Presentiamo un protocollo per isolare i fibroblasti adulti primari in modo semplice, veloce e affidabile, performabile dai principianti (ad esempio, gli studenti). La procedura combina la digestione del tessuto enzimatico e l'agitazione meccanica con onde ultrasoniche per ottenere fibroblasti primari. Il protocollo può essere facilmente adattato a specifiche esigenze sperimentali (ad esempio, tessuto umano).
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Articolo metodologico
Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni
In questo articolo
Sommario
Abstract
I fibroblasti adulti primari sono diventati uno strumento importante per studiare la fibrosi, le interazioni con fibroblasti e l'infiammazione in tutti i tessuti del corpo. Poiché i fibroblasti primari non possono dividersi a tempo indeterminato a causa della differenziazione del miofibroblasto o dell'induzione della senescenza, è necessario stabilire regolarmente nuove culture. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli da superare durante i processi di sviluppo di un protocollo di isolamento affidabile e di isolamento fibroblasto primario stesso: il grado di difficoltà del metodo (soprattutto per i principianti), il rischio di contaminazione batterica, il tempo necessario fino a quando i fibroblasti primari possono essere utilizzati per gli esperimenti, e la successiva qualità cellulare e vitalità. In questo studio, viene fornito un protocollo veloce, affidabile e facile da imparare per isolare e coltura fibroblasti adulti primari dal cuore del topo, polmone, fegato e rene che combinano la digestione enzimatica e l'agitazione ultrasonica.
Introduzione
I fibroblasti sono cellule piatte a forma di mandrino con molteplici processi stellati e un ampio reticolo endoplasmico ruvido1,2. Un fibroblasto medio misura 30 - 100 m e ha una durata di vita di 57 x 3 giorni1,3. La durata media del ciclo cellulare dei fibroblasti umani varia da 16 a 48 h a seconda delle condizioni di coltura4. È dimostrato che la capacità replicativa e la qualità funzionale dei fibroblasti primari coltivati sono correlatrici negativamente con l'età del donatore, suggerendo che i donatori più giovani (animali o pazienti) dovrebbero essere preferiti, se possibile,5,6 .
I fibroblasti costituiscono un tipo di cellula predominante della maggior parte dei tessuti del corpo dei mammiferi. Nonostante la loro presenza onnipresente, l'identificazione molecolare dei fibroblasti è ancora una sfida7. I fibroblasti migrano verso lo sviluppo di tessuti e organi provenienti da diverse fonti durante lo sviluppo embrionale8. Per questo motivo, c'è una pletora di proteine marcatore che possono essere trovate nei fibroblasti, mentre le proteine marcatore uniche, che sono presenti in ogni popolazione di fibroblasti ed esclusive per i fibroblasti, sono ancora mancanti. Pertanto, i modelli di espressione di diversi marcatori riconosciuti sono di solito utilizzati per identificare i fibroblasti. Tra i marcatori più riconosciuti sono vimentina, proteina superficiale del fibroblasto umano (hFSP), recettore del dominio discoidina 2 (DDR2) e actinmuscolare alfa liscio ( . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I fibroblasti sono il principale tipo di cellule che producono matrici extracellulari (ECM). Di conseguenza, i fibroblasti mantengono un'architettura ordinata dei tessuti e forniscono supporto meccanico per le cellule vicine1. L'equilibrio tra sintesi e degradazione ECM è un processo ben regolato. I spostamenti verso la sintesi segnano l'inizio di un'eccessiva deposizione di ECM che, se non terminata, porta alla fibrosi. La fibrosi è mediata dai miofibroblasti, che provengono da fibroblasti attivati sottoposti a cambiamenti molecolari e fenotipici. Un segno distintivo di miofibroblasti è una maggiore secrezione di ECM e citochine e l'espressione di microfilamenti sMA ordinati9.
I fibroblasti primari sono stati sotto i riflettori di una recente ricerca incentrata sulla fibrosi, l'infiammazione dei tessuti e le interazioni fibroblasto-cancro-cellula10,11. Tuttavia, per studiare efficacemente le proprietà del fibroblasto in salute e malattia, è necessario isolare regolarmente i fibroblasti adulti vitali. Ci sono diversi metodi disponibili per isolare i fibroblasti12,13,14. I tre principali metodi di isolamento del fibroblasto sono la crescita dai pezzi di tessuto12, la digestione del tessuto enzimatico15e la perfusione ezimatica degli organi cavi9,13,16. Il vantaggio della crescita è un processo di isolamento delicato senza degradazione cellulare enzimatica. D'altra parte, le colture di escrescenza di solito richiedono periodi di coltura prolungati fino a quando le cellule possono essere utilizzate per gli esperimenti. La digestione enzimatica comune è veloce, ma comporta un rischio di contaminazione con altri tipi di cellule (ad esempio, cellule endoteliali) o batteri nel processo di agitazione, che è necessario per sciogliere meccanicamente il tessuto. Inoltre, questi metodi sono spesso elaborati e richiedono tempo e abilità per imparare.
Per quanto riguarda l'importanza dei fibroblasti primari nella ricerca, è ancora necessario ottimizzare gli approcci esistenti di isolamento cellulare in termini di rapidità, semplicità e affidabilità. Qui, viene fornito un nuovo metodo di isolamento eziblasto etcimo basato su ultrasuoni che fornisce cellule di alta qualità.
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Protocollo
Il seguente protocollo segue le linee guida istituzionali per la cura degli animali della Technische Universitat Dresden, in Germania (numero di file: T 2014/4) e le linee guida per la cura degli animali accettate a livello internazionale (FELASA)17. Figura 1 visualizza il processo di isolamento delle celle.
1. Preparazione dell'impostazione, del materiale e dei supporti
- Preparare il mezzo di coltura cellulare, soluzione PBS, la soluzione di brogola di collagenae (ricostituire 50 mg di miscela di collagenasi liofilizzata in 12 mL di acqua ultrapura sterile) e soluzione di prova dello 0,25%.
- Riscaldare il mezzo, il PBS e la soluzione trypsin a 37 .
- Preriscaldare il bagno d'acqua ad ultrasuoni a 37 gradi centigradi.
- Disinfetta le pinze, una spatola in acciaio inossidabile, bisturi (2x bisturi per organo) e 2 becher di vetro con 70% di etanolo e posizionano questi materiali sotto il cofano della coltura cellulare.
- Riempire un becher con il 70% di etanolo e l'altro con acqua sterile o soluzione PBS. Questi becher sono tenuti a disinfettare e lavare lo strumento dopo ogni processione d'organo.
- Mettere sterili tubi di plastica da 15 mL contenenti PBS freddo sul ghiaccio bagnato. Il numero di tubi dipende dal numero di organi da cui si desidera isolare i fibroblasti.
2. Dissezione del topo e rimozione dell'organo
- Indossare due paia di guanti uno sopra l'altro, in modo che la prima coppia può essere rimosso non appena l'animale è stato sezionato.
NOTA: Questa procedura impedisce ai batteri di diffondersi sopra gli organi. - Eutanasia il topo (ad esempio, dislocazione cervicale) e appunta la carcassa con aghi ad ogni arto a un cuscinetto in polistirolo.
- Disinfettare la carcassa di topo utilizzando uno spray etanolo 70%. Assicurarsi che la pelliccia sia imbevuta di etanolo in modo che i capelli non turbinino.
- Tagliare la pelliccia proprio sopra il tratto urogenitale utilizzando pinze chirurgiche e forbici atraumatiche. Tagliare la pelle lungo la linea mediana dal punto dell'incisione iniziale al collo (3 - 4 cm) e aggiungere tagli di rilievo agli arti.
AVVISO: Non perforare lo strato muscolare in questo passaggio per evitare la contaminazione batterica! - Fissare la pelle al cuscinetto di schiuma di polistirolo per avere un accesso ottimale alla muscolatura che copre la cavità addominale.
- Disinfettare la muscolatura addominale due volte utilizzando 70% etanolo. Lasciare asciugare l'etanolo prima di proseguire con il passo successivo.
- Rimuovere il primo paio di guanti. Utilizzare un nuovo set sterile di pinze e forbici.
- Aprire la cavità addominale e il torace incidendo lo strato muscolare con forbici chirurgiche per rimuovere delicatamente gli organi di scelta. Pertanto, tenere delicatamente l'organo con pinze chirurgiche (non perforare l'organo, utilizzare una pressione minima) e tagliare i vasi sanguigni di alimentazione vicino al punto di ingresso presso l'organo con le forbici.
- Mettere gli organi nei tubi sterili contenenti PBS freddo. Chiudere i tubi ermeticamente. Posizionare i tubi sul ghiaccio bagnato fino a proseguire con il passaggio 3.1.
3. Mincing dei tessuti, digestione ed estrazione cellulare
- Trasferire i tubi sotto la sterile cappa cellulare.
ATTENZIONE: Indossare un nuovo paio di guanti e disinfettare i tubi con il 70% di etanolo prima di trasferirli sotto il cofano! - Estrarre l'organo dal tubo da 15 mL usando pinze sterili. Posizionare l'organo su una metà di una parabola Petri sterile di 6 cm e lavare brevemente l'organo con PBS per rimuovere il sangue in eccesso. Trasferire l'organo nella seconda metà del piatto Petri, rimuovere l'eccesso di PBS.
- Mitoilare il tessuto utilizzando due bisturi sterili. I frammenti di tessuto rimanenti non devono essere superiori a 1 - 2 mm.
- Trasferire il tessuto macinato in un nuovo tubo sterile da 15 mL utilizzando la spatola sterile e aggiungere 2 mL di 0,25% soluzione di prova. Collocare il tubo in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi per 5 min.
- Vorticare delicatamente il tubo (circa 1400/min) per 10 s.
- Interrompere la reazione alla trypsin sotto la cappa cellulare aggiungendo 4 mL di coltura cellulare contenente FCS medio (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), ad esempio.
- Aggiungere 250 l di soluzione di miscela di collagenasi ad ogni tubo contenente cuore o tessuto polmonare e 100 L per il rene o il fegato, rispettivamente.
- Collocare i tubi in un bagno d'acqua ad ultrasuoni (37 gradi centigradi) e attivare il sonicatore ad ultrasuoni per 10 minuti.
NOTA: Il bagno d'acqua ad ultrasuoni utilizzato in questo protocollo ha una frequenza operativa di 35 kHz e una potenza massima di 320 W. - Vorticare delicatamente i tubi (circa 1400/min) per 10 s.
- Riposizionare i tubi nel bagno d'acqua ad ultrasuoni per 10 min.
- Vorticare delicatamente (circa 1400/min) per 10 s.
- Disinfettare i tubi con il 70% di etanolo e trasferirli sotto la sterile cappa cellulare.
- Filtrare la soluzione con una rete da 40 m in un nuovo tubo sterile da 15 mL.
- Centrifugare il tubo a 500 x g per 5 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di mezzo fresco.
- Trasferire le cellule in un recipiente di coltura cellulare adatto (ad esempio, piastra di 6 pozze) e posizionare il recipiente nell'incubatrice coltura cellulare durante la notte a 37 e 5% CO2.
- Il giorno successivo, rimuovere il mezzo, lavare 3 volte con PBS, quindi aggiungere il mezzo fresco (il volume aggiunto dipende dal vaso di coltura cellulare di scelta, 2 mL per pozzo di una piastra di 6 pozzetti ecc.).
- Cambiare il supporto ogni due giorni.
NOTA: I fibroblasti possono essere divisi dopo aver raggiunto la confluenza ottica del 90% (di solito dopo 5-7 giorni).
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Risultati
È stata dimostrata la capacità di questo protocollo di isolare i fibroblasti adulti dal tessuto murino solido. Sono stati ottenuti fibroblasti vitali che potrebbero essere utilizzati per esperimenti successivi come l'immunofluorescenza colorazione o gli esperimenti di proliferazione (Figura 2D-F, Figura 5A).
I fibroblasti adulti sono cellule piatte a forma di mandrino con più processi cellulari che in...
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Discussione
Rispetto alle linee cellulari fibroblaste immortale, i fibroblasti primari offrono diversi vantaggi. Possono essere isolati in modo conveniente in alta qualità e quantità. Inoltre, le colture primarie offrono la possibilità di studiare cellule da più individui, il che aumenta l'affidabilità dei risultati ottenuti e diminuisce la probabilità di studiare semplicemente gli artefatti della coltura cellulare. La generazione continua di nuove culture primarie previene le alterazioni genetiche che si verificano comunemente dopo...
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la signora Romy Kempe e la signora Annett Opitz per il supporto tecnico esperto. Ringraziamo anche Bjoern Binnewerg per il supporto IT. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni da a) il F'rderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsf'rderprogram f'r Frauen", Facoltà di Medicina Gustav Carus Dresden e c) Altrikroner-Forschungskolleg (EKFK) Facoltà di Medicina Carl Carl Carus Dresden. Siamo grati per i finanziamenti e il sostegno.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotici | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillina/ Streptomicina (10.000 U/mL) |
| Cappa per colture cellulari | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Incubatore per colture cellulari | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Piastre per colture cellulari | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | dipende dal | recipiente 6, 12, 24 pozzetti Superficie Nunclon |
| Aspirazione per colture cellulari | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germania | 20727400 | BVC aspirazione professionale |
| Filtro a celle (rete) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 & micro; m |
| Nylon Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Controller di pipettaggio a batteria | Hirschmann, Eberstadt, Germania | 9907200 | Pipetus |
| Puntali per pipette monouso | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | dipende dal volume | Puntali SafeSeal per pipette (10 & micro; L, 20 & micro; L, 100 & micro; L, 200 & micro; L, 1000 & micro; L) |
| Pipette in plastica monouso | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | dipende dal volume | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| Bisturi sterile monouso | Myco Medical, Cary, USA | n.a.Techno | cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | Provette Eppendorf ad alto glucosio |
| Eppendorf, Amburgo, Germania | dipende dal volume | 50 µ L, 500 & micro; L, 1.500µ L, 2.000 & micro; L | |
| Siero fetale di vitello (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Miscela di collagenasi | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Piastra di Petri per uso ricercato |
| 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 mL |
| Kit di rilevamento della senescenza | Abcam, Cambridge, Regno Unito | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a.MS2 | Minishaker (modello successivo: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Provette sterili in plastica | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Provette Falcon 352095 | BD Falcon (15 mL, 50 mL) |
| Bagno d'acqua ad ultrasuoni | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlino, Germania | 312 | Sonorex RK100H |
| Forbici chirurgiche (atraumatiche) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germania | NR 82 | |
| Forbici chirurgiche | Aesculap AG, Tuttlingen, Germania | eq 1060.09 | |
| Pinze chirurgiche | Aesculap AG, Tuttlingen, Germania | BD577 |
Riferimenti
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098(2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033(2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
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