Isolamento delle cellule epiteliali salivari dalle ghiandole salivari umane per la crescita in vitro come Salispheres o Monostrati

Sommario

Presentiamo un metodo per isolare e coltivare cellule epiteliali derivate dalla ghiandola umana primaria. Queste cellule presentano modelli di espressione genica coerenti con loro di origine epiteliale salivari e possono essere coltivate come salisfere su matrici di membrana seminterrato derivate da cellule tumorali Engelbreth-Holm-Swarm o come monostrati su piatti di coltura trattati.

Abstract

Le ghiandole salivari sono un sito di notevole interesse per i ricercatori interessati a molteplici aspetti della malattia umana. Uno degli obiettivi dei ricercatori è quello di ripristinare la funzione delle ghiandole danneggiate dalle terapie radiologiche o a causa di patologie associate alla sindrome di Sjàgren. Un secondo obiettivo dei ricercatori è quello di definire i meccanismi con cui i virus si replicano all'interno del tessuto ghiandolare dove possono quindi ottenere l'accesso a fluidi salivari importanti per la trasmissione orizzontale. Questi obiettivi evidenziano la necessità di un modello di ghiandola salivare in vitro robusto e accessibile che possa essere utilizzato dai ricercatori interessati alle suddette aree di ricerca. Qui discutiamo di un semplice protocollo per isolare le cellule epiteliali dalle ghiandole salivari umane e propagarle in vitro. Il nostro protocollo può essere ulteriormente ottimizzato per soddisfare le esigenze dei singoli studi. In breve, il tessuto salivare è separati meccanicamente ed enzimaticamente per isolare singole cellule o piccoli ammassi di cellule. La selezione per le cellule epiteliali avviene placcando su una matrice di membrana seminterrato in presenza di media ottimizzati per promuovere la crescita delle cellule epiteliali. Queste colture risultanti possono essere mantenute come cluster tridimensionali, definite "salispheres", o coltivate come un monostrato su piatti di coltura dei tessuti plastici trattati. Questo protocollo si traduce nella crescita di una popolazione eterogenea di cellule principalmente epiteliali che possono essere propagate per 5-8 passaggi (15-20 raddoppi della popolazione) prima di sottoporsi alla senescenza cellulare.

Introduzione

Nei mammiferi le ghiandole salivari sono organizzate in 3 coppie di principali ghiandole salivari: le ghiandole parotide, submandibolali e sublinguali. Esiste anche una serie di ghiandole minori situate sulla lingua e sparse in tutta la cavità orale¹. Le principali ghiandole sono responsabili del volume sfuso di saliva prodotta². Oltre a fornire protezione antimicrobica attraverso fattori secreti, la saliva è importante nel processo di masticazione e lubrificazione del cibo mentre passa attraverso l'esofago². Come tale, disfunzione ghiandola salivare rappresenta un problema medico in cui i malati che non sono in grado di produrre abbastanza saliva sono più inclini a malattie in via di sviluppo come cavità dentali o candidiasi orale³. Inoltre, la riduzione della saliva comporta una maggiore difficoltà a mangiare e digerire il cibo avendo un impatto significativo sulla qualità della vita.

La disfunzione della ghiandola salivare si riscontra principalmente in pazienti affetti dalla sindrome di Sjagren, un disturbo autoimmune, o in pazienti con cancro alla testa e al collo che hanno subito una terapia di irradiola^{3,4,5 6}. Gli acini di segreteria danneggiati all'interno delle ghiandole a seguito dell'autoimmunità o della radioterapia non subiscono l'auto-rinnovamento, il che si traduce in un paziente che vive con danni irreversibili⁶. Lo studio delle ghiandole salivari ha anche raccolto l'attenzione o i ricercatori interessati ai meccanismi della patogenesi virale. Alcuni patogeni, come il citomegalovirus umano (HCMV), si replicano persistentemente all'interno delle ghiandole salivari, che poi consente la trasmissione del virus nascente a un nuovo ospite tramite saliva^7,8. Pertanto, vi è una necessità insoddisfatta di sviluppare modelli robusti e riproducibili in vitro di tessuto ghiandola salivare per affrontare e comprendere una vasta gamma di problemi medici.

Diversi modelli del sistema di ghiandola salivare murine sono stati utilizzati come punto di partenza per comprendere e caratterizzare le diverse cellule epiteliali che formano le ghiandole salivari^9,10. Esistono differenze ovvie e principali tra le ghiandole salivari umane e murine¹¹. In particolare la ghiandola parotide umana è più grande rispetto alla ghiandola submandibolare, mentre il topo submandibolare e parotide sono molto simili nella dimensione^1,2,11. Sebbene esistano linee di cellule submandibolali umane immortalate, ci sono grandi preoccupazioni che le cellule immortalate non mantengano accuratamente il fenotipo del tessuto primario e le preoccupazioni secondarie che le cellule immortalate non sono effettivamente derivate da salivare epitelio stesso¹². Per questi motivi c'è un interesse e la necessità di studiare il tessuto salivare primario dall'uomo.

Qui descriviamo un protocollo per isolare le cellule epiteliali primarie dalle ghiandole salivari umane per la coltura dei tessuti. Il nostro protocollo si basa sulle opere di Pringle et al. e Tran et al. con modifiche apportate per semplificare generalmente le loro procedure^13,14. In primo luogo, mentre il protocollo di Tran et al.richiede una lunga incubazione di cinque ore per digerire ezigmaticamente il tessuto salivare, il nostro protocollo modificato ha avuto successo con un minimo di incubazione di un'ora, simile a quella di Pringle et al. In secondo luogo, usiamo diversi enzimi per la digestione tissutale, in particolare non usiamo la trypsin come viene utilizzato nel protocollo originale di Tran et al., ma usiamo invece una miscela di dispasi e collagenase. Preferiamo evitare la trypsinnelle nei passaggi di digestione iniziali come un recente studio ha suggerito che la digestione iniziale del tessuto salivare da trypsin risultati in ridotta vitalità cellulare, forse dalla perdita di una popolazione di cellule staminali rare¹⁵. Infine, procupiamo le salisfere sulla superficie della matrice della membrana seminterrato (BMM) utilizzando un supporto disponibile in commercio originariamente formulato per la propagazione delle cellule epiteliali bronchiali. Il nostro protocollo può essere utilizzato per isolare le cellule salivari dalle ghiandole parotide, submandibolare e sublinguali. Queste cellule esprimono amilasi salivare e altri geni salivari specifici che indicano che mantengono unfenotipo simile a quello delle cellule epiteliali acinari 7 . Abbiamo generato con successo colture salivari da >50 campioni primari di tessuto umano utilizzando questa metodologia. Inoltre, le cellule salivari primarie possono essere facilmente crioconservate per l'uso in un secondo momento.

Protocollo

Questi protocolli e studi sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Cincinnati (federal-wide Assurance #00003152, protocollo IRB 2016-4183). Il tessuto salivare è comunemente resected in molte procedure chirurgiche della testa e del collo e di solito non è coinvolto dal processo maligno. Tipicamente, il tessuto della ghiandola salivava appena resected viene utilizzato entro 2-4 h dopo la rimozione dal paziente (Figura 1A).

1. Preparazione del reagente

1. Mezzo di crescita delle cellule epiteliali Bronchiali (BEGM)
   1. Aggiungere componenti dal kit fornito dal produttore (vedere la Tabella dei materiali).
   2. Lavare ogni tubo una volta con il supporto di base per garantire il trasferimento completo dei componenti. Quindi aggiungere il carbone spogliato siero bovino fetale per fare una concentrazione finale di 4% siero.
2. Buffer di lisi a i globuli rossi (RBC)
   1. Per fare 10,15 g di NH₄Cl, 5,0 g di NaHCO₃e 0,186 g di acido etilenediaminetracetico (EDTA) e portare fino a un volume finale di 200 mL utilizzando dH₂O. Quindi filtrare sterilizzare e conservare a 4 gradi centigradi.
   2. Diluire ad una concentrazione di lavoro di 1x in sterile dH₂O prima dell'uso.
3. Soluzione di dissociazione
   1. A una bottiglia da 100 mL di soluzione dispasi (vedi la Tabella dei Materiali) aggiungere 0,15 g di collagenana tipo III. Dopo che il collagenasi si è completamente dissolto, il filtro sterilizza la nuova soluzione e l'aliquota. Conservare a -20 gradi centigradi.

2. Digestione dei tessuti

1. Utilizzando una piastra di coltura tissutale di 100 mm, meccanicamente mimizzare il tessuto in pezzi fini di dimensioni da1-2mm utilizzando forbici sezionanti e pinze chirurgiche sterilizzate dall'autoclave . Il tessuto connettivo tra i pezzi deve essere tagliato per garantire una corretta separazione e facilità in ulteriori passi.
2. Aggiungere 6 mL della soluzione dispasi/collagenasi al tessuto macinato. Quindi incubare a 37 gradi centigradi per circa 30 min a 1 h.
3. Interrompere il tessuto per pipetta con una pipetta sierologica da 5 mL 15-20 volte.
4. Incubare a 37 gradi centigradi per altri 30 min a 1 h.
5. Ripetere i passaggi 2.3 e 2.4 due-tre più volte o fino a quando il tessuto assomiglia a un liquame e può facilmente passare attraverso l'apertura della pipetta (Figura 1D).
   NOT: La dimensione iniziale del campione di tessuto e come la finezza della mincing del tessuto determinerà quante volte è necessario ripetere i passaggi 2.3 e 2.4. Tipicamente, riceviamo tessuto di circa 1 cm x 1 cm di dimensione. Inoltre, è possibile monitorare la dissociazione dei tessuti utilizzando un microscopio standard di coltura dei tessuti invertiti per monitorare il progresso della dissociazione cellulare dal tessuto. Piccoli gruppi di cellule sono ideali per la crescita iniziale delle cellule salivari come salisfere.

3. Rivestimenti pozzi con matrice di membrana seminterrato

NOTA: La matrice della membrana del seminterrato (BMM) deve essere scongelata durante la notte a 4 gradi centigradi il giorno prima dell'uso. Una volta scongelato, la BMM deve essere mantenuta costantemente sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi in quanto si solidificherà rapidamente (cioè formerà un gel) a temperature più calde. Inoltre, è necessario prestare attenzione se i campioni sono stati raffreddati sul ghiaccio prima della placcatura su BMM, poiché i campioni freddi "si sciolgono" il BMM e espongono le cellule al piatto di plastica.

1. Lentamente pipetta BMM (vedi la Tabella dei Materiali) in ogni pozzo da rivestire. Distribuire uniformemente e lentamente il BMM sul pozzo.
   NOTA: Generalmente, usiamo 500 L per ogni pozzo di una piastra a sei pozzetti, ma questo volume può essere regolato per l'uso su altre varianti di piastre come 12-bene o 24-bene, o come desiderato per idrogel più spessi o più sottili.
2. Incubare le piastre rivestite a 37 gradi centigradi per almeno 15 minuti prima dell'uso per consentire al tempo BMM di solidificare.

4. Filtraggio di tessuto non digerito, lisi RBC e placcatura cellulare

1. Trasferire l'omogenea del tessuto dalla fase 2,5 a un tubo conico da 15 mL. Lavare la piastra una volta con 6 mL di fosfato gassato salina (DPBS) per trasferire le cellule rimanenti.
2. Filtrare l'omociclolo in un tubo conico da 50 mL attraverso un colino a cellule di maglia in nylon da 70 m per rimuovere il tessuto non digerito. Centrifuga cellule tese per 5 min a 500 x g.
3. Diluire 10x Buffer di lisi RBC in sterile dH₂O per fare una soluzione di lavoro 1x.
4. Aspirare il super-attuoso. Quindi riavviare il pellet cellulare in 10 mL di 1x buffer di lisi RBC. Incubare per 5 min a 37 gradi centigradi.
5. Aggiungere 20-25 mL di DPBS per neutralizzare il buffer di lisi RBC e ridurre al minimo la lisi delle cellule salivari. Centrifuga per 5 min a 500 x g.
   NOTA: Dopo il trattamento con buffer di lisi RBC, il pellet cellulare deve essere bianco. Il colore rosso nel pellet indica che non tutti i RBC sono stati completamente lised. Ripetere i passaggi da 4.4 a 4.5 se necessario per la lisi completa di tutti i RBC.
6. Aspirare il super-attuoso. Risospendere il pellet in 1-2 mL di BEGM per bene quindi posizionare le celle risospese su pozzetti rivestiti BMM. Incubare a 37 gradi centigradi.
7. Una volta placcate su BMM, le cellule si formeranno in strutture sferiche o "salispheres" in un periodo di 2-3 giorni. Le cellule possono essere mantenute come salisphere per circa 5-7 giorni prima che il BMM inizi a degradarsi permettendo alle cellule di accedere e aderire alla plastica e crescere come un monostrato.

5. Sottolanza delle salisfere e manutenzione su BMM

1. Aspirati i supporti dai pozzi, quindi aggiungere 1 mL di soluzione dispasi/collagenase ad ogni pozzo e incubare a 37 s per 15 min o fino a quando BMM è per lo più sciolto.
2. Trasferire le cellule in un tubo conico da 15 mL e lavare i pozzi una volta con DPBS per ottenere le cellule rimanenti. Centrifuga per 5 min a 500 x g.
3. Aspirare il super-attuoso. Risospendere il pellet in 2 mL di trypsin poi incubare a 37 s per 15 min.
4. Neutralizzare la trypsin utilizzando qualsiasi supporto completo contenente 10% siero. Centrifuga per 5 min a 500 x g.
5. Aspirare il super-attuoso. Risospendere le cellule in DPBS per rimuovere supporti residui, trypsin e siero. Centrifuga per 5 min a 500 x g.
6. Aspirare il super-attuoso. Risospendere in BEGM e placare le celle risospese su piatti di coltura rivestiti BMM solidificati. Le cellule sospese possono anche essere placcate direttamente sulla coltura cellulare trattata piatti per la proliferazione come un monostrato. Per ulteriori informazioni sulla crescita delle cellule salivari come monostrato, vedere la sezione 6. Le cellule coltivate su BMM o su plastica devono essere alimentate con BEGM fresco ogni 2-3 giorni.
7. Coltura le cellule in un'incubatrice umidificata mantenuto a 37 gradi centigradi con 5% DI CO₂.

6. Sotturazione delle salisfere su piatti di coltura dei tessuti plastici trattati

NOTA: Se si mantengono le cellule come un monostrato sulla plastica, iniziare da questo passaggio. Il seguente protocollo si applica alle cellule che crescono in un piatto da 100 mm.

1. Aspirare i media. Lavare una volta con DPBS per rimuovere i supporti residui.
2. Aggiungere 2 mL di trypsin quindi incubare a 37 gradi centigradi per 15 min, o fino a quando le cellule si sono completamente staccate.
3. Neutralizzare la trypsin usando 4 mL di qualsiasi supporto completo contenente 10% siero. Trasferire le cellule in un tubo conico da 15 mL.
4. Lavare la piastra una volta con circa 5 mL di DPBS per raccogliere le cellule rimanenti. Centrifuga per 5 min a 500 x g.
5. Aspirare il super-attuoso. Risospendere le celle in 6-10 mL di DPBS per rimuovere i supporti residui.
6. Centrifuga per 5 min a 500 x g.
7. Aspirare il supernatante e risospendere in BEGM. Piatto di cellule su piatti di coltura di tessuto plastico trattati. Alimentazione con BEGM fresco ogni 2-3 giorni.
8. Coltura le cellule in un'incubatrice umidificata mantenuto a 37 gradi centigradi con 5% DI CO₂.

7. Crioconservazione delle cellule

NOTA: La crioconservazione delle cellule può essere effettuata da una singola sospensione cellulare proveniente da cellule coltivate salisphere o monostrato.

1. Contare le celle su un ematocitometro per calcolare la quantità totale di cellule presenti.
2. Centrifuga per 5 min a 500 x g.
3. Aspirare il super-attuoso. Risospendere il pellet in BEGM con il 10% di zolfo dimetilo (DMSO). La concentrazione delle cellule deve essere da 2 x 10⁶ cellule/mL a 10 x 10⁶ cellule/mL.
4. Cellule aliquote in sterili tubi di stoccaggio criogenici. Mettere i tubi in un rack di schiuma isolante e incubare a -80 gradi durante la notte per congelare lentamente le cellule.
5. Il giorno successivo, posizionare i tubi in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine.
   NOTA: Le cellule devono essere rapidamente scongelate a 37 gradi centigradi. Al momento dello scongelamento, le celle devono essere incollate a 500 x g e il supporto contenente DMSO deve essere rimosso prima della placcatura.

Risultati

Due-tre giorni dopo la placcatura delle cellule dal tessuto digerito su BMM, le cellule formeranno facilmente piccoli cluster che continueranno ad espandersi fino a 15-20 cellule per cluster (Figura 2A). I detriti cellulari e le cellule morte staccate sono tipicamente visti e dovrebbero essere rimossi aspirando e reintegrandosi con supporti freschi. Le cellule continueranno a proliferare come salifere per circa 3-10 giorni, o finché lo strato BMM rimane intat...

Discussione

La disfunzione salivare rappresenta una preoccupazione per la qualità della vita per coloro che soffrono di sindrome di Sjagren e per coloro che sono sottoposti a radioterapia per tumori adiacenti alle ghiandole salivari^{3,4,5, 16}. Una terapia proposta per il trattamento di questi pazienti è quella di far crescere cellule staminali salivari funzionali o organoidi in vitro, che possono quindi es...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di coltura da 100 mm	Thermo Scientific	172931
Provette coniche da 15 mL	Thermo Scientific	339651
Provette coniche da 50 mL	Thermo Scientific	339653
Terreni di crescita delle cellule epiteliali bronchiali	Lonza	CC-3171	Aggiungere il kit di proiettili secondo le istruzioni del produttore. Integrare con 20 ml di siero strippato al carbone.
Filtro cellulare 70 &; micro; m rete di nylon	Fisher	22-363-548
Siero fetale bovino spogliato al carbone	Gibco	12676-029
Collagenasi tipo III	Worthington	LS004182	Store a 4 °C.
Tubo criogenico	Fisher	5000-0020
Dispase	Cell Applications	07923	Sciogliere la collagenasi per ottenere uno stock dello 0,15% (p/v). Filtrare, sterilizzare, quindi conservare a -20 °C.
Forbici da dissezione	Fisher	08-940
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Estratto di membrana basale	Cultrex	3432-005-01	Scongelare a 4 ° C almeno 24 ore prima dell'uso. Maneggiare sempre con ghiaccio.
Piastre di coltura a sei pozzetti	Falcon	353046
Pinze chirurgiche	Fisher	22-079-742
Soluzione di tripsina-EDTA	Corning	25-052-CI