Sintesi di uno standard deuterato per la quantificazione di 2-Arachidonoylglycerol a Caenorhabditis elegans

Sommario

Questo lavoro descrive un metodo robusto e diretto per rilevare e quantificare l'endocannabinoide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. Uno standard analitico deuterato che abbiamo preparato e utilizzato per la quantificazione di 2-AG da diluizione isotopica e cromatografia liquida-elettrospray-spettrometria di massa di mitinazione -tandem (LC-ESI-MS/MS).

Abstract

Questo lavoro presenta un metodo per preparare uno standard analitico per analizzare la glicerel 2-aracidonoyl (2-AG) qualitativamente e quantitativamente mediante cromatografia liquida-elettrospray ionization-tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS). Gli endocannabinoidi sono conservati mediatori lipidici che regolano più processi biologici in una varietà di organismi. In C. elegans, 2-AG è stato trovato per possedere ruoli diversi, tra cui la modulazione della formazione di dauer e metabolismo del colesterolo. La presente relazione descrive un metodo per superare le difficoltà associate ai costi e alla stabilità degli standard deuterati necessari per la quantificazione dei 2 AG. La procedura per la sintesi dello standard è semplice e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio, senza la necessità di competenze di sintesi organica o di attrezzature speciali. Inoltre, viene descritta una modifica del metodo di Folch per estrarre lo standard deuterato dalla cultura di C. elegans. Infine, viene descritto un metodo quantitativo e analitico per rilevare 2-AG utilizzando l'analogico 1-AG-d₅ etichettato isotopicamente stabile, che fornisce risultati affidabili in una corsa fast-cromatica. La procedura è utile per studiare i molteplici ruoli di 2-AG in C. elegans, pur essendo applicabile ad altri studi di metaboliti in organismi diversi.

Introduzione

Gli endocannabinoidi regolano i processi biologici multipli in una varietà di organismi e sono conservati mediatori lipidici¹. I primi endocannabinoidi scoperti e più caratterizzati sono l'anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) e il glicerolo 2-arachidonoyl (2-AG). Gli endocannabinoidi svolgono molti ruoli critici, compresi quelli coinvolti nei sistemi di ricompensa del cervello, nonché la tossicodipendenza, la memoria, l'umore e i processi metabolici². AEA e 2-AG sono sintetizzate solo quando necessario e hanno una breve durata di vita, e sono degradate attraverso la ricarica delle proteine di trasporto e l'idrolisi....

Protocollo

1. 1-AG-d₅ preparazione

NOTA: Per ottenere 1-AG-d₅ come standard interno deuterato per i test quantificanti, seguire il protocollo come descritto di seguito.

1. Protezione differenziale
   1. Per proteggere solo gli alcoli primari, aggiungere prima 38 mg di glicerol-d₈ a un tubo di reazione da 10 mL utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere un agitatore magnetico.
   2. Aggiungere 5 mL di dicloromagno (DCM) utilizzando una siringa Hamilton da 5 mL e riempire il tubo con N₂ secco per produrre un'atmosfera inerte.
   3. Preparare un bagno con una flacone Dewar poco profonda pie....

Risultati

Un analogo con etichetta isotopica è statosintetizzato con successo da acido aracilolo e arachidonico disponibile in commercio utilizzando un metodo sintetico in 3 fasi (Figura 2, Figura 3). Questi passaggi sono semplici e non richiedono attrezzature sofisticate, condizioni appositamente controllate o costosi reagenti. Così, questo metodo è robusto e può essere esteso con successo per sintetizzare monoacylgliglycerides.......

Discussione

Gli endocannabinoidi sono una classe di lipidi che sono stati implicati nella regolazione della formazione di dauer in C. elegans⁷. Più specificamente, la sintesi di acidi grassi polinsaturi (PUFA) è importante per il traffico di colesterolo e lo sviluppo riproduttivo dei vermi. Si rivela qui che 2-AG, un acido arachidonico contenente endocannabinoidi, è responsabile della restituzione della larva dauer al suo ciclo normale in vermi che hanno alterato il metabolismo del colesterolo

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4-dimetilamminopiridina	Sigma-Aldrich	107700	grado di reagente, 99%
antiossidante BHT	Sigma-Aldrich	W21805
Acido arachidonico	Sigma-Aldrich	10931
Glicerolo-d8	Sigma-Aldrich	447498
Rivelatore di massa Triplo Quadrupolo	Thermo Scientific		TSQ Quantum Access Max
N,N'-diisopropilcarbodiimmide	Sigma-Aldrich	D125407
spettrometro NMR	Bruker		Avance II 300 MHz
HPLC a fase inversa	Thermo Fisher	25003-052130	C18 Hypersil-GOLD (50 x 2,1 mm)
terz-butildimetilsilil cloruro Sigma-Aldrich		190500	97%
fluoruro di tetrabutilammonio	Sigma-Aldrich	216143	1.0M in THF
UHPLC System	Thermo Scientific		Ultimate 3000 RSLC Dionex
ceppo di verme N2 Bristol	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

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