Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni

Sommario

Presentiamo un protocollo per isolare i fibroblasti adulti primari in modo semplice, veloce e affidabile, performabile dai principianti (ad esempio, gli studenti). La procedura combina la digestione del tessuto enzimatico e l'agitazione meccanica con onde ultrasoniche per ottenere fibroblasti primari. Il protocollo può essere facilmente adattato a specifiche esigenze sperimentali (ad esempio, tessuto umano).

Abstract

I fibroblasti adulti primari sono diventati uno strumento importante per studiare la fibrosi, le interazioni con fibroblasti e l'infiammazione in tutti i tessuti del corpo. Poiché i fibroblasti primari non possono dividersi a tempo indeterminato a causa della differenziazione del miofibroblasto o dell'induzione della senescenza, è necessario stabilire regolarmente nuove culture. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli da superare durante i processi di sviluppo di un protocollo di isolamento affidabile e di isolamento fibroblasto primario stesso: il grado di difficoltà del metodo (soprattutto per i principianti), il rischio di contaminazione batterica, il tempo necessario fino a quando i fibroblasti primari possono essere utilizzati per gli esperimenti, e la successiva qualità cellulare e vitalità. In questo studio, viene fornito un protocollo veloce, affidabile e facile da imparare per isolare e coltura fibroblasti adulti primari dal cuore del topo, polmone, fegato e rene che combinano la digestione enzimatica e l'agitazione ultrasonica.

Introduzione

I fibroblasti sono cellule piatte a forma di mandrino con molteplici processi stellati e un ampio reticolo endoplasmico ruvido^1,2. Un fibroblasto medio misura 30 - 100 m e ha una durata di vita di 57 x 3 giorni^1,3. La durata media del ciclo cellulare dei fibroblasti umani varia da 16 a 48 h a seconda delle condizioni di coltura⁴. È dimostrato che la capacità replicativa e la qualità funzionale dei fibroblasti primari coltivati sono correlatrici negativamente con l'età del donatore, suggerendo che i donatori più giovani (animali ....

Protocollo

Il seguente protocollo segue le linee guida istituzionali per la cura degli animali della Technische Universitat Dresden, in Germania (numero di file: T 2014/4) e le linee guida per la cura degli animali accettate a livello internazionale (FELASA)¹⁷. Figura 1 visualizza il processo di isolamento delle celle.

1. Preparazione dell'impostazione, del materiale e dei supporti

1. Preparare il mezzo di coltura cellulare, soluzione PBS, la soluzione di brogola di collagenae (ricostituire 50 mg di miscela di collagenasi liofilizzata in 12 mL di acqua ultrapura sterile) e soluzione di prova....

Risultati

È stata dimostrata la capacità di questo protocollo di isolare i fibroblasti adulti dal tessuto murino solido. Sono stati ottenuti fibroblasti vitali che potrebbero essere utilizzati per esperimenti successivi come l'immunofluorescenza colorazione o gli esperimenti di proliferazione (Figura 2D-F, Figura 5A).

I fibroblasti adulti sono cellule piatte a forma di mandrino con più processi cellulari che in.......

Discussione

Rispetto alle linee cellulari fibroblaste immortale, i fibroblasti primari offrono diversi vantaggi. Possono essere isolati in modo conveniente in alta qualità e quantità. Inoltre, le colture primarie offrono la possibilità di studiare cellule da più individui, il che aumenta l'affidabilità dei risultati ottenuti e diminuisce la probabilità di studiare semplicemente gli artefatti della coltura cellulare. La generazione continua di nuove culture primarie previene le alterazioni genetiche che si verificano comunemente dopo.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotici	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillina/ Streptomicina (10.000 U/mL)
Cappa per colture cellulari	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Incubatore per colture cellulari	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Piastre per colture cellulari	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	dipende dal	recipiente 6, 12, 24 pozzetti Superficie Nunclon
Aspirazione per colture cellulari	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germania	20727400	BVC aspirazione professionale
Filtro a celle (rete)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 & micro; m
Nylon Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Controller di pipettaggio a batteria	Hirschmann, Eberstadt, Germania	9907200	Pipetus
Puntali per pipette monouso	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	dipende dal volume	Puntali SafeSeal per pipette (10 & micro; L, 20 & micro; L, 100 & micro; L, 200 & micro; L, 1000 & micro; L)
Pipette in plastica monouso	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	dipende dal volume	5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Bisturi sterile monouso	Myco Medical, Cary, USA	n.a.Techno	cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	Provette Eppendorf ad alto glucosio
	Eppendorf, Amburgo, Germania	dipende dal volume	50 µ L, 500 & micro; L, 1.500µ L, 2.000 & micro; L
Siero fetale di vitello (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Miscela di collagenasi	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Piastra di Petri per uso ricercato
6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 mL
Kit di rilevamento della senescenza	Abcam, Cambridge, Regno Unito	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.MS2	Minishaker (modello successivo: Ident-Nr.: 0020016017)
Provette sterili in plastica	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Provette Falcon 352095	BD Falcon (15 mL, 50 mL)
Bagno d'acqua ad ultrasuoni	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlino, Germania	312	Sonorex RK100H
Forbici chirurgiche (atraumatiche)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germania	NR 82
Forbici chirurgiche	Aesculap AG, Tuttlingen, Germania	eq 1060.09
Pinze chirurgiche	Aesculap AG, Tuttlingen, Germania	BD577