Method Article

Valutazione della disponibilità di minerali nei mangimi per pesci utilizzando metodi complementari dimostrati con l'esempio di zinco nel salmone atlantico

DOI:

10.3791/59862

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October 29th, 2021

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1Institute of Marine Research, 2Department of Biological Sciences, University of Bergen, 3National Food Institute, Technical University of Denmark, 4Metal metabolism group, Nutritional Sciences Division, King's College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo spiega in dettaglio un approccio sistematico per valutare la disponibilità di microminerali nel salmone atlantico. La metodologia include strumenti e modelli con complessità biologica crescente: (1) analisi di speciazione chimica, (2) solubilità in vitro, (3) studi di assorbimento in linee cellulari e (4) studi in vivo sui pesci.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Valutare la disponibilità di micro-minerali dietetici è una grande sfida nella nutrizione minerale delle specie ittiche. Il presente articolo si propone di descrivere un approccio sistematico che combina diverse metodologie per valutare la disponibilità di zinco (Zn) nel salmone atlantico (Salmo salar). Considerando che diverse specie chimiche di Zn possono essere presenti in un mangime per salmone atlantico, è stato ipotizzato che la disponibilità di Zn sia influenzata dalle specie chimiche Zn presenti nel mangime. Pertanto, in questo studio, il primo protocollo riguarda come estrarre le diverse specie chimiche Zn dal mangime e analizzarle con un metodo di cromatografia-spettroscopia di massa al plasma accoppiato induttivamente (SEC-ICP-MS) di esclusione dimensionale. Successivamente, è stato sviluppato un metodo in vitro per valutare la solubilità dello Zn alimentare nei mangimi per salmone atlantico. Il terzo protocollo descrive il metodo per studiare l'impatto del cambiamento della composizione delle specie chimiche Zn sull'assorbimento di Zn in un modello epiteliale intestinale di pesce utilizzando una linea cellulare intestinale di trota iridea (RTgutGC). Insieme, i risultati dei metodi in vitro sono stati confrontati con uno studio in vivo che esamina l'apparente disponibilità di fonti inorganiche e organiche di Zn integrate ai mangimi per salmone atlantico. I risultati hanno mostrato che diverse specie chimiche di Zn possono essere trovate nei mangimi e l'efficienza di una fonte organica di Zn dipende molto dal ligando di aminoacidi utilizzato per chelare Zn. I risultati dei metodi in vitro avevano una minore correlazione con l'esito dello studio in vivo. Tuttavia, i protocolli in vitro descritti in questo articolo hanno fornito informazioni cruciali sulla disponibilità di Zn e sulla sua valutazione nei mangimi per pesci.

Introduction

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La farina di pesce e l'olio di pesce erano tradizionalmente usati nei mangimi per salmoni dell'Atlantico. Tuttavia, questi ingredienti vengono sempre più sostituiti da ingredienti a base vegetale1. Il suddetto cambiamento nella composizione dei mangimi ha comportato una bassa disponibilità dietetica e una maggiore necessità di migliorare la disponibilità di minerali nei mangimi per salmoni dell'Atlantico, in particolare zinco (Zn)2. La ridotta disponibilità potrebbe essere il risultato di un cambiamento nel livello di Zn, nelle specie chimiche di Zn o/o nei fattori antinutrizionali presenti nella matrice di alimentazione. In questo scenario, è emersa una nuova gamma di additivi genericamente considerati come "fonti organiche" con il potenziale di essere una migliore fonte disponibile di minerali alimentari per i pesci. Pertanto, è importante comprendere la chimica e la fisiologia fondamentali che regolano la disponibilità di minerali e le loro fonti per pescare. Lo zinco è un oligoelemento essenziale per tutti gli organismi viventi3. Il ruolo di Zn come molecola di segnalazione è stato descritto sia a livello paracellulare che intracellulare nel pesce4. Nel salmone atlantico, la carenza di Zn è stata associata ad anomalie scheletriche e ridotta attività di vari metalloenzimi Zn5,6.

Questo studio descrive un approccio sistematico per comprendere la disponibilità di Zn classificandolo in quattro diversi compartimenti di varia complessità chimica e biologica. I metodi in questione sono descritti in quattro sezioni, come si può vedere nella Figura 1: (1)valutazione di specie chimiche Zn nella frazione solubile di un mangime per salmone atlantico utilizzando una spettroscopia di massa al plasma accoppiato induttivamente (SEC-ICP-MS)metodo 7; 2) solubilità in vitro dello Zn integrato nei mangimi per salmoni dell'Atlantico; (3) valutazione dell'assorbimento di specie chimiche Zn mediante modello intestinale in vitro (RTgutGC)8; e (4) apparente disponibilità di Zn nel salmone dell'Atlantico (Salmo salar)9. Protocolli simili possono essere sviluppati per altri minerali (ad esempio, manganese, selenio, rame) di interesse nutrizionale per le specie ittiche di acquacoltura.

Protocol

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La prova di alimentazione nella sezione 4 è stata eseguita secondo la legislazione norvegese (FOR-2015-06 - 18-761) ed europea (direttiva 2010/63/UE).

1. Valutazione delle specie chimiche Zn nella frazione solubile di un mangime per salmone atlantico utilizzando un metodo SEC-ICP-MS

  1. Tampone di estrazione (100 mM Tris-HCl, pH 8,5)
    1. Preparare il tampone di estrazione sciogliendo una quantità appropriata di tris(idrossimetil)amminometano per raggiungere la forza ionica desiderata (100 mM) in ultrapuro H2O.
    2. Regolare il pH della soluzione a pH 8,5 con la soluzione HCl, monitorando la variazione di pH con un pHmetro.
  2. Preparazione di campioni di mangimi
    NOTA: Il campione di mangime utilizzato è stato formulato sulla base di mangimi commerciali per salmone atlantico, contenenti fonti proteiche principalmente da ingredienti di origine vegetale (vale a.l.i., circa il 5% di proteine di pesce, il 10% di olio di pesce, il 68% di proteine vegetali e il 12% di olio vegetale). Il solfato di zinco è stato integrato al mangime.
    1. Macinare il campione di mangime a mano usando un pestello e un mortaio.
    2. Setacciare il campione di mangime per assicurarsi che l'estrazione venga eseguita in una frazione di mangime con particelle di dimensioni simili (da 850 μm a 1,12 mm).
    3. Procedere all'esecuzione dell'estrazione Zn.
  3. Estrazione dello zinco da un campione di mangime
    1. Pesare circa 0,5 g di mangime in triplice copia in tubi conici da 15 ml.
    2. Aggiungere il tampone di estrazione (5 mL di 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) ai campioni.
    3. Estrarre i campioni in un rotatore (20 giri/min) a 4 °C per 24 ore.
    4. Separare le frazioni solubili e non solubili mediante centrifugazione per 10 min a 3000 x g.
    5. Utilizzare un filtro a siringa monouso da 0,45 μm per filtrare la frazione solubile.
    6. Trasferire i campioni filtrati in tubi puliti.
    7. Eseguire l'analisi di speciazione Zn nelle frazioni solubili utilizzando SEC-ICP-MS, come descritto nel passaggio 1.6.
      NOTA: un riepilogo della procedura per l'estrazione di Zn da un campione di mangime è descritto nella Figura 2.
  4. Soluzione in fase mobile (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7,5)
    1. Preparare la soluzione in fase mobile sciogliendo 6,057 g di tris(idrossimetil)amminometano in 1 L di soluzione di MeOH al 3% (v/v).
    2. Regolare il pH della soluzione a pH a 7,5 con la soluzione HCl, monitorando la variazione di pH con un pHmetro.
    3. Filtrare la soluzione in fase mobile attraverso un filtro a membrana da 0,45 μm.
  5. Calibrazione del peso molecolare dell'intervallo di separazione delle colonne SEC
    1. Calibrare l'intervallo di separazione eseguendo una calibrazione del peso molecolare.
      NOTA: In questo studio sono stati utilizzati tireoglobulina (660 kDa), superossido dismutasi Zn/Cu (32 kDa), mioglobina (17 kDa) e vitamina B12 (1,36 kDa).
    2. Preparare ciascuno degli standard con una concentrazione nota in ultrapuro H2O.
    3. Preparare un flaconcino per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) aggiungendo 250 μL di standard a un flaconcino.
    4. Caricare i flaconcini con gli standard per l'esecuzione della sequenza dei campioni.
    5. Eseguire la calibrazione del peso molecolare all'inizio e alla fine della sequenza analitica, monitorando 127I (tireoglobulina), 66Zn (superossido dismutasi Zn/Cu), 57Fe (mioglobina) e 59Co (vitamina B12).
      NOTA: La calibrazione del peso molecolare viene eseguita contemporaneamente all'analisi di speciazione Zn.
  6. Analisi della speciazione dello zinco mediante SEC-ICP-MS
    NOTA: L'analisi di speciazione Zn con il metodo SEC-ICP-MS è stata sviluppata sulla base dei principi descritti altrove10,11 ed è stata eseguita un'ulteriore ottimizzazione per l'analisi di un mangime per salmone atlantico7.
    1. Eseguire l'analisi di speciazione Zn sulle frazioni solubili utilizzando una colonna di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) e un HPLC accoppiato con spettroscopia di massa plasmatica accoppiata induttivamente (ICP-MS).
    2. Preparare un flaconcino HPLC aggiungendo 250 μL di frazione solubile a un flaconcino.
    3. Prima dell'analisi, picchia tutti i campioni con 0,5 μL di vitamina B12. Questo passaggio consente di correggere i tempi di ritenzione dei turni, monitorando 59Co.
    4. Diluire la frazione solubile con tampone di estrazione (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) e regolare fino a un volume finale di 1 mL.
    5. Preparare l'esecuzione della sequenza dei campioni in ordine casuale.
    6. Sintonizzare l'ICP-MS in base alle istruzioni del produttore.
    7. Seguire le impostazioni dello strumento per l'HPLC e l'ICP-MS eseguendo l'analisi di speciazione Zn (vedere Tabella 1).

2. Solubilità in vitro dello Zn integrato nei mangimi per salmone atlantico

NOTA: Il campione di mangime utilizzato è stato formulato sulla base di mangimi commerciali per salmone dell'Atlantico, contenenti fonti proteiche principalmente da ingredienti di origine vegetale (cioè circa il 5% di farina di pesce, il 10% di olio di pesce, il 68% di ingredienti vegetali e il 12% di olio vegetale).

  1. Macinare i campioni di mangime per salmone atlantico per 10 s a 3000 giri / min utilizzando un coltellificio e conservare a 4 ° C fino a ulteriori analisi.
  2. Pesare ~ 0,2 g dei campioni di mangime macinati nel passaggio 2.1 e aggiungere il radiotracciante Zn (65Zn) di attività specifica nota in una provetta di 5 mL di volume (con un tappo).
    ATTENZIONE: questa procedura deve essere eseguita all'interno di una suite di radionuclidi. La persona che esegue questo passaggio deve essere addestrata e certificata per gestire gli isotopi radio. Le misure di sicurezza e precauzionali consigliate dall'amministrazione per la sicurezza delle radiazioni dell'istituto devono essere rigorosamente seguite.
  3. Quindi preparare la soluzione tampone luminale intestinale d'acqua dolce come descritto di seguito.
    1. Per la soluzione salina A, pesare 11,65 g di NaNO3, 0,55 g di KNO3 e 0,4 g di MgSO4. Sciogliere i sali in ultrapuro H2O e regolare fino ad un volume finale di 60 ml.
    2. Per la soluzione salina B, pesare 0,31 g di Ca(NO3)2· 4 H2O. Sciogliere i sali in ultrapuro H2O e regolare fino ad un volume finale di 10 ml.
    3. Utilizzare la soluzione stock HEPES da 500 mM come soluzione salina C.
    4. Per la soluzione salina D, pesare 1,2 g di MgCl2, sciogliere il sale in ultrapuro H2O e regolare a un volume finale di 20 ml.
    5. Per la soluzione salina E, pesare 0,9 g di MgSO4, sciogliere il sale in ultrapuro H2O e regolare a un volume finale di 20 ml.
    6. Preparare la soluzione di piruvato sciogliendo 0,55 g di CH3COCOONa in 10 ml di ultrapuro H2O.
    7. Sciogliere 0,9 g di galattosio (C6H12O6) in ultrapuro H2O.
    8. Sciogliere bene con un agitatore magnetico e sterilizzare le soluzioni saline A, B, D ed E mediante autoclave e la soluzione C, piruvato e galattosio mediante filtrazione attraverso un filtro a siringa da 200 μm.
    9. Dopo la preparazione delle diverse soluzioni stock, per preparare 100 mL di soluzione di lavoro del tampone, mescolare le soluzioni preparate sopra nella seguente proporzione: 6,8 mL di soluzione salina A, 4,14 mL di B, 5 mL di C, 2,5 mL di D, 1,5 mL di E e 1,14 mL ciascuno di piruvato e galattosio. Portare il volume a 100 ml usando acqua deionizzata.
      NOTA: Il buffer di cui sopra rappresenterà ora la composizione ionica del lume intestinale che si trova nei salmonidi d'acqua dolce.
  4. Preparare altre sei aliquote del tampone descritte al punto 2.6 e aggiungere uno dei seguenti amminoacidi (cisteina, metionina, glicina, istidina, lisina e arginina) per raggiungere una concentrazione molare finale di 5 mM.
  5. Aggiungere il tampone luminale intestinale d'acqua dolce (volume di reazione = 3 mL; pH 7,4) al campione di mangime.
  6. Ripetere il passaggio 2.5 con i tamponi descritti al punto 2.4 (in presenza di diversi amminoacidi a 5 mM di concentrazione).
  7. Chiudere i tubi e lasciarli girare in uno spinner rotante per 30 minuti a 25 giri / min.
  8. Separare le frazioni solubili e non solubili mediante centrifugazione per 10 min a 1157 x g.
  9. Utilizzare un cassiere gamma per misurare i conteggi al minuto (cpm) di 65Zn nelle frazioni solubili e non solubili.
  10. Calcolare la proporzione dei radioi isotopi di Zn(65Zn) presenti nelle frazioni solubili e non solubili.

3. Valutazione dell'assorbimento di specie chimiche Zn utilizzando un modello intestinale in vitro (RTgutGC)

  1. Coltura di cellule RTgutGC
    NOTA: tutti i materiali di lavoro utilizzati in questa fase devono essere sterili.
    1. Ravvivare delicatamente le cellule RTgutGC congelate a bagnomaria a 20 °C.
    2. Pipettare delicatamente la soluzione contenente le cellule e sospenderle in 10 ml di terreno L15 contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS).
      NOTA: il 10% di FBS viene utilizzato solo per far rivivere le cellule congelate. Per il passaggio successivo, FBS viene utilizzato al 5%. La composizione di FBS può variare tra i lotti, quindi è consigliabile acquistare e immagazzinare quanto richiesto da un singolo lotto per evitare variazioni tra i lotti nella composizione del siero.
    3. Aggiungere la sospensione cellulare a 75 cm 2 palloni dicoltura cellulare e incubare in un incubatore impostato a 19 °C in atmosfera normale.
    4. Controllare le cellule e quando sono confluenti (confluenza dell'80%, valutare visivamente esaminando la densità della superficie cellulare al microscopio), dividere le cellule in nuovi palloni (passaggio successivo) o raccogliere da utilizzare negli esperimenti.
      NOTA: Un esempio delle cellule RTgutGC 1 ora e 1 settimana dopo la semina ai palloni di coltura cellulare è mostrato nella Figura 3.
  2. Raccolta cellulare e preparazione per esperimenti di esposizione
    1. Lavare le cellule due volte con 1 mL di soluzione di acido etilendiammitattraacetico (EDTA). Dopo ogni lavaggio, sifonare la soluzione di EDTA utilizzando un tubo di aspirazione sterile.
    2. Trattare le cellule con tripsina (0,7 ml di tripsina, nello 0,25% in soluzione salina tamponata con fosfato [PBS]).
    3. Ruotare delicatamente il matraccio ad angoli acuti per distribuire la tripsina lungo tutta la superficie del pallone.
    4. Continuare la rotazione per 2 minuti, mentre le celle si staccano.
    5. Dopo aver ruotato delicatamente per 2 minuti, aggiungere 10 ml di L15/FBS medium per neutralizzare la tripsina.
    6. Decantare la sospensione cellulare risultante in un tubo di centrifuga conico inferiore utilizzando una pipetta sterile e una centrifuga per 3 minuti a 130 x g.
    7. Determinare la densità delle cellule raccolte mediante il conteggio manuale utilizzando l'emocitometro.
    8. Aggiungere il volume richiesto di supporto L15/FBS per ottenere una densità di cella di 5 x 104 celle/ml.
    9. Seminare le cellule su piastre a 24 pozzi pipettando 1 mL di sospensione cellulare per pozzo per raggiungere la densità cellulare finale di 5 x 104 cellule / pozzo.
      NOTA: utilizzare preferibilmente pipette multi-erogazione per ridurre al minimo le variazioni e ridurre i tempi.
    10. Posizionare le piastre seminate in un'incubatrice in atmosfera normale a 19 °C per 48 ore prima degli esperimenti.
      NOTA: Tripsina da conservare a -20 °C; Soluzione EDTA e supporti L15/FBS a 4 °C. Regolare la temperatura di tutte le soluzioni di lavoro e dei supporti a 19 °C appena prima dell'uso.
  3. Preparazione dei mezzi di esposizione
    NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito sotto la cappa aspirante in condizioni asettiche e sterili.
    1. Preparare L15/ex mescolando 6,8 mL di soluzione salina A (fase 2.3.1), 1,14 mL di B (fase 2.3.2), 5 mL di C (fase 2.3.3) e 1,14 mL ciascuno di piruvato (punto 2.3.6) e galattosio (punto 2.3.7). Portare il volume a 100 ml utilizzando acqua distillata sterile per colture cellulari.
    2. Preparare FW mescolando 6,8 mL di soluzione salina A (2.3.1), 4,14 mL di B (2.3.2), 5 mL di C (2.3.3), 2.5 mL di D (2.3.4), 1.5 mL di E (2.3.5) e 1.14 mL ciascuno di piruvato (2.3.6) e galattosio (2.3.7). Portare il volume a 100 ml utilizzando acqua distillata sterile di grado di coltura cellulare.
    3. Quantificare le concentrazioni di ioni nel mezzo di esposizione utilizzando ICP-MS come descritto altrove12.
      NOTA: Le concentrazioni ioniche analizzate nei preparati dei mezzi sono presentate nella Tabella 2.
  4. Saggi di afflusso di zinco (65Zn)
    1. Seminare le cellule RTgutGC su piastre a 24 pozzi (5 x 104 celle/pozzo) in mezzo L15/FBS completo.
    2. Incubare per 48 ore in un incubatore con atmosfera normale a 19 °C.
    3. Regolare tutti i preparati sperimentali a pH 7,4 utilizzando 0,5 M NaOH in presenza o assenza di L-metionina (L-Met) o DL-metionina (DL-Met) a una concentrazione di 2 mM.
      NOTA: L'aggiustamento del pH dei tamponi descritti al punto 3.4.3 deve essere effettuato prima del trattamento delle cellule nel passaggio 3.4.5.
    4. Dopo il completamento del periodo di incubazione, rimuovere il mezzo dai pozzi e risciacquare abbondantemente con PBS.
    5. Aggiungere il mezzo sperimentale FW regolato a pH e consentire l'acclimatazione per 20 minuti.
    6. Esporre le cellule RTgutGC a concentrazioni nominali di 3,07, 6,14, 12,27 e 24,55 μM 65Zn(II) (come ZnCl2;~4 kBq/mL) nei mezzi descritti al punto 3.4.3.
    7. Subito dopo, tenere le cellule nell'incubatrice a 19 °C per 15 minuti.
    8. Al termine dell'incubazione di 15 minuti, aspirare il surnatante di coltura e rimuoverlo dal pozzo.
    9. Risciacquare le cellule con un mezzo FW ghiacciato (con 200 μM Zn, pH 7,4) e quindi spegnere aggiungendo il tampone da 5 mM di glicole etilenico-bis(β-aminoetiletiltere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA) (pH 7,4) per 5 minuti, per eliminare qualsiasi 65Zn(II) adsorbito.
    10. Esporre le cellule ai preparati di cui sopra in presenza o in assenza di 10 mM 2-aminobiciclo [2.2.1] eptano-2-acido carbossilico (BCH), un inibitore del trasporto di aminoacidi.
    11. Dopo il periodo di esposizione di 15 minuti, ripetere i passaggi 3.4.8 e 3.4.9.
    12. Le cellule RtgutGC saranno aderite al fondo dei pozzezze come un monostrato. Digerire le cellule utilizzando lo 0,2% di detergente caldo al dodecil solfato di sodio (SDS) (100 μL/ pozzo).
      NOTA: la soluzione SDS deve essere posizionata per 1 ora in un bagno d'acqua impostato a 90 °C prima dell'uso.
    13. Aspirare e recuperare il digestato cellulare in un tubo da 1,5 ml.
    14. Misurare la radioattività dei digest cellulari utilizzando un contatore gamma.
      NOTA: I conteggi al minuto (cpm) devono essere corretti per il decadimento radioattivo, l'attività di fondo e sono sottoposti a calcoli specifici dell'attività seguendo le formule descritte da Glover e Hogstrand13.
    15. Per quantificare la concentrazione proteica delle cellule, omogeneizzare le cellule con 500 μL di 0,5 M NaOH.
    16. Utilizzare un kit di analisi Bradford per misurare la concentrazione proteica nel campione cellulare, con albumina sierica bovina (BSA) come standard.
      NOTA: Una volta quantificata la concentrazione proteica, il tasso di assorbimento di Zn da parte delle cellule RTgutGC può essere espresso come pmoles Zn min-1 mg-1 proteina.

4. Apparente disponibilità di Zn alimentare nel salmone dell'Atlantico (Salmo salar)

NOTA: I mangimi per salmone atlantico sono stati formulati sulla base di mangimi commerciali, contenenti fonti proteiche principalmente da ingredienti di origine vegetale (cioè circa il 5% di proteine di pesce, il 10% di olio di pesce, il 68% di proteine vegetali e il 12% di olio vegetale). Due mangimi sono stati integrati con una fonte inorganica (solfato di Zn) o una fonte organica (chelato di Zn di glicina) per raggiungere una concentrazione di Zn di 150 mg / kg di mangime. Inoltre, l'ossido di ittrio (grado di alimentazione) è stato aggiunto al mangime allo 0,01% come marcatore inerte per consentire il calcolo del coefficiente di disponibilità apparente.

  1. Acclimatare il salmone atlantico (ceppo SalmoBreed, età 1+ anni, gruppi di sesso misto) nelle rispettive vasche fino a quando i pesci non sono abituati alle condizioni sperimentali.
  2. Valutare l'acclimatazione del salmone atlantico monitorandone l'assunzione giornaliera di mangime.
    NOTA: Questa prova è stata eseguita in serbatoi triplicati, quindi sono stati utilizzati un totale di sei serbatoi. Durante la prova di alimentazione la temperatura dell'acqua era di 11,9 ± 0,3 °C e la saturazione di ossigeno disciolto era del 101 ± del 5%.
  3. Nutrire il pesce con mangimi sperimentali per 11 giorni.
  4. Eutanasia del pesce per overdose usando 6 ml di soluzione stock di tricaina metanosolfonato per litro d'acqua.
  5. Raccogli un campione raggruppato di feci dal pesce dallo stesso acquario in un piatto strisciando dalla pinna ventrale all'ano.
  6. Rimuovere le feci dalla piastra con una spatola in un tubo conico da 50 ml e conservare immediatamente i campioni a -20 °C.
    NOTA: I campioni sono stati mantenuti a -20 °C fino a ulteriori analisi.
  7. Congelare i campioni di feci per 72 ore a -80 °C.
  8. Omogeneizzare manualmente manualmente il campione di feci in una polvere fine usando un pestello e un mortaio.
  9. Determinare la concentrazione di Zn e ittrio nei campioni di mangime e feci utilizzando un ICP-MS (come descritto altrove9).
  10. Determinare il coefficiente di disponibilità apparente (AAC, %) utilizzando la seguente formula:
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Results

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Valutazione di specie chimiche Zn nella frazione solubile di un mangime per salmone atlantico utilizzando un metodo SEC-ICP-MS
Il metodo SEC-ICP-MS fornisce dati sulle specie chimiche Zn presenti nella frazione solubile del mangime per salmone atlantico. La Figura 4 illustra il profilo cromatografico di Zn trovato nella frazione solubile. Questo cromatogramma è stato ottenuto utilizzando il metodo SEC-ICP-MS. Cinque picchi contenenti Zn sono stati trovati nelle frazioni solubili del mangime per salmone atlantico. Ogni picco ha un peso molecolare diverso; picco uno (~ 600 kDa), picco due e picco tre (da 32 a 17 kDa), picco quattro (da 17 a 1,36 kDa) e picco cinque (> 1,36 kDa). Il picco quattro era il più abbondante, seguito dal picco due, tre, cinque e uno, rispettivamente. Le specie chimiche Zn presenti nella frazione solubile possono avere fonti diverse perché il mangime utilizzato contiene sia ingredienti marini che vegetali e forma integrata (ad esempio, solfato di Zn). L'intervallo di peso molecolare delle specie chimiche Zn ha suggerito che questi composti potrebbero essere metalloproteine.

Solubilità in vitro dello Zn integrato nei mangimi per salmone atlantico
La solubilità di 65Zn integrata è aumentata in presenza di aminoacidi. Tutti gli amminoacidi testati hanno aumentato la solubilità di 65Zn. Metionina, glicina, cisteina, istidina e lisina hanno migliorato la solubilità di 65Zn; è stata riscontrata una maggiore solubilità con istidina e lisina (Figura 5).

Valutazione dell'assorbimento di specie Zn utilizzando un modello intestinale in vitro (RTgutGC)
L'assorbimento apicale di zinco nelle cellule RTgutGC è stato significativamente influenzato dalla presenza di L-Met o DL-Met a concentrazioni di 2 mM. Inoltre, l'impatto della metionina sull'assorbimento di Zn nelle cellule RTgutGC è stato influenzato negativamente dalla presenza di BCH (un bloccante del sistema di trasporto degli aminoacidi), rispetto alle cellule non trattate con BCH (Figura 6).

Apparente disponibilità di Zn dietetico nel salmone atlantico (Salmo salar)
Nei mangimi pratici per il salmone atlantico, la disponibilità apparente di Zn era la stessa quando si integrava con una fonte inorganica (solfato di Zn) o una fonte organica (chelato di Zn di glicina). I valori stimati per la disponibilità apparente di Zn (%, n = 3) nel salmone dell'Atlantico erano del 31% ± del 12% quando si integrava con una fonte inorganica (solfato di Zn) e del 31% ± del 3% quando si integrava una fonte organica (chelato di Zn di glicina).

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Figura 1: Una sintesi dell'approccio sistematico per valutare la disponibilità di minerali utilizzando metodi complementari. Questo approccio è stato utilizzato per studiare la disponibilità di zinco nel salmone atlantico, compresa la speciazione Zn, la solubilità Zn nell'ambiente intestinale, l'assorbimento di Zn da parte delle cellule intestinali e la disponibilità apparente di Zn. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Sintesi della procedura di estrazione dello Zn da un campione di mangime. Lo zinco viene estratto da un campione di mangime utilizzando condizioni di estrazione miti. L'estrazione è seguita dall'analisi di speciazione Zn. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Un esempio delle cellule RTgutGC 1 ora (a sinistra) e 1 settimana (a destra) dopo la semina nei palloni di coltura cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Un cromatogramma che mostra i picchi contenenti Zn dalla frazione solubile del mangime per salmone atlantico e analizzato da SEC-ICP-MS. Le tre repliche sono caratterizzate dalle linee blu, rossa e nera. Una calibrazione del peso molecolare è stata eseguita utilizzando tireoglobulina (660 kDa, monitoraggio 127I), superossido dismutasi Zn/Cu (32 kDa, monitoraggio 66Zn), mioglobina (17 kDa, monitoraggio 57Fe), vitamina B12 (1,36 kDa, monitoraggio 59Co); Picco 1 (P1): ~600 kDa, tempo di ritenzione (RT) 8,2 min; Picco 2+3 (P2+3): da 32 a 17 kDa, RT 14,2 + 15,3 min; Picco 4 (P4): da 17 a 1,36 kDa, RT 16,3 min; Picco 5 (P5): > 1,36 kDa, Rt 23,2 min. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: L'impatto degli amminoacidi sulla solubilità in vitro dello Zn integrato nei mangimi per salmone atlantico. I dati sono presentati come ± SD (n = 3). I dati sono stati analizzati attraverso ANOVA unidezionale, seguito dal test di confronto multiplo di Dunnet, confrontando la media di ciascun gruppo AA con quella del gruppo di controllo (No AA). Gli asterischi indicano il livello di significatività di ANOVA (valori P < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,001 (***) e < 0,0001 (****)). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 6: L'influenza della metionina e di un inibitore del trasporto di aminoacidi (acido 2-amminobiciclo [2.2.1] eptano-2-carbossilico, BCH, 10 mM). I dati sono presentati come ± SD (n = 3). I dati sono stati analizzati attraverso ANOVA bidirezionale, seguito dal test di confronto multiplo di Tukey con p < livello di significatività di 0,05. Le differenze post-hoc tra i gruppi sono rappresentate come lettera in apice sopra le barre; le barre con apici diversi sono statisticamente diverse (p < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Impostazioni HPLC
ColonnaColonna SEC
(30 cm x 7,8 mm, dimensione delle particelle di 5 μm) + colonna di protezione (dimensione delle particelle di 7 μm)
Intervallo di calibrazione1,0 × 104 - 5,0 × 105 Da
Fase mobile50 mM Tris-HCl + 3% MeOH (pH 7,5)
Portata0,7 ml min−1
Volume di iniezione50 μL
Impostazioni ICP–MS
Potenza in avanti1550 W
Flusso di gas al plasma15,0 L min−1
Flusso di gas di trasporto0,86 L min−1
Flusso di gas di trucco0,34 L min−1
Tempo di permanenza0,1 s per isotopo
Isotopi monitorati 127 I, 66Zn, 59Co, 57Fe

Tabella 1. Una panoramica delle impostazioni degli strumenti per HPLC e ICP-MS.

Composizione chimica (mM)L15/exMezzo sperimentale (L15/FW)
Nitrato di sodio155155
Nitrato di potassio6.26.2
Solfato di magnesio3.819.5
Nitrato di calcio1.55.4
HEPES ·55
Cloruro di magnesio-15
Piruvato di sodio5.75.7
Galattosio5.75.7
ph7.17.4
Forza ionica178258
Composizione ionica (mM)
Calcio, Ca2+ * 1,6 ± 0,15,3 ± 0,2
Magnesio, Mg2+ * 3,9 ± 0,332,5 ± 0,7
Potassio, K+ * 8.2 ± 1.28.6 ± 1.1
Sodio, Na+ * 160 ± 3157 ± 2
Nitrato, NO3- ** 164172.4
Solfato, SO4- ** 3.818.7
Cloruro, Cl- ** 1.531.5

Tabella 2. La composizione chimica e ionica dei mezzi sperimentali testati.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'assorbimento intestinale di Zn sembra essere influenzato dalla forma chimica della specie Zn13. A questo proposito, l'utilizzo dei protocolli descritti in questo articolo ha permesso lo studio sequenziale degli aspetti chimici e biologici alla base della 'disponibilità' di Zn nel salmone atlantico.

Questo studio ha riportato l'uso di un metodo di analisi della speciazione Zn. Il metodo SEC-ICP-MS ha fornito dati qualitativi relativi al peso molecolare delle specie chimiche Zn presenti nella frazione solubile di un mangime per salmone atlantico. Ciò è stato ottenuto mediante il confronto dei tempi di ritenzione degli standard di calibrazione del peso molecolare (cioè tireoglobulina (660 kDa), superossido dismutasi Zn/Cu (32 kDa), mioglobina (17 kDa) e vitamina B12 (1,36 kDa)) con i tempi di ritenzione dei picchi contenenti Zn. Una sfida riscontrata nell'analisi di speciazione Zn è stata l'identificazione delle specie chimiche Zn sconosciute a causa della mancanza di standard analitici. In SEC, la separazione delle molecole si basa sulle loro dimensioni relative ai pori nella fase stazionaria. In linea di principio, le molecole più grandi viaggeranno più velocemente, eluendo prima, e le molecole più piccole viaggeranno più lentamente, eluendo più tardi14. Di conseguenza, ogni Zn contenente picco potrebbe contenere diversi composti con peso molecolare simile15. Ciò contribuisce anche alla sfida di identificare specie chimiche Zn sconosciute. Inoltre, sono state testate diverse condizioni di estrazione lievi per l'estrazione di Zn. Lo Zn estratto era basso (~10%). Sono state applicate condizioni di estrazione miti per mantenere intatte le specie chimiche Zn ma questo potrebbe aver compromesso l'efficienza di estrazione7.

Nel test di solubilità in vitro, la solubilità di Zn integrato (come radioisotopo 65ZnCl2) ha indicato che gli amminoacidi, in particolare istidina e lisina, aumentavano la solubilità di Zn (Figura 5). L'utilizzo diretto di campioni di mangime per saggi di solubilità in vitro in condizioni gastrointestinali simulate si basa sulla conoscenza che il cambiamento nella speciazione Zn dipende dal pH16. Tuttavia, le condizioni acide all'inizio del tratto gastrointestinale potrebbero comportare qualche cambiamento nella speciazione che potrebbe essere irreversibile (ad esempio, ZnO -> ZnCl2, in presenza di HCl in condizioni acide nello stomaco). Tuttavia, la fonte di Zn utilizzata qui è ZnSO4 e la cui solubilità è stata migliorata dagli amminoacidi nel mezzo. La domanda successiva a cui rispondere era: l'aumento della solubilità può essere tradotto in disponibilità? La linea cellulare intestinale RTgutGC è stata utilizzata per studiare questa domanda. Nel contesto della nutrizione minerale negli animali, il termine "disponibilità" è difficile da definire e può essere regolato in modo differenziale nelle cellule (in vitro) rispetto a un animale (in vivo). Quindi, il termine "assorbimento" è stato usato quando si è trattato della valutazione in vitro utilizzando la linea cellulare intestinale. La linea cellulare ha fornito informazioni utili sui meccanismi di assorbimento dello Zn nell'epitelio intestinale che fa parte del complesso processo regolatorio che regola la disponibilità di minerali negli animali. Le cellule RTgutGC hanno suscitato una migliore capacità di assorbimento apicale di Zn in presenza di un amminoacido (cioè metionina; Figura 6). Tuttavia, l'apparente disponibilità in vivo non differiva significativamente tra le fonti di Zn inorganico e organico nel salmone atlantico. Nello studio di disponibilità in vivo, il confronto delle fonti di Zn è stato effettuato a livelli di Zn dietetici ben superiori al noto fabbisogno di Zn del salmone atlantico17,concentrazione totale di Zn di 150 mg/kg di mangime. Le differenze di disponibilità sono meglio visualizzate quando i livelli dietetici testati cadono nella gamma dinamica lineare prima che l'animale raggiunga la saturazione. Nel presente studio in vivo, è possibile che il salmone atlantico fosse ben saturo per osservare la differenza nell'assorbimento di Zn tra le fonti utilizzate.

In sintesi, il primo metodo ha fornito informazioni qualitative riguardanti diverse specie chimiche di Zn presenti nella frazione solubile di un mangime per salmone atlantico; il secondo metodo, la solubilità in vitro dello Zn integrato è stato migliorato in presenza di ligandi aminoacidici; il terzo metodo ha confermato che una migliore solubilità da parte degli amminoacidi può migliorare l'assorbimento all'epitelio intestinale; al contrario, il quarto metodo non è riuscito a trovare differenze nella disponibilità di Zn da fonte inorganica o organica al salmone atlantico. Per concludere, sebbene non in linea con i risultati in vivo, i protocolli in vitro hanno fornito interessanti spunti per comprendere i diversi componenti della disponibilità di Zn.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato svolto nell'ambito del progetto APREMIA (Apparent availability and requirement of minerals in Atlantic salmon, grant no. 244490) finanziato dal Norwegian Research Council.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,45 & micro; m filtro per siringheSartorius
0,45 μ m filtro a membranaPall
10 % siero fetale bovinoEurobio
1282 Compugamma Laboratory Gamma CounterLKB Wallac
piastre a 24 pozzetti (Falcon, micropiastre TPP) Thermo Fisher Scientific 
acido 2-amminobiciclo(2.2.1)eptano-2-carbossilicoSigma Aldrich A7902
Palloni per colture cellulari da 75 cm2 (Falcon, palloni per colture tissutali TPP)TPP Techno Plastic Products AG 90075
L-ArgininaSigma AldrichBradford A5006
5000001Bio-Rad
CentrifugaEppendorf 5702
L-CisteinaSigma Aldrich 30089
DL-metioninaAlfa Aesar59-51-8
D-metioninaSigma Aldrich M9375
Mangimi sperimentali per pesciSkretting
GlycineSigma Aldrich 
Colonna di protezione, TSKgel SWxl Tipo (7 μ m granulometria)Tosoh
L-IstidinaSigma Aldrich 53319
HPLC accoppiato con un acido cloridrico 7500ce ICP-MSAgilent Technologies
Emsure ACS, ISO, 37% p/p, Merck1.00317
Mulino a coltelliGM 300, Retsch Gmbh
L-15 medioInvitrogen/Gibco 
L-metionina Sigma Aldrich M9625
L-lisinaSigma Aldrich 23128
MetanoloLiChrosolv, grado HPLC, Merck1,06035
Milli-Q acqua (18,2  MΩ   cm) EMD Millipore Corporation
MioglobinaSigma Aldrich M1882
NexION 350D ICP-MSPerkin Elmer
Pasteur pipettaVWR
pHmetroinoLab
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma Aldrich 
Cellule RTgutGC Ottenuto in natura dalla Professoressa Dr. Kristin Schirmer, Dipartimento di Tossicologia Ambientale, Eawag, Istituto Federale Svizzero di Scienze e Tecnologie Acquatiche, Svizzera
Colonna SEC, TSKgel G3000SWxlSetaccio Tosoh
in acciaio inossidabile (850?μ m - 1,12 mm)Retsch
Sodio dodecil solfato (SDS)Sigma Aldrich 
Superossido dismutasi Sigma Aldrich S7571
Tireoglobulina Sigma Aldrich T1001
Tricaina metansolfonatoPharmaQ
Tris(idrossimetil)amnometanoSigma Aldrich 
Tripsina allo 0,25% in soluzione salina tampone fosfatoBiowestL0910
Versene EDTA soluzioneInvitrogen/Gibco15040-033
Vitamina B12Sigma Aldrich V2876
Chelato di zinco di glicinaFitobiotici
Solfato di zincoVilomix
10048760Kit di analisi Centrifuga 41022521083027806552436143252859

References

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