Questo articolo descrive in dettaglio l'uso di un kit di preparazione della libreria a catena di reazione a catena multiplea Vengono descritte entrambe le fasi di analisi wet-bench e dei dati.
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Articolo metodologico
Rilevamento oncogenico della fusione genica utilizzando la reazione della catena di polimerasi multiplex ancorata seguita dal sequenziamento di nuova generazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le fusioni geniche spesso contribuiscono al fenotipo oncogenico di molti tipi diversi di cancro. Inoltre, la presenza di alcune fusioni in campioni di pazienti oncologici spesso influenza direttamente la diagnosi, la prognosi e/o la selezione della terapia. Di conseguenza, l'accurata rilevazione delle fusioni geniche è diventata una componente critica della gestione clinica per molti tipi di malattie. Fino a poco tempo fa, la rilevazione clinica della fusione genica era effettuata prevalentemente attraverso l'uso di saggi unigene. Tuttavia, l'elenco in continua crescita delle fusioni geniche con significato clinico ha creato la necessità di valutare contemporaneamente lo stato di fusione di più geni. I test basati sul sequenziamento di nuova generazione (NGS) hanno soddisfatto questa domanda attraverso la capacità di sequenziare l'acido nucleico in modo massicciamente parallelo. Sono ora disponibili per l'uso nella diagnostica molecolare clinica, ognuno con i propri punti di forza e di debolezza, che utilizzano diverse strategie per l'arricchimento dei bersagli genici. Questo articolo descrive l'uso dell'arricchimento del bersaglio e della preparazione della biblioteca basati su PCR (AMP) ancorato seguito da NGS per valutare le fusioni geniche nei campioni clinici del tumore solido. AMP è unico tra gli approcci di arricchimento basati sull'amplicon in quanto identifica le fusioni geniche indipendentemente dall'identità del partner di fusione. Di seguito sono riportate sia le fasi di analisi della panca umida che quelli che garantiscono un rilevamento accurato della fusione genica da campioni clinici.
Introduzione
La fusione di due o più geni in una singola entità trascrizionale può avvenire come risultato di variazioni cromosomiche su larga scala, tra cui delezioni, duplicazioni, inserimenti, inversioni e traslocazioni. Attraverso il controllo trascrizionale alterato e/o le proprietà funzionali alterate del prodotto genetico espresso, questi geni di fusione possono conferire proprietà oncogene alle cellule tumorali1. In molti casi, i geni di fusione sono noti per agire come driver oncogeni primari attivando direttamente la proliferazione cellulare e le vie di sopravvivenza.
La rilevanza clinica delle fusioni geniche per i paz....
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Protocollo
1. Preparazione della biblioteca e sequenziamento
- Considerazioni generali sul saggio e passi di pre-saggio
- Le esecuzioni di analisi sono in genere costituite da sette campioni clinici e da un controllo positivo (anche se il numero di campioni per ogni esecuzione di preparazione della libreria può essere regolato in base alle esigenze). Utilizzare un controllo positivo che contenga almeno diverse fusioni genetiche (che il test è obiettivo) che sono state confermate da un produttore e/o sono state confermate da una metodologia ortogonale. Un controllo non modello (NTC) deve essere incluso come campione aggiuntivo in ogni esecuzione d....
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Risultati
Illustrato Figura 3, Figura 4 e Figura 5 sono screenshot dall'interfaccia utente di analisi che dimostra i risultati di un esempio di adenocarcinoma polmonare. Nella figura 3, viene visualizzato il riepilogo dell'esempio (in alto) che elenca le cosiddette fusioni di prove complesse, nonché lo stato QC (cerchiato in rosso). La fusione ADCK4-NUMBL (di cui sono elencati 3 isoformi) viene immediata.......
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Discussione
L'arricchimento e la preparazione della libreria basati su PCR multiplex ancorati seguiti dal sequenziamento di nuova generazione sono adatti per la valutazione della fusione genica multiplexneista in campioni di tumore clinici. Concentrandosi sull'input di RNA piuttosto che sul DNA genomico, si evita la necessità di sequenziare introni di grandi dimensioni e ripetitivi. Inoltre, poiché questo approccio amplifica le fusioni geniche indipendentemente dall'identità del partner di fusione, vengono rilevate nuove fusioni. Qu.......
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Dichiarazioni
D.L.A. ha ricevuto commissioni di consulenza da Bayer Oncology, Genentech, AbbVie e Bristol Myers Squibb. K.D.D. ha ricevuto viaggi sponsorizzati da ArcherDx.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla Molecular Pathology Shared Resource dell'Università del Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) e dal Colorado Center for Personalized Medicine.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Utilizzato per la diluizione del |
| TNA 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Utilizzato nel pooling di librerie |
| 25 mL Serbatoio di reagenti con divisore | USA Scientific | 9173-2000 | Per l'uso con pipettatori multicanale e grandi volumi di reagenti |
| Semi-gonna TemPlate a 96 pozzetti Piastra PCR da 0,1 mL-naturale | USA Scientific | 1402-9700 | Piastra utilizzata per le fasi del termociclatore |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Utilizzato nella purificazione dopo diverse fasi di analisi |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Utilizzato nell'estrazione TNA |
| Archer FusionPlex Solid Tumor Kit | ArcherDX | AB0005 | Questo kit contiene la maggior parte dei reagenti necessari per eseguire la preparazione della libreria per il sequenziamento Illumina (sono disponibili anche kit per il sequenziamento Ion Torrent) |
| Blocco freddo, 96 pozzetti | Light Labs | A7079 | Utilizzato per mantenere i campioni refrigerati in varie fasi |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Utilizzato per il lavaggio delle microsfere |
| Quantificazione della libreria per lo standard di controllo interno Illumina | Kapa Biosystems | KK4906 | Utilizzato per la quantificazione delle librerie |
| Primer per quantificazione di librerie e miscela ROX Low qPCR | Kapa Biosystems | KK4973 | Utilizzato per la quantificazione di librerie |
| Standard di quantificazione per librerie | Kapa Biosystems | KK4903 | Utilizzato per la quantificazione di librerie |
| Piastra magnetica, 96 pozzetti (grado N38) | Alpaqua | A32782 | Utilizzato nelle fasi di purificazione delle perle |
| Set di adattatori MBC B | ArcherDX | AK0016-48 | Adattatori che contengono indici specifici del campione per consentire il sequenziamento multiplex |
| Micro Centrifuga | USA Scientific | 2641-0016 | Utilizzato per la centrifuga di provette PCR |
| MicroAmp EnduraPlate Piastra ottica a 96 pozzetti | Thermo-Fisher | 4483485 | Utilizzato per la quantificazione di librerie QCpre-Seq |
| Pad di compressione per film ottici Microamp | Biosystems | applicati 4312639 | Utilizzato per la quantificazione di librerie |
| Mini filatore per piastre | Labnet | MPS-1000 | Utilizzato per la raccolta del liquido sul fondo dei pozzetti della piastra Kit |
| di reagenti MiSeq v3 (600 cicli) | Illumina | MS-102-3003 | Contiene i componenti necessari per un ciclo di sequenziamento MiSeq |
| Sistema MiSeqDx | Strumento di sequenziamento | ||
| Modello 9700 Termociclatore | Biosistemi | Utilizzato per diverse fasi durante acqua | |
| priva di nucleasi | Ambion | 9938 | Utilizzato come diluente |
| generale Coperture ottiche per piastre PCR ABI a 96 pozzetti | Thermo-Fisher | 4311971 Utilizzato per la quantificazione della libreria QCpre-Seq | |
| Stazione di lavoro PCR Modello 600 | Sistemi di pulizia dell'aria | BZ10119636 | Fasi di analisi da banco umido eseguite in questa "scatola d'aria morta" |
| Proteinasi K | Qiagen | 1019499 | Utilizzato nell'estrazione del TNA |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | strumento qPCR utilizzato per PreSeq e quantificazione della libreria |
| Kit di analisi HS dell'RNA Qubit | Life Technologies | Q32855 | Utilizzo per determinare la concentrazione di RNA nei campioni di TNA |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Utilizzato per la decontaminazione generale dell'RNasi delle aree di lavoro |
| Materiale di riferimento per RNA di fusione tumorale FFPE Seraseq v2 | SeraCare | 0710-0129 | Utilizzato come controllo positivo del test |
| Idrossido di sodio | Fisher | BP359-212 | Utilizzato nelle fasi di pulizia e per l'impostazione del sequenziamento |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Componente del test PreSeq QC |
| TempAssure PCR 8 strisce di provette | USA Scientific | 1402-2700 | Utilizzato per la miscelazione di reagenti e campioni, ecc. |
| Modello RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Utilizzato per la copertura di piastre a 96 pozzetti |
| Micropiastra a 96 pozzetti con fondo a U | LSP MP8117-R | Utilizzato durante la purificazione delle microsfere |
Riferimenti
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia ....
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Ristampe e permessi
