Caratterizzazione semiautomatica PD-L1 ed enumerazione delle cellule tumorali circolanti da pazienti affetti da cancro del polmone a cellule non piccole mediante immunofluorescenza

Sommario

La caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) è un argomento popolare nella ricerca traslazionale. Questo protocollo descrive un test di immunofluorescenza semi-automatica (IF) per la caratterizzazione PD-L1 e l'enumerazione dei CTC in campioni di pazienti affetti da cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC).

Abstract

Le cellule tumorali circolanti (CTC) derivate dal tumore primario vengono versate nel flusso sanguigno o nel sistema linfatico. Queste cellule rare (1,10 cellule per mL di sangue) giustificano una prognosi infamabile e sono correlate con una sopravvivenza complessiva più breve in diversi tipi di cancro (ad esempio, seno, prostata e colorettale). Attualmente, il sistema di cattura CTC basato su perline magnetico anti-EpCAM è il test standard d'oro approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti per enumerare i CTC nel flusso sanguigno. Questo test si basa sull'uso di perline magnetiche rivestite con marcatori anti-EpCAM, che colpiscono specificamente le cellule tumorali epiteliali. Molti studi hanno dimostrato che epCAM non è il marcatore ottimale per il rilevamento CTC. Infatti, i CTC sono una sottopopolazione eterogenea di cellule tumorali e sono in grado di subire una transizione epiteliale-mesenferica (EMT) associata alla proliferazione metastatica e all'invasione. Questi CTC sono in grado di ridurre l'espressione del marcatore epiteliale della superficie cellulare EpCAM, aumentando al contempo marcatori mesenchymici come la vimentina. Per affrontare questo ostacolo tecnico, sono stati sviluppati altri metodi di isolamento basati sulle proprietà fisiche dei CTC. Le tecnologie microfluidiche consentono un approccio privo di etichette all'arricchimento del CTC da campioni di sangue intero. La tecnologia microfluidica a spirale utilizza le forze di trascinamento inerziali e Decano con flusso continuo in canali curvi generati all'interno di un chip microfluidico a spirale. Le cellule sono separate in base alle differenze di dimensioni e plasticità tra le cellule del sangue normali e le cellule tumorali. Questo protocollo descrive in dettaglio i diversi passaggi per caratterizzare l'espressione programmata death-ligand 1 (PD-L1) dei CTC, combinando un dispositivo microfluidico a spirale con set di marcatori immunofluorescenza (IF) personalizzabili.

Introduzione

I TL (TL) specifici dell'antigene tumorale svolgono un ruolo cruciale nella risposta ai tumori attraverso un processo noto come "sorveglianza immunitaria" del cancro. Le loro funzioni antitumorali sono potenziate da anticorpi di blocco del checkpoint immunitario come gli inibitori ctLA-4 e gli inibitori PD-1/PD-L1. Nel cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC), le terapie anti-PD-1/PD-L1 si traducono in tassi di risposta che vanno dallo 0%-17% nei pazienti con tumori PD-L1-negativi e 36%-100% in quelli che esprimono PD-L1. Le risposte robuste al blocco PD-1/PD-L1 osservate nel melanoma e nel NSCLC sono mostrate da prove di un miglioramento del tasso di risposta....

Protocollo

I campioni sono stati raccolti prospetticamente nell'ambito della coorte CIRCAN ("CIRculating CANcer") con sede presso l'Ospedale Universitario di Lione in seguito al consenso scritto del paziente. Questo studio è stato integrato nella coorte CIRCAN_ALL. Lo studio CIRCAN_ALL è stato riconosciuto come non interventistico dal CPP South-East IV datato 04/11/2015 con il riferimento L15-188. Una versione modificata è stata riconosciuta come non interventista il 20/09/2016 sotto il riferimento L16-160. Lo studio CIRCAN_ALL è stato dichiarato al corrispondente IT e alla libertà dell'Hospice civils de Lyon il 01/12/2015, con il riferimento 15-131. La raccolta del sangue è sta....

Risultati

Il primo prerequisito era quello di ottenere raccolte incontaminate (senza agenti infettive) di CTC per la coltura dei tessuti ed evitare il background IF generato. Il protocollo di decontaminazione ha permesso la pulizia di tutti i tubi e pompe, e ha portato alla raccolta di CTC con un buon tasso di recupero senza contaminazione batterica. I campioni arricchiti sono stati confrontati senza e con il flusso di lavoro del protocollo di decontaminazione del dispositivo microfluidico a spirale. Per convalidare il protocollo .......

Discussione

Nel presente studio sono stati sollevati due punti principali, il primo per quanto riguarda l'esecuzione del flusso di lavoro per il suo trasferimento ad applicazioni cliniche e il secondo relativo alla diminuzione della soggettività per l'analisi delle immagini a fluorescenza ottenute.

Un flusso di lavoro performante e ottimizzato per l'enumerazione CTC è stato inizialmente determinato utilizzando un saggio IF personalizzabile dopo l'arricchimento delle celle tramite un sistema microfluidico .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4',6-diamidino-2-phé nylindole (DAPI)	Ozyme	BLE 422801	Condizioni di conservazione: +4 gradi C
BD Facs Clean – 5 L	BD Biosciences	340345	Detergente a base di candeggina. Condizioni di conservazione:
Candeggina a temperatura ambiente 1% Soluzione detergente 100 ml	Biolidics	CBB-F016012	Candeggina. Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Siero Bovino Albumina (BSA) 7,5%	Sigma	A8412	Condizioni di conservazione: +4 ° C
Anticorpo monoclonale CD45 (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	Condizioni di conservazione: +4 C
CellProfiler Software	di analisi delle immagini	Broad Institute
Dispositivo centrifuga	Hettich	4706	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Provetta da centrifuga 50 mL	Corning	430-829	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Provetta da centrifuga 15 mL	Biolidics	CBB-F001004-25	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
ClearCell FX-1 System	Biolidics	CBB-F011002	Dispositivo microfluidico a spirale. Condizioni di conservazione:
Detergente Coulter Clenz a temperatura ambiente – 5 L	Beckman Coulter	8448222	Reagente detergente multiuso. Condizioni di conservazione: Chip
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	a temperatura ambiente. Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Cytospin 4	ThermoFisher	A78300003	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Diluente Additivo Reagente – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	Condizioni di conservazione: +4 ° C
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	Camera per campioni con cotone. Condizioni di conservazione:
Agente bloccante FcR	Miltenyi Biotec	130-059-901	Condizioni di conservazione: +4 gradi C
Siero fetale di vitello (FCS)	Gibco	10270-106	Condizioni di conservazione: +4 C
Fluoromount	Sigma	F4680	Soluzione di montaggio. Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Fungizone - 50 mg	Bristol-Myers-Squibb	90129TB29	Reagente antimicotico. Condizioni di conservazione: +4 ° C
FX1 Cannuccia di ingresso con tappo di blocco	Biolidics	CBB-F013005	Cannuccia. Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
KovaSlide	Dutscher	50126	Vetrino a camera. Condizioni di conservazione:
Anticorpo monoclonale PanCK a temperatura ambiente (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Condizioni di conservazione: +4 ° C
Paraformaldeide 16%	ThermoFisher	11490570	Soluzione di fissaggio. Condizioni di conservazione: +4 °
C PD-L1 anticorpo monoclonale (clone 29E2A3) - Ficoeritrina	BioLegend	BLE329706	Condizioni di conservazione: +4 C
Petri Dish	Dutscher	632180	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Condizioni di conservazione: +4 gradi C
Soluzione salina tamponata con fosfato Grado ultra puro 1x - 1 L	1st Base Laboratory	BUF-2040-1X1L	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Soluzione anti-legante. Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Vetrini in polilisina	ThermoFisher	J2800AMNZ	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Polipropilene Tubo conico 50 mL	Falcon	352098	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Tampone di lisi RBC – 100 mL	G Biosciences	786-649	Condizioni di conservazione: +4 ° C
Tampone di lisi dei globuli rossi – 250 mL	G Biosciences	786-650	Condizioni di conservazione: +4 gradi C
Tampone di Risospensione (RSB)	Biolidics	CBB-F016003	Condizioni di conservazione: +4 gradi C
Shandon Cytopsin4 centrifuga	ThermoFisher	A78300003	Centrifuga dedicata. Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Isolatore al silicio	Grace bio-Labs	664270	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Sterile Acqua deionizzata - 100 mL	1st Base Laboratory	CUS-4100-100ml	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Dritto Microscopio fluorescente Axio Imager D1	Zeiss Condizioni di		conservazione: Temperatura ambiente
Chirurgico Sterile Sacca	SPS Laboratoires	98ULT01240	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Siringa BD Discardit II 20 mL sterile	BD Biosciences	300296	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Filtro siringa 0,22 & micro; m 33 mm sterile	ClearLine	51732	Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Zen lite 2.3 Lite Software	associato al microscopio	Zeiss

Software del microfluidico a temperatura ambiente