A breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto

Artur Fernandes; Niele  Dias Mendes; Glaucia  Maria Almeida; Giovanna  Orlovski Nogueira; Carla de Moraes Machado; Jose de Anchieta de Castro Horta-Junior; João  Alberto Assirati Junior; Norberto Garcia-Cairasco; Luciano Neder; Adriano Sebollela

doi:10.3791/59845

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Articolo metodologico

A breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto

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DOI:

10.3791/59845

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5 novembre 2019

Artur Fernandes¹^,² , Niele Dias Mendes¹^,³ , Glaucia Maria Almeida¹ , Giovanna Orlovski Nogueira¹ , Carla de Moraes Machado⁴ , Jose de Anchieta de Castro Horta-Junior⁴ , João Alberto Assirati Junior⁵ , Norberto Garcia-Cairasco² , Luciano Neder³ , Adriano Sebollela¹

¹Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, ²Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, ³Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, ⁴Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, ⁵Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

In questo articolo

Sommario

Viene presentato un protocollo per preparare colture di fette galleggianti libere dal cervello umano adulto. Il protocollo è una variazione del metodo di coltura della fetta ampiamente utilizzato utilizzando inserti di membrana. È semplice, conveniente e consigliato per l'esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all'età.

Abstract

Organotipica, o colture di fette, sono state ampiamente impiegate per modellare aspetti del funzionamento del sistema nervoso centrale in vitro. Nonostante il potenziale delle colture di fette nelle neuroscienze, gli studi che utilizzano il tessuto nervoso adulto per preparare tali culture sono ancora scarse, in particolare quelle provenienti da soggetti umani. L'uso di tessuto umano adulto per preparare le colture di fette è particolarmente interessante per migliorare la comprensione delle neuropatologie umane, in quanto contengono proprietà uniche tipiche del cervello umano maturo privo di fette prodotte da roditori (di solito neologati) tessuto nervoso. Questo protocollo descrive come utilizzare il tessuto cerebrale raccolto da donatori umani viventi sottoposti a chirurgia cerebrale resective per preparare colture di fette a breve termine, galleggianti libere. Vengono inoltre presentate procedure per mantenere ed eseguire saggi biochimici e di biologia cellulare utilizzando queste culture. I risultati rappresentativi dimostrano che la tipica laminazione corticale umana è conservata in fette dopo 4 giorni in vitro (DIV4), con la presenza prevista dei principali tipi di cellule neurali. Inoltre, le fette al DIV4 subiscono una robusta morte cellulare quando vengono sfidate con uno stimolo tossico (H₂O₂), indicando il potenziale di questo modello per fungere da piattaforma nei saggi di morte cellulare. Questo metodo, un'alternativa più semplice ed economica al protocollo ampiamente usato utilizzando inserti di membrana, è raccomandato principalmente per l'esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all'età. Infine, sebbene il protocollo sia dedicato all'utilizzo del tessuto corticale raccolto da pazienti sottoposti al trattamento chirurgico dell'epilessia del lobo temporale farmacoresistente, si sostiene che anche i tessuti raccolti da altre regioni/condizioni cerebrali per produrre simili colture di fette a flotta ntetto.

Introduzione

L'uso di campioni umani nella ricerca è inequivocabilmente una grande opzione per studiare le patologie cerebrali umane, e le tecniche moderne hanno aperto nuovi modi per la sperimentazione robusta ed etica utilizzando tessuti derivati dal paziente. Metodi come le colture organotipiche/fette preparate dal cervello umano adulto sono stati sempre più utilizzati in paradigmi come l'optogenetica¹, l'elettrofisiologia²^,³^,⁴^,⁵, plasticità ⁶^,⁷^,