Indurre e caratterizzare la vesapica steatosi nelle celle HepaRG differenziate

Sommario

In questo studio, descriviamo un protocollo dettagliato per indurre la steatosi vescicolare del fegato in cellule HepaRG differenziate con l'oleate di sodio acido grasso e impieghiamo metodi per il rilevamento e la quantificazione dell'accumulo di lipidi, compresi gli anti-Stokes coerenti Microscopia a dispersione Raman (CARS), analisi citofluorimetrica, colorazione Oo rosso olio e qPCR.

Abstract

La steatosi epatica rappresenta una disfunzione metabolica che deriva da un accumulo di goccioline di lipidi trigliceridi contenenti epatociti. L'eccessivo accumulo di grasso porta alla malattia del fegato grasso non alcolico (NAFLD), che è potenzialmente reversibile e può evolvere in steatoepatite analcolica (NASH) e infine cirrosi e carcinoma epatocellulare (HCC). I meccanismi molecolari che collegano l'accumulo di lipidi negli epatociti con la progressione alla NASH, danni epatici irreversibili, fibrosi, cirrosi, e anche HCC rimane ancora poco chiaro. A tal fine, sono stati sviluppati diversi modelli in vitro e in vivo per chiarire i processi patologici che causano NAFLD. Nel presente studio, descriviamo un modello cellulare per l'induzione della steatosi vescicolare del fegato che consiste di cellule Epatiche Epatiche Epatiche EpaRG epatiche differenziate d'AmSO trattate con l'acido grasso sale oleume di sodio. Infatti, le cellule HepaRG trattate con oleato di sodio accumulano goccioline lipidiche nel citoplasma e mostrano caratteristiche tipiche della steatosi. Questo modello umano in vitro rappresenta una valida alternativa ai modelli di topi in vivo e ai primari epediti umani. Presentiamo anche un confronto di diversi metodi per la quantificazione e la valutazione dell'accumulo di grasso nelle cellule HepaRG, tra cui la colorazione ORossa dell'olio, la misurazione citofluorimetrica del Bodipy, l'analisi metabolica dell'espressione genica da parte di qPCR e anti-Stokes coerenti microscopia a dispersione Raman (CARS). L'imaging CARS combina la specificità chimica della spettroscopia Raman, una tecnica di analisi chimica nota nelle applicazioni scientifiche dei materiali, con i vantaggi delle microscopie ottiche non lineari ad alta velocità e ad alta risoluzione per consentire quantificazione dell'accumulo di lipidi e della dinamica delle goccioline lipidiche. L'istituzione di un efficiente modello in vitro per l'induzione della steatosi vescicolare, insieme a un metodo accurato per la quantificazione e la caratterizzazione dell'accumulo di lipidi, potrebbe portare allo sviluppo di una diagnosi in fase iniziale di NAFLD tramite il l'identificazione dei marcatori molecolari e la generazione di nuove strategie di trattamento.

Introduzione

La steatosi epatica è definita come accumulo di grasso intraepatico, all'interno di goccioline di lipidi contenenti trigliceridi, di almeno il 5% del peso del fegato. L'immagazzinamento prolungato di lipidi epatici è un processo potenzialmente reversibile, tuttavia, può portare a disfunzione metabolica del fegato epatico, infiammazione e forme avanzate di malattia epatica grassa non alcolica (NAFLD), la causa predominante della malattia cronica del fegato in molte parti il mondo^1,2. NAFLD è una malattia multifattoriale che può evolvere verso la steatoepatite non alcolica più aggressiva (NASH), che a sua volta ....

Protocollo

1. Preparazione dei mezzi di coltura e dei reagenti

1. Mezzo proliferante: supplemento E medio di William con GlutaMAX, 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina / streptomicina, 5 g / mL di insulina e 0,5M di idrocortisone emisuccinato.
2. Mezzi di differenziazione: supplemento E medio di William con GlutaMAX, 10% FBS, 1% penicillina / streptomicina, 5 g / mL di insulina, 50 emisuccinato idrocortisone M e 2% DMSO.
3. Mezzo di congelamento: integrare il mezzo proliferante con 10% DMSO.
4. Oleate di sodio: sciogliere nel 99% metanolo a una concentrazione di 100 mM, mescolare O/N, e conservare a -20 gradi centigradi.
5. Petrolio Re....

Risultati

Questo protocollo descrive un metodo efficace per indurre e caratterizzare la steatosi vescicolare nelle cellule HepaRG differenziate DMSO mediante trattamento di oleate di sodio (Figura 1A).

Differenziazione delle cellule HepaRG.
Per indurre in modo efficiente la differenziazione, le cellule proliferanti devono essere semitate ad una bassa densità (2,5 x 10⁴ cellule/cm²) nel mezzo di proliferazione. Quand.......

Discussione

Questo protocollo descrive come differenziare le cellule HepaRG e come indurre la steatosi vescicolare mediante trattamento con oleate di sodio (Figura 1A). Infatti, rispetto ad altre linee cellulari umane del carcinoma epatocellulare (HCC), la linea cellulare HepaRG presenta caratteristiche di epatociti umani adulti, che rappresentano una valida alternativa agli epaticiti umani primari coltivati espansioni^13,14

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Hyclone HyClone Clone Fetale II	GE Healthcare	SH30066
William' s E medium con GlutaMAX	Thermofisher	32551087
Penicillina/streptomicina	SIGMA	P4333
Insulina	SIGMA	I9278
Idrocortisone emiuccinato	SIGMA	H2270
DMSO, dimetilsolfossido	SIGMA	D2438
Oleato di sodio	SIGMA	O7501
Metanolo	SIGMA	179337
Isopropanolo	SIGMA	278475
BODIPY 505/515	Thermofisher	D3921
PBS	Thermofisher	14190-250
Soluzione di formaldeide	SIGMA	252549
RNAsi libero DNAseI	Promega	M198A
Piatti con fondo in vetro	Willco Wells	GWST-5040
Olio Soluzione rossa	SIGMA	O625
CellTiter 96 AQueous One Solution	Promega	G3582
q-PCR oligo name	Sequence
ACACB FOR	CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REV	CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG&
BETA;-ACTINA FOR	GCACTCTTCCAGCCCCCCT
β-actina REV	AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMINA PER	TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMINA REV	AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB PER	GCATCTGTCAGCAGAATGGA
ALDOB REV	TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR	CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV	CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 PER	CTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REV	GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A PER	TCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REV	GCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 PER	TTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REV	CGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FOR	CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REV	TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FOR	TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REV	AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FOR	TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REV	ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 PER	CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REV	ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 PER	ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REV	TGGAGGTGAGAAGGAAACATACACG
PLIN2 PER	TTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REV	CCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 PER	AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REV	GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD PER	TCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REV	TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 PER	TGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REV	CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S PER	CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REV	TTGGCAAATGCTTTCGCTCCTC