Lo scopo di questo metodo è quello di generare un modello in vivo di angiogenesi tumorale xenotrapianto di cellule tumorali dei mammiferi in un embrione di pesce zebra che ha vasi sanguigni etichettati fluorescentmente. Esaminando lo xenotrapianto e i vasi associati, è possibile ottenere una misurazione quantitativa della risposta angiogenica.
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Articolo metodologico
Imaging in vivo e quantitazione dell'ospite risposta angiogenica in Xenogrfts tumore zebrati
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'angiogenesi tumorale è un obiettivo chiave della terapia anti-cancro e questo metodo è stato sviluppato per fornire un nuovo modello per studiare questo processo in vivo. Uno xenotrapianto di pesce zebra viene creato impiantando cellule tumorali dei mammiferi nello spazio perivitelline di due giorni dopo la fecondazione degli embrioni di pesce zebra, seguito misurando l'entità della risposta angiogenica osservata in un endpoint sperimentale fino a due giorni post-impianto. Il vantaggio principale di questo metodo è la capacità di quantizzare con precisione la risposta angiogenica dell'ospite del pesce zebra all'innesto. Ciò consente un esame dettagliato dei meccanismi molecolari e del contributo ospite vs tumorale alla risposta angiogenica. Gli embrioni xenointrapsi a possono essere sottoposti a una varietà di trattamenti, come l'incubazione con potenziali farmaci anti-angiogenesi, al fine di studiare strategie per inibire l'angiogenesi tumorale. La risposta angiogenica può anche essere live-immagine al fine di esaminare processi cellulari più dinamici. La tecnica sperimentale relativamente poco impegnativa, i costi di manutenzione a basso costo del pesce zebra e la breve linea temporale sperimentale rendono questo modello particolarmente utile per lo sviluppo di strategie per manipolare l'angiogenesi tumorale.
Introduzione
L'angiogenesi è uno dei segni distintivi classici del cancro e rappresenta un obiettivo della terapia anti-cancro1,2. Per studiare questo processo, sono stati creati modelli di xenotrapianto di cancro impiantando cellule tumorali di mammiferi in animali come i topi3. È stato inoltre sviluppato un modello di xenotrapianto di pesce zebra, che prevede l'impianto di cellule tumorali in 2 giorni dopo la fecondazione (dpi) pesce zebra che si traduce in una rapida crescita dei vasi sanguigni del pesce zebra nello xenotrapianto4.
Questo protoc....
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Protocollo
1. Preparazione degli aghi di microiniezione
- Accendere un tiratore di micropipette e impostare i seguenti parametri (calibrato per il modello di espellere micropipette elencato nella Tabella dei materiali): Calore, 680; Tirare, 75; Velocità, 40; Tempo, 55; Pressione: 530.
- Fissare un capillare di vetro borosilicato nell'eschetto micropipette e tirare il capillare per fare due aghi. Ripetere l'operazione per tutti gli aghi desiderati.
2. Coltura cellulare per l'impianto
NOT: Quando si utilizza questo protocollo, qualsiasi linea cellulare del cancro dei mammif....
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Risultati
Esaminando un singolo xenotrapianto a 6, 24 e 48 hpi, la risposta angiogenica a diversi orari può essere calcolata come mostrato nella Figura 1A-C. La più grande risposta angiogenica si osserva tra 24-48 h dopo l'impianto, con i livelli massimi di vascolarizzazione del trapianto osservati intorno ai 2 dpi (Figura 1A-C). Un filmato time-lapse di una tipica risposta angiogenica a un B16-F1 xenotrap.......
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Discussione
Il primo passo critico nel protocollo è l'impianto delle cellule tumorali. È essenziale che le cellule vengano iniettate in un luogo che consenta allo xenotrapianto di impiantare con successo nell'embrione senza rendere l'embrione edematoso. Un'iniezione troppo anteriore può permettere alle cellule di muoversi verso il cuore, bloccando il flusso sanguigno e portando all'edema, mentre un'iniezione troppo posteriore si tradurrà in uno xenotrapianto impiantato male. Un'iniezione anteriore è meglio evitare inserendo l'ago at.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Alhad Mahagaonkar per aver gestito la struttura di pesce zebra dell'Università di Auckland e l'Unità di Ricerca Biomedica Imaging, Scuola di Scienze Mediche, Università di Auckland, per assistenza nella microscopia confocale time-lapse. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di progetto del Consiglio per la ricerca sanitaria della Nuova èelanda (14/105), una sovvenzione per il progetto Marsden Fund (UOA1602) della Royal Society of Neozelandese e una sovvenzione per il progetto Auckland Medical Research Foundation (1116012) assegnato a J.W.A.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cilindro d'aria | BOC | 011G | Xenotrapianto |
| Cellule B16-F1 | ATCC | Coltura cellulare | |
| BD Matrigel LDEV-free (miscela di matrice extracellulare) | Corning | 356235 | Xenotrapianto |
| Borosillicate capillari in vetro | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1,00 mm, ID = 0,78 mm, Lunghezza = 10 cm Cella di iniezione cellulare |
| piatto per coltura diametro 35 mm | Thermofisher NZ | NUN153066 | Piatto per |
| coltura cellulare Piatto per coltura cellulare diametro 100 mm | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fiaschetta |
| coltura cellulare 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Coltura cellulare |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Marcatura cellulare, concentrazione madre (10 mM in DMSO), concentrazione di lavoro (0,2 μ M in terreni privi di siero) |
| Dimetilsolfossido | Sigma-Aldrich | D8418 | Trattamento farmacologico, Marcatura cellulare |
| E3 Terreni (60x in 2 L di acqua) 34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2· 2H2O 9,78 g MgCl2· 6H2O si regola a pH 7,2 con NaOH | In house [1] | Allevamento ittico | |
| Etil-3-amminobenzoato metansulfonato (Tricaina) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotrapianto, |
| Imaging Filtro punta 1.000 μ L | VWR | 732-1491 | Utilizzato in più fasi |
| filtro 200 μ L | VWR | 732-1489 | Utilizzato in più fasi |
| Puntale del filtro 10 μ L | VWR | 732-1487 | Utilizzato in più fasi |
| Microscopio a fluorescenza | Leica | MZ16FA | Preparazione di embrioni |
| FBS (origine neozelandese) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Guanti per colture cellulari |
| Qualsiasi | marca | Utilizzato in più fasi | |
| Camera di conteggio cellulare per emocitometro Neubauer | HawksleyVet | miglioratoAC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuga | Thermofisher Scientific | 75004500 | Coltura cellulare, Marcatura cellulare |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Marcatura cellulare, Concentrazione madre (1 mg/ml in DMSO), concentrazione di lavoro (6 μ g/ml in terreni privi di siero) |
| Basso punto di fusione, Agarosio ultrapuro | Thermofisher Imaging scientifico | 16520050 | |
| Metilcellulosa | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotrapianto |
| Metilene blu | sigma-Aldrich | M9140 | Microloader per l'allevamento del pesce |
| 0,5-20 μ L punta della pipetta per il caricamento dei microcapillari | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipette | Qualsiasi marca | Utilizzato durante più fasi | |
| Estrattore per micropipette P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Incubatore a gabbia per microscopio | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microonde | Qualsiasi marca commerciale | Imaging | |
| Olio minerale | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotrapianto |
| Terreni essenziali minimi (MEM) - alpha | Thermofisher Scientfic 12561056 | Cell | |
| Culture MPPI-2 Iniettore a pressione | Strumentazione | Xenotrapianto | |
| Micromanipolatore Narishige | Gruppo | NarishigeXenotrapianto Nikon | |
| D Eclipse C1 Microscopio confocale | Nikon | Imaging | |
| N-Feniltiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Allevamento ittico |
| PBS | Gibco | 10010023 | Coltura cellulare |
| Penicillina Streptomicina | Life Technologies | 15140122 | |
| Pipet filler per colture cellulari S1 | Thermoscientific | 9501 | per colture cellulari |
| 10 mL | Corning | 4488 | Stripette |
| sierologiche per colture cellulari 25 mL | Corning | 4489 | Stripette |
| sierologiche per colture cellulari 5 mL | Corning | 4485 | Stripette |
| sierologiche per colture cellulari 2 mL | Corning | 4486 | Ago |
| Terumo per colture cellulari 22 G | Amtech | SH 182 | Allevamento ittico |
| Incubatore per colture tissutali | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Coltura cellulare |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Trattamento farmacologico | |
| Pipetta di trasferimento 3 mL | Mediray | RL200C | Allevamento di pesci |
| Tripsina/EDTA (0,25%) | Life Technologies | T4049 | Pinzette per colture cellulari |
| Strumenti per la scienza | 11295-10 | Allevamento ittico | |
| Software Volocity (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Analisi delle immagini |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Rese....
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Ristampe e permessi
