Saggio di formazione Presynapse utilizzando perline dell'organizzatore della presynapsi e cultura "Neuron Ball"

Shumaia Parvin; Renoma Takeda; Yukio Sasaki

doi:10.3791/59893

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Articolo metodologico

Saggio di formazione Presynapse utilizzando perline dell'organizzatore della presynapsi e cultura "Neuron Ball"

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DOI:

10.3791/59893

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2 agosto 2019

Shumaia Parvin¹ , Renoma Takeda¹ , Yukio Sasaki¹

¹Functional Structure Biology Laboratory, Department of Medical Life Science, Yokohama City University Graduate School of Medical Life Science

In questo articolo

Sommario

La formazione della presilnapsi è un processo dinamico che include l'accumulo di proteine sinaptiche nell'ordine corretto. In questo metodo, la formazione del presilnapsi è innescata da perline coniugate con una proteina organizzatore presilnapse su fogli assonali di cultura "palla di neurone", in modo che l'accumulo di proteine sinaptiche sia facile da analizzare durante la formazione del presilnapsi.

Abstract

Durante lo sviluppo neuronale, la formazione di sinapsi è un passo importante per stabilire circuiti neurali. Per formare le sinapsi, le proteine sinaptiche devono essere fornite in ordine appropriato mediante il trasporto da corpi cellulari e/o traduzioni locali in sinapsi immature. Tuttavia, non è completamente compreso come le proteine sinaptiche si accumulano nelle sinapsi in ordine corretto. Qui, presentiamo un nuovo metodo per analizzare la formazione presinaptica utilizzando la combinazione della coltura della palla del neurone con perline per indurre la formazione di presynapsi. Le sfere di neuroni che sono aggregati di cellule neuronali forniscono fogli assonali lontani dai corpi cellulari e dai dendriti, in modo che i deboli segnali fluorescenti di presynapsi possano essere rilevati evitando segnali schiaccianti di corpi cellulari. Come perline per innescare la formazione di presynapsi, usiamo perline coniugate con transmembrana ripetuta ricca di leucina neurone 2 (LRRTM2), un organizzatore pressinaptico eccitatorio. Utilizzando questo metodo, abbiamo dimostrato che il trasportatore di glutammato vescicolare 1 (vGlut1), una proteina vescica sinaptica, si è accumulata nei presilnapsi più velocemente di Munc18-1, una proteina della zona attiva. Munc18-1 ha accumulato la traduzione in modo dipendente nella pressinapse anche dopo la rimozione dei corpi cellulari. Questo risultato indica l'accumulo di Munc18-1 per traduzione locale negli assoni, non il trasporto da corpi cellulari. In conclusione, questo metodo è adatto per analizzare l'accumulo di proteine sinaptiche nei presilnapsi e la fonte di proteine sinaptiche. Poiché la cultura della palla neuronale è semplice e non è necessario utilizzare un apparato speciale, questo metodo potrebbe essere applicabile ad altre piattaforme sperimentali.

Introduzione

La formazione di sinapsi è uno dei passaggi critici durante lo sviluppo dei circuiti neurali¹^,²^,³. La formazione di sinapsi specializzate composti da post-sinapsi è un processo complesso e multifase che prevede un adeguato riconoscimento di assoni e dendriti, formazione di zona attiva e densità post-sinaptica e un corretto allineamento canali ionici e recettori del neurotrasmettitore¹^,². In ogni processo, molti tipi di proteine sinaptiche si accumulano in questi compartimenti specializzati in tempi adeguati trasportan....