzione del filtro di rilevamento a lunghezza d'onda rossa con un filtro passabanda in grado di selezionare il segnale CARS da 2.840 cm centrato a 663 nm per l'escitazione di pompa/stokes 817/1,064 nm trama. È preferibile un filtro a larghezza ridotta (20 nm) per evitare la raccolta di alti livelli di segnali di sfondo fluorescenti.
  7. Posizionare un piatto sul palco del microscopio CARS invertito, e utilizzando un obiettivo di immersione ad olio 100x, spostare la posizione verticale dell'obiettivo per concentrarsi sulle cellule.
  8. Impostare il software del microscopio per raccogliere immagini ad alta risoluzione (1024 x 1024 pixel) su un campo visivo che si estende su 127 m x 127 m.
  9. Impostare il software del microscopio in modo che acquisisca e visualizzi continuamente le immagini del campo visivo 127 x 127 m e controlla le immagini visualizzate ottimizzando i parametri di raccolta delle immagini. Assicurarsi che le potenze laser siano bilanciate per la raccolta rapida delle immagini e danni minimi, inserendo filtri a densità neutra appropriati nei percorsi del fascio in base alle esigenze, e selezionare un tempo di dimora dei pixel che consenta la raccolta di immagini con un buon segnale-rumore nelle condizioni di alimentazione laser selezionate.
  10. Acquisire e salvare immagini di diversi campi di vista all'interno del piatto nelle condizioni ottimizzate. Facoltativamente, le immagini a fluorescenza multifotone, generate da un'emissione a lunghezza d'onda verde (per lo più da eccitazione di due fotoni a 817 nm), possono essere raccolte simultaneamente tramite l'altro rilevatore di epi. Ripetere i passaggi da 8,7 a 8,10 per ogni piatto.
  11. Per l'analisi delle immagini CARS, elaborare le immagini utilizzando l'implementazione FIJI di ImageJ. Azionare la funzione Despeckle (o uno strumento di denodiamento simile) su ogni immagine prima di un'ulteriore analisi per migliorare i rapporti segnale-rumore senza perdita di dettagli.
  12. Utilizzare FIJI per selezionare le celle manualmente e quindi contare automaticamente le goccioline di lipidi all'interno di singole celle segmentate per produrre statistiche sulle aree e i numeri delle goccioline lipidiche per ogni cella e per l'intero set di dati dell'immagine per ogni parabola.

9. MTT Cell Viability Assay

  1. Piastra differenziata cellule HepaRG in una piastra di 96 pozze con una densità di 1 x 105 celle/bene in un volume finale di 100 l di misura di coltura differenziazione.
  2. 24 h dopo la semina, trattare le cellule con il 99% di metanolo (veicolo) e con 100 M, 250 m e 500 M di oleate di sodio e palmitato di sodio diluite in 100 gradi di coltura differenziazione medio/bene in triplice copia.
  3. Cambiare il mezzo con il 99% di metanolo e con 100 M, 250 M e 500 M di oleate di sodio e palmitato di sodio diluito in 100 , l of differenticoltura media/pozzo ogni 24 ore.
  4. 96 h dopo il trattamento con metanolo/odio di sodio/sodio palmitate, trattare le cellule con 2 doxorubicina diluiti in 100 gradi di coltura di differenziazione medio/bene in triplice come controllo.
  5. 18 h dopo il trattamento doxorubucin, cambiare il mezzo con 100 l di mezzo di coltura differenziazione.
  6. Pipet 20 - L of 3-(4,5-di-dithiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium reagenti MTT (Table of Materials) in ogni bene della piastra di 96-well contenente le cellule in 100 - L di coltura media diversa . Includere un controllo in background con la pipa di 20 - L di reagente in un pozzo di controllo senza cellule in 100 - L di supporto di coltura differenziazione in triplice copia.
  7. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umidizzata del 5% di CO 2.
  8. Dopo aver incubato per 30, 60 e 90 min con reagente di tetrazolium MTT, registrare l'assorbimento a 490 nm utilizzando un lettore di lastre di 96 pozzetti. Sottrarre l'assorbimento dello sfondo dei pozze di controllo delle no-cell dai valori di assorbimento per gli altri campioni.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo efficace per indurre e caratterizzare la steatosi vescicolare nelle cellule HepaRG differenziate DMSO mediante trattamento di oleate di sodio (Figura 1A).

Differenziazione delle cellule HepaRG.
Per indurre in modo efficiente la differenziazione, le cellule proliferanti devono essere semitate ad una bassa densità (2,5 x 104 cellule/cm2) nel mezzo di proliferazione. Quand...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive come differenziare le cellule HepaRG e come indurre la steatosi vescicolare mediante trattamento con oleate di sodio (Figura 1A). Infatti, rispetto ad altre linee cellulari umane del carcinoma epatocellulare (HCC), la linea cellulare HepaRG presenta caratteristiche di epatociti umani adulti, che rappresentano una valida alternativa agli epaticiti umani primari coltivati espansioni13,14

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il prof. Siamo grati a Rita Appodia per l'assistenza amministrativa. Questo lavoro è stato sostenuto da MIUR- Profession del' dell'università e della ricerca (FIRB 2011–2016 RBAP10XKNC) e Sapienza University of Rome (prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Hyclone HyClone Clone Fetale II GE HealthcareSH30066
William' s E medium con GlutaMAX Thermofisher32551087
Penicillina/streptomicina SIGMAP4333
Insulina SIGMAI9278
Idrocortisone emiuccinatoSIGMAH2270
DMSO, dimetilsolfossidoSIGMAD2438     
Oleato di sodioSIGMAO7501 
MetanoloSIGMA179337
IsopropanoloSIGMA278475
BODIPY 505/515ThermofisherD3921
PBSThermofisher14190-250
Soluzione di formaldeideSIGMA252549
RNAsi libero DNAseIPromegaM198A 
Piatti con fondo in vetroWillco WellsGWST-5040
Olio Soluzione rossaSIGMAO625
CellTiter 96 AQueous One SolutionPromega G3582
q-PCR oligo nameSequence
ACACB FORCAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REVCCCTGAGTTATCAGAGGCTGG&
BETA;-ACTINA FORGCACTCTTCCAGCCCCCCT
β-actina REVAGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMINA PERTGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMINA REVAAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB PERGCATCTGTCAGCAGAATGGA 
ALDOB REVTAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FORCCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV  CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 PERCTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REVGGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A PERTCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REVGCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 PERTTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REVCGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FORCTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REVTCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FORTGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REVAGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FORTCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REVATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 PERCCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REVACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 PERACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REVTGGAGGTGAGAAGGAAACATACACG
PLIN2 PERTTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REVCCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 PERAATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REVGGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD PERTCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REVTCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 PERTGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REVCCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S PERCGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REVTTGGCAAATGCTTTCGCTCCTC

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).
  2. Byrne, C. D., Targher, G. NAFLD: a multisystem disease. Journal of Hepatology. 62 (1), Suppl 47-64 (2015).
  3. Marra, F., Gastaldelli, A., Svegliati Baroni, G., Tell, G., Tiribelli, C. Molecular basis and mechanisms of progression of non- alcoholic steatohepatitis. Trends in Molecular Medicine. 14, 72-81 (2008).
  4. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  5. Banini, B. A., Sanyal, A. J. Current and future pharmacologic treatment of nonalcoholic steatohepatitis. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (3), 134-141 (2017).
  6. Takahashi, Y., Sugimoto, K., Inui, H., Fukusato, T. Current pharmacological therapies for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 21 (13), 3777-3785 (2015).
  7. Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
  8. Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (2), 230-237 (2018).
  9. Nagarajan, P., Mahesh Kumar, M. J., Venkatesan, R., Majundar, S. S., Juyal, R. C. Genetically modified mouse models for the study of nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of. Gastroenterology. 18 (11), 1141-1153 (2012).
  10. Oseini, A. M., Cole, B. K., Issa, D., Feaver, R. E., Sanyal, A. J. Translating scientific discovery: the need for preclinical models of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology International. 12 (1), 6-16 (2018).
  11. Ramboer, E., Vanhaecke, T., Rogiers, V., Vinken, M. Immortalized human hepatic cell lines for in vitro testing and research purposes. Methods in Molecular Biology. 1250, 53-76 (2015).
  12. Gómez-Lechón, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).
  13. Marion, M. J., Hantz, O., Durantel, D. The HepaRG cell line: biological properties and relevance as a tool for cell biology, drug metabolism, and virology studies. Methods in Molecular Biology. 640, 261-272 (2010).
  14. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  15. Anthérieu, S., Rogue, A., Fromenty, B., Guillouzo, A., Robin, M. A. Induction of vesicular steatosis by amiodarone and tetracycline is associated with up-regulation of lipogenic genes in HepaRG cells. Hepatology. 53 (6), 1895-1905 (2011).
  16. Rouge, A., et al. PPAR agonists reduce steatosis in oleic acid-overloaded HepaRG cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 276 (1), 73-81 (2014).
  17. Belloni, L., et al. Targeting a phospho-STAT3-miRNAs pathway improves vesicular hepatic steatosis in an in vitro and in vivo model. Scientific Reports. 8, 13638(2018).
  18. Nunn, A. D. G., et al. The histone deacetylase inhibiting drug Entinostat induces lipid accumulation in differentiated HepaRG cells. Scientific Reports. 6, 28025(2016).
  19. Donato, M. T., et al. Cytometric analysis for drug-induced steatosis in HepG2 cells. Chemico-Biological Interactions. 181 (3), 417-423 (2009).
  20. Hellerer, T., Axäng, C., Brackmann, C., Hillertz, P., Pilon, M., Enejder, A. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (37), 14658-14663 (2007).
  21. Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), 51092(2012).
  22. Guillouzo, A., Corlu, A., Aninat, C., Glaise, D., Morel, F., Guguen-Guillouzo, C. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  23. Nelson, L. J., et al. Human hepatic HepaRG cells maintain an organotypic phenotype with high intrinsic CYP450 Activity/metabolism and significantly outperform standard HepG2/C3A cells for pharmaceutical and therapeutic applications. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 120 (1), 30-37 (2017).
  24. Gerets, H. H. J., Tilmant, K., Gerin, B., Chanteux, H., Depelchin, B. O., Dhalluin, S., Atienzar, F. A. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
  25. Pusl, T., et al. Free fatty acids sensitize hepatocytes to bile acid-induced apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (3), 441-445 (2008).
  26. Gentile, C. L., Pagliassotti, M. J. The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Nutritional Biochemistry. 19 (9), 567-576 (2008).
  27. Mei, S., et al. Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids on autophagy and apoptosis in hepatocytes. Journal of Pharmacological Experimental Therapy. 339, 487-498 (2011).
  28. Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. Journal of Biological Chemistry. 281, 12093-12101 (2006).
  29. Moravcová, A., Červinková, Z., Kučera, O., Mezera, V., Rychtrmoc, D., Lotková, H. The effect of oleic and palmitic acid on induction of steatosis and cytotoxicity on rat hepatocytes in primary culture. Physiological Research. 64, Suppl 5 627-636 (2015).
  30. Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 133 (4), 477-480 (2010).
  31. Rinia, H. A., Burger, K. N., Bonn, M., Müller, M. Quantitative label-free imaging of lipid composition and packing of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy. Biophysical Journal. 95 (10), 4908-4914 (2008).
  32. Waschatko, G., Billecke, N., Schwendy, S., Jaurich, H., Bonn, M., Vilgis, T. A., Parekh, S. H. Label-free in situ imaging of oil body dynamics and chemistry in germination. Journal of The Royal Society Interface. 13 (123), (2016).
  33. Jüngst, C., Winterhalder, M. J., Zumbusch, A. Fast and long term lipid droplet tracking with CARS microscopy. Journal of Biophotonics. 4 (6), 435-441 (2011).
  34. Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), Pt B 1260-1272 (2017).
  35. Cohen, S. Lipid droplets as organelles. International Review of Cell and Molecular Biology. 337, 83-110 (2018).
  36. Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Trattamento con oleato di sodiocolorazione Oil Red Omisurazione Bodipymicroscopia CARSaccumulo di goccioline lipidichemodello di steatosi epaticaepatociti differenziatiNAFLD in vitro

Articoli correlati