Articolo metodologico

Rilevamento oncogenico della fusione genica utilizzando la reazione della catena di polimerasi multiplex ancorata seguita dal sequenziamento di nuova generazione

DOI:

10.3791/59895

⸱

5 luglio 2019

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Colorado - Anschutz Medical Campus

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo descrive in dettaglio l'uso di un kit di preparazione della libreria a catena di reazione a catena multiplea Vengono descritte entrambe le fasi di analisi wet-bench e dei dati.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le fusioni geniche spesso contribuiscono al fenotipo oncogenico di molti tipi diversi di cancro. Inoltre, la presenza di alcune fusioni in campioni di pazienti oncologici spesso influenza direttamente la diagnosi, la prognosi e/o la selezione della terapia. Di conseguenza, l'accurata rilevazione delle fusioni geniche è diventata una componente critica della gestione clinica per molti tipi di malattie. Fino a poco tempo fa, la rilevazione clinica della fusione genica era effettuata prevalentemente attraverso l'uso di saggi unigene. Tuttavia, l'elenco in continua crescita delle fusioni geniche con significato clinico ha creato la necessità di valutare contemporaneamente lo stato di fusione di più geni. I test basati sul sequenziamento di nuova generazione (NGS) hanno soddisfatto questa domanda attraverso la capacità di sequenziare l'acido nucleico in modo massicciamente parallelo. Sono ora disponibili per l'uso nella diagnostica molecolare clinica, ognuno con i propri punti di forza e di debolezza, che utilizzano diverse strategie per l'arricchimento dei bersagli genici. Questo articolo descrive l'uso dell'arricchimento del bersaglio e della preparazione della biblioteca basati su PCR (AMP) ancorato seguito da NGS per valutare le fusioni geniche nei campioni clinici del tumore solido. AMP è unico tra gli approcci di arricchimento basati sull'amplicon in quanto identifica le fusioni geniche indipendentemente dall'identità del partner di fusione. Di seguito sono riportate sia le fasi di analisi della panca umida che quelli che garantiscono un rilevamento accurato della fusione genica da campioni clinici.

Introduzione

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La fusione di due o più geni in una singola entità trascrizionale può avvenire come risultato di variazioni cromosomiche su larga scala, tra cui delezioni, duplicazioni, inserimenti, inversioni e traslocazioni. Attraverso il controllo trascrizionale alterato e/o le proprietà funzionali alterate del prodotto genetico espresso, questi geni di fusione possono conferire proprietà oncogene alle cellule tumorali1. In molti casi, i geni di fusione sono noti per agire come driver oncogeni primari attivando direttamente la proliferazione cellulare e le vie di sopravvivenza.

La rilevanza clinica delle fusioni geniche per i pazienti oncologici è diventata evidente con la scoperta del cromosoma di Filadelfia e del corrispondente gene di fusione BCR-ABL1 nella leucemia mielogiosa cronica (CML)2. L'imasilatere di piccole molecole imalistio mesylate è stato sviluppato per indirizzare specificamente questo gene di fusione e ha dimostrato una notevole efficacia nei pazienti positivi a CCML BCR-ABL13. Il targeting terapeutico delle fusioni geniche oncogeniche ha avuto successo anche nei tumori solidi, con l'inibizione dei geni di fusione ALK e ROS1 nel cancro del polmone non a piccole cellule che funge da esempi primari4,5. Recentemente, l'inibitore NTRK larotrectinib è stato approvato dalla FDA per i tumori solidi NTRK1/2/3 con grado di fusione positivi, indipendentemente dal sito della malattia6. Oltre alla selezione della terapia, il rilevamento della fusione genica ha anche ruoli nella diagnosi e nella prognosi della malattia. Ciò è particolarmente diffuso in vari sottotipi di sarcoma e malignità ematologica che sono definiti diagnosticamente dalla presenza di fusioni specifiche e/o per i quali la presenza di una fusione direttamente in forma prognosi7,8 , 9 (in vie , 10 del sistema , 11.Questi sono solo alcuni esempi dell'applicazione clinica del rilevamento della fusione genica per i pazienti oncologici.

A causa del ruolo fondamentale nel processo decisionale clinico, la rilevazione accurata della fusione genica da campioni clinici è di vitale importanza. Numerose tecniche sono state applicate nei laboratori clinici per l'analisi di riorganizzazione della fusione o cromosomica, tra cui: tecniche citogenetiche, reazione a catena di polimerasi di trascrizione inversa (RT-PCR), fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH), immunohistochimica (IHC) e 5'/3' analisi dello squilibrio di espressione (tra gli altri)12,13,14,15. Attualmente, l'elenco in rapida espansione delle fusioni di geni utilizzabili nel cancro ha portato alla necessità di valutare contemporaneamente lo stato di fusione di più geni. Di conseguenza, alcune tecniche tradizionali che possono interrogare solo uno o pochi geni alla volta stanno diventando approcci inefficienti, soprattutto se si considera che i campioni di tumore clinico sono spesso molto finiti e non suscettibili di essere divisi tra diversi saggi. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS), tuttavia, è una piattaforma di analisi adatta per i test multigeni, e i saggi basati su NGS sono diventati comuni nei laboratori clinici di diagnostica molecolare.

I saggi NGS attualmente utilizzati per il rilevamento della fusione/riarrangiamento variano per quanto riguarda il materiale di input utilizzato, le funzioni chimiche impiegate per la preparazione della biblioteca e l'arricchimento dei bersagli e il numero di geni interrogati all'interno di un'analizzazione. I saggi NGS possono essere basati su RNA o DNA (o entrambi) estratti dal campione. Sebbene l'analisi basata sull'RNA sia ostacolata dalla tendenza dei campioni clinici a contenere RNA altamente degradato, elude la necessità di sequenziare introni grandi e spesso ripetitivi che sono gli obiettivi di test di fusione basati su DNA, ma si sono dimostrati difficili per NGS analisi dei dati16. Le strategie di arricchimento target per i saggi NGS basati sull'RNA possono essere in gran parte suddivise in approcci ibridi di cattura o di amplicon mediazione. Mentre entrambe le strategie sono state utilizzate con successo per il rilevamento della fusione, ognuna contiene vantaggi rispetto alle altre17,18. I saggi di cattura ibrida in genere si traducono in librerie più complesse e in un abbandono allelico ridotto, mentre i saggi basati su amplicon richiedono generalmente un input inferiore e comportano un sequenziamento meno off-target19. Tuttavia, forse la limitazione primaria dell'arricchimento tradizionale basato sull'amplicon è la necessità di primer per tutti i partner di fusione conosciuti. Questo è problematico poiché molti geni clinicamente importanti sono noti per fondersi con decine di partner diversi, e anche se la progettazione del primer permettesse di rilevare tutti i partner noti, nuovi eventi di fusione rimarrebbero inosservati. Una tecnica descritta di recente definita multiplex PCR (o AMP in breve) affronta questa limitazione20. In AMP, un adattatore NGS "semifunzionale" è migate a frammenti di cDNA derivati dall'RNA di input. L'arricchimento del bersaglio si ottiene amplificando tra primer specifici del gene e un primer all'adattatore. Di conseguenza, tutte le fusioni con geni di interesse, anche se è coinvolto un nuovo partner di fusione, dovrebbero essere rilevate (vedi Figura 1). Questo articolo descrive l'uso del kit ArcherDx FusionPlex Solid Tumor, un saggio basato su NGS che impiega AMP per l'arricchimento del bersaglio e la preparazione della libreria, per il rilevamento di fusioni geniche oncogeniche in campioni di tumori solidi (vedere la tabella supplementari 1 per dell'elenco completo dei geni). Il protocollo wet-bench e le fasi di analisi dei dati sono stati rigorosamente convalidati in un laboratorio certificato CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments).

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Protocollo

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1. Preparazione della biblioteca e sequenziamento

  1. Considerazioni generali sul saggio e passi di pre-saggio
    1. Le esecuzioni di analisi sono in genere costituite da sette campioni clinici e da un controllo positivo (anche se il numero di campioni per ogni esecuzione di preparazione della libreria può essere regolato in base alle esigenze). Utilizzare un controllo positivo che contenga almeno diverse fusioni genetiche (che il test è obiettivo) che sono state confermate da un produttore e/o sono state confermate da una metodologia ortogonale. Un controllo non modello (NTC) deve essere incluso come campione aggiuntivo in ogni esecuzione di analisi, ma viene trasportato solo attraverso la sintesi del cDNA del secondo filamento e il controllo di qualità pre-sequenziamento (Pre-Seq QC; per non garantire alcuna sintesi cDNA). Utilizzare il diluente di esempio (10 mM Tris HCl pH 8.0) per NTC.
    2. Eseguire l'estrazione totale di acido nucleico (TNA) del tessuto incorporato in paraffina fissata in formalina (FFPE).
    3. Quantificare il componente RNA del TNA utilizzando un saggio fluorometrico.
      NOTA: Prevenire la degradazione dell'RNA nei campioni limitando i cicli di congelamento-scongelamento, mantenendo l'acido nucleico scongelato a bassa temperatura (blocco refrigerato, ghiaccio o alternativa) e prevenendo la contaminazione da RNase (indossando guanti, utilizzando uno spray per il decontaminazione RNase).
  2. Innesco casuale
    NOTA: L'input desiderato per il saggio è 200 ng RNA (basato sulla quantificazione fluorometrica del TNA). Ingressi inferiori possono essere utilizzati se non è possibile ottenere 200 ng. Se l'esempio non riesce dopo la sequenza qC, la ripetizione con un input più elevato può comportare metriche QC accettabili.
    1. Diluire la TNA in 10 mM Tris HCl pH 8.0 per ottenere la concentrazione di RNA desiderata. Per ogni campione, trasferire 20-L della diluizione nei tubi a striscia di innesco di innesco di innesco casuale (posizionati in blocchi di alluminio pre-raffreddati) e mescolare pipetting su e giù 6-8 volte. Ruotare brevemente verso il basso e trasferire l'intero volume su una piastra PCR e guarnire con pellicola RT.
    2. Inserire la piastra nel blocco termociclore, coprire con pad di compressione e chiudere il coperchio. Incubare a 65 gradi centigradi per 5 min (coperchio riscaldato).
    3. Togliere la piastra dal termociclore e mettere sul ghiaccio per 2 min.
  3. Sintesi cDNA primo filamento
    1. Trasferire l'intero volume del prodotto di innesco casuale nei primi tubi a strisce di reagente (posizionati in blocco di alluminio pre-freddo). Mescolare pipetting su e giù 6-8 volte. Per un breve periodo verso il basso, trasferire l'intero volume su una piastra PCR da 96 pozzetto e sigillare con pellicola RT.
    2. Inserire la piastra nel blocco termociclore, coprire con pad di compressione e chiudere il coperchio. Eseguire il programma termociclore: 25 c 10 min, 42 c 30 min, 80 c 20 min, 4 C tenere (coperchio riscaldato).
  4. Secondo filamento sintesi cDNA
    1. In un nuovo set di tubi a strisce PCR, creare una diluizione 1:10 del primo prodotto del filamento aggiungendo 1 -L del prodotto del primo filamento a 9 acqua priva di nucleato. Mettere da parte la diluizione da parte nel saggio Pre-Seq QC.
    2. Aggiungere 21 - L di acqua priva di nucleata al restante prodotto del primo filamento. Trasferire 40 -L del primo prodotto filo e acqua priva di nuclesione al secondo tubo di striscia di reagenti filo (collocato in blocco di alluminio pre-freddo). Mescolare pipetting su e giù 6-8 volte. Spin down, trasferire l'intero volume su una piastra PCR 96 bene e sigillare con pellicola RT.
    3. Inserire la piastra nel blocco termociclore, coprire con pad di compressione e chiudere il coperchio. Eseguire il programma termociclore: 16 c 60 min, 75 c 20 min, 4 gradi centigradi (coperchio riscaldato).
      NOTA: si tratta di un punto di arresto accettabile. La piastra può essere conservata a -20 gradi centigradi.
  5. QC pre-seq
    NOTA: Questo test di controllo qualità (QC) viene utilizzato principalmente per la verifica di nessuna sintesi cDNA da NTC. Tuttavia, i dati possono anche essere informativi nella risoluzione dei problemi di analisi. Ad esempio, se un campione ha un buon valore QC pre-seq ma metriche di analisi scadenti (vedi sotto), potrebbe essere un'indicazione di un problema nell'esecuzione del saggio, che richiede una ripetizione.
    1. Eseguire ogni esempio e NTC in duplicato. Anche includere nel Pre-Seq QC eseguire una reazione NTC, che è acqua priva di nucleasi (anche correre in duplicato). Ad ogni pozzo applicabile di un pozzo ottico 96 aggiungere 5 L del mix master di ansaggio, 1 - L di 10x VCP primer, e 4 -L della diluizione 1:10 del primo prodotto filamento che è stato creato nel passaggio 1.4.1.
    2. Sigillare la piastra con pellicola RT, girare verso il basso e caricare in uno strumento quantitativo PCR (qPCR). Eseguire il programma: preamplificatore 95 c 20 s, amp: 35 cicli 95 C 3 s (4,4 gradi centigradi/s velocità rampa) - 60 C 30 s (2,2 gradi centigradi/ velocità di rampa).
    3. Confermare la mancanza di un valore di soglia del ciclo (Ct) sia per il NTC di analisi che per la reazione NTC.
      NOTA: Se non è osservato alcun Ct nel saggio NTC, non sarà più portato avanti nel saggio. L'osservazione di un valore Ct nella reazione NTC richiede una ripetizione del saggio Pre-Seq QC. L'osservazione di un Ct nel saggio NTC suggerisce una contaminazione del campione ad un certo punto prima del saggio, richiedendo quindi che l'intero saggio (tutti i campioni) sia ricominciato. Il valore Pre-Seq QC Ct per un campione di qualità adeguato deve essere inferiore a 30 (valori Ct inferiori sono correlati a più prodotto e quindi a RNA di qualità superiore). I valori superiori a 30 non sono indicatori assoluti di fallimento e questi campioni dovrebbero essere continuati nel saggio. Tuttavia, tutti i dati derivati da tali campioni dovrebbero essere riesaminati attentamente, in particolare nei casi per i quali non viene chiamata alcuna fusione.
  6. Riparazione finale e purificazione del tallone
    1. Trasferire 40 -L del secondo prodotto filo nel tubo a strisce di riparazione finale (posizionato in blocco di alluminio pre-freddo). Mescolare con la pipistratura su e giù 6-8 volte, girare verso il basso e mettere in blocco termociclore (mantenendo il coperchio riscaldato aperto) ed eseguire il programma termociclore: 25 C 30 min, 4 gradi di attesa.
    2. Togliere le perle di depurazione a partire da 4 gradi centigradi e lasciare che l'ancognitazione a temperatura ambiente sia equilibrata. Recuperare abbastanza 70% di etanolo per durare tutta la preparazione della libreria. Vortex perline ben prima dell'uso e pipet 100 .L nel numero appropriato di pozzetti di una piastra U-fondo.
      NOTA: per ogni 8 campioni che vengono eseguiti, saranno necessari 20 mL di 70% di etanolo.
    3. Aggiungere l'intero volume del prodotto di riparazione finale alle perline. Scorri su e giù 6-8 volte per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 5 min, seguito da un'incubazione di 5-min sul magnete.
    4. Rimuovere e scartare il supernatore ed eseguire due 200 ore di etanolo 70% con incubazioni a 30. Dopo il lavaggio finale rimuovere tutto 70% etanolo e lasciare asciugare l'aria per 5 min.
    5. Togliere dal magnete e sospendere nuovamente le perline in 22 mL di 10 mM Tris HCl pH 8.0. Incubare il magnete per 3 min seguito da un'incubazione di 2 min sul magnete. Procedere immediatamente al passaggio 1 di legatura.
  7. Ligazione fase 1 e purificazione del tallone
    1. Trasferire 20 l dalla piastra di purificazione del tallone di riparazione finale (avendo cura di non disturbare il pellet di perline) nei tubi a strisce passo 1 di ligazione (posizionati in blocco di alluminio pre-raffreddato). Mescolare con la pipistratura su e giù 6-8 volte, girare verso il basso e trasferire l'intero volume in una piastra PCR 96 ben.
    2. Inserire la piastra nel blocco termociclore, coprire con pad di compressione e coperchio chiuso. Eseguire il programma di termociclore: 37 c 15 min, 4 gradi centigradi (coperchio riscaldato).
    3. Togliere le perle di depurazione a partire da 4 gradi centigradi e lasciare che l'ancognitazione a temperatura ambiente sia equilibrata. Vortex perline ben prima dell'uso e pipet 50 -L nel numero appropriato di pozzetti di una piastra u-fondo.
    4. Aggiungere l'intero volume di prodotto di legatura step 1 alle perline. Scorri su e giù 6-8 volte per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 5 min, seguito da un'incubazione di 5-min sul magnete.
    5. Rimuovere e scartare il supernatore ed eseguire due 200 ore di etanolo 70% con incubazioni a 30. Dopo il lavaggio finale rimuovere tutto 70% etanolo e lasciare asciugare l'aria per 5 min.
    6. Togliere dal magnete e sospendere nuovamente le perline in 42 mL di 10 mM Tris HCl pH 8.0. Incubare il magnete per 3 min seguito da un'incubazione di 2 min sul magnete. Procedere immediatamente al passaggio 2 di legatura.
  8. Ligazione fase 2 e purificazione del tallone
    1. Rimuovere i reagenti del tubo a strisce dell'adattatore del codice a barre molecolare (MBC) dalla memoria a 4 gradi centigradi. La numerazione corretta della striscia dell'adattatore MBC è di fondamentale importanza in quanto a questo punto vengono aggiunti indici specifici del campione. Posizionare i tubi orizzontalmente con le cerniere sul retro e utilizzare un pennarello permanente per etichettare i tubi 1, 2, 3... da sinistra a destra. È inoltre fondamentale registrare gli indici specifici del campione ai fini della sequenza (devono essere immessi nel foglio di lavoro del sequencer).
    2. Trasferire 40 l dalla piastra di purificazione del tallone di legatura (avendo cura di non disturbare il pellet di perline) ai tubi a striscia dell'adattatore MBC (posizionati in un blocco di alluminio pre-raffreddato). Mescolare pipetting su e giù 6-8 volte.
    3. Girare verso il basso e trasferire l'intero volume al passo di legatura 2 tubi a strisce reagenti (posizionati anche in blocco di alluminio pre-freddo). Mescolare con pipetting su e giù 6-8 volte, girare verso il basso e posizionare nel blocco termociclore. Con il coperchio riscaldato fuori eseguire il programma termociclore: 22 C 5 min, 4 gradi centigradi tenere.
      NOTA: Questo è un punto di arresto sicuro e i campioni possono essere conservati a -20 gradi centigradi.
    4. Rimuovere le perle di pulizia della legatura da 4 gradi centigradi di stoccaggio e lasciare che l'equilibrato a temperatura ambiente sia equilibrato. Preparare 1 mL di fresco 5 mM NaOH.
    5. Vorticare le perline di pulizia della legatura e aggiungere 50 -L a un nuovo set di tubi a strisce PCR. Incubare sul magnete per 1 min. Dopo l'incubazione di 1 min rimuovere e scartare supernatali. Rimuovere i tubi striscia dal magnete e ri-sospendere in 50 - L di tampone di pulitura legatura pipeting su e giù 6-8 volte.
    6. Trasferire l'intero volume del prodotto fase 2 di legatura nei tubi della striscia di perline di pulizia della legatura. Mescolare i campioni vortice e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Ancora una volta, mescolare i campioni vortice e incubare a temperatura ambiente per altri 5 min. Dopo la seconda incubazione di 5 min, mescolare i campioni vorticendo, girare brevemente verso il basso e incubare sul magnete per 1 min.
    7. Rimuovere e scartare supernatante. Aggiungere 200 l di pulitura e vortice per ri-sospendere. Eseguire un giro rapido e posizionare sul magnete per 1 min. Eseguire un secondo lavaggio utilizzando nuovamente il buffer di pulizia legatura.
    8. Dopo i due lavaggi con il buffer di pulizia legatura eseguire un lavaggio identico utilizzando acqua ultrapura. Dopo il lavaggio dell'acqua ultrapura ri-sospendi le perline in 20 -L di 5 mM NaOH e si trasferiscono su una piastra PCR da 96 pozze. Mettere la piastra nel blocco termociclore con un termociclore ed eseguire il programma termociclore: 75 c 10 min, 4 gradi centigradi (coperchio riscaldato).
    9. Abbassare la piastra PCR una volta che i campioni si sono raffreddati a 4 gradi centigradi. Posizionare la piastra sul magnete per almeno 3 min e procedere immediatamente alla prima PCR.
  9. Primo PCR e purificazione del tallone
    1. Rimuovere i primi tubi a striscia di reagente PCR da 4 gradi centigradi e posizionarli in un blocco di alluminio pre-freddo. Inoltre, rimuovere i primer GSP1 da -20 gradi centigradi e lasciare che l'eclicazione alla temperatura ambiente sia equilibrata.
    2. Aggiungere 2 Ll delle primer GSP1 ad ogni pozzetto dei primi tubi a strisce di reagente PCR. Trasferire 18 l del prodotto di pulizia legatura 2 ai primi tubi a strisce reagenti PCR e mescolare convogliando su e giù 6-8 volte.
    3. Girare verso il basso e trasferire ad una piastra PCR 96 bene. Posizionare la piastra nel blocco termociclore con un termociclore ed eseguire il programma di termociclista: 95 C 3 min, 15 cicli 95 C 30 s , 65 c 5 min (100% tasso di rampa), 72 C 3 min, 4 Gradi di attesa (coperchio riscaldato).
      NOTA: Si tratta di un punto di sosta sicuro e i campioni possono essere conservati a 4 gradi centigradi o a -20 gradi centigradi per l'immagazzinamento a lungo termine.
    4. Togliere le perle di depurazione a partire da 4 gradi centigradi e lasciare che l'ancognitazione a temperatura ambiente sia equilibrata. Vortex perline ben prima dell'uso e pipet 24 Gradi L nel numero appropriato di pozzetti di una piastra u-fondo.
    5. Trasferire 20 ll del primo prodotto PCR al 24 L di perline. Scorri su e giù 6-8 volte per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 5 min, seguito da un'incubazione di 2 min sul magnete.
    6. Rimuovere e scartare il supernatore ed eseguire due 200 ore di etanolo 70% con incubazioni a 30. Dopo il lavaggio finale rimuovere tutto 70% etanolo e lasciare asciugare l'aria per 2 min.
    7. Togliere dal magnete e ri-sospendere le perline in 24 - L di 10 mM Tris HCl pH 8.0. Incubare il magnete per 3 min seguito da un'incubazione di 2 min sul magnete. Procedere immediatamente al secondo PCR.
  10. Secondo PCR e purificazione del tallone
    1. Rimuovere i secondi tubi a strisce reagenti PCR a partire da 4 gradi centigradi e riporre un blocco di alluminio pre-freddo. La corretta numerazione dei secondi tubi a strisce PCR è di fondamentale importanza in quanto a questo punto vengono aggiunti indici specifici del campione. Posizionare i tubi orizzontalmente con le cerniere sul retro e utilizzare un pennarello permanente per etichettare i tubi 1, 2, 3... da sinistra a destra. Inoltre, rimuovere i primer GSP2 da -20 gradi centigradi e lasciare che l'eclichino a temperatura ambiente.
      NOTA: è inoltre fondamentale registrare gli indici specifici del campione ai fini della sequenza (devono essere immessi nel foglio di lavoro del sequencer).
    2. Aggiungere 2 ll l dei primer GSP2 ad ogni pozzetto del secondo tubo di striscia reagente PCR. Trasferire 18 l del primo prodotto di pulizia PCR sul secondo tubo di strip del reagente PCR e mescolare convogliando su e giù 6-8 volte.
    3. Girare verso il basso e trasferire ad una piastra PCR 96 bene. Mettere la piastra nel blocco termociclore con un termociclore ed eseguire il programma di termociclista: 95 c 3 min, 18 cicli 95 C 30 s , 65 c 5 min (100% velocità rampa), 72 C 3 min, 4 C tenere (coperchio riscaldato).
      NOTA: Si tratta di un punto di sosta sicuro e i campioni possono essere conservati a 4 gradi centigradi o a -20 gradi centigradi per l'immagazzinamento a lungo termine.
    4. Togliere le perle di depurazione a partire da 4 gradi centigradi e lasciare che l'ancognitazione a temperatura ambiente sia equilibrata. Vortex perline ben prima dell'uso e pipet 24 Gradi L nel numero appropriato di pozzetti di una piastra u-fondo.
    5. Trasferire alle perline 20 - L del secondo prodotto PCR. Scorri su e giù 6-8 volte per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 5 min, seguito da un'incubazione di 2 min sul magnete.
    6. Rimuovere e scartare il supernatore ed eseguire due 200 ore di etanolo 70% con incubazioni a 30. Dopo il lavaggio finale rimuovere tutto 70% etanolo e lasciare asciugare l'aria per 2 min.
    7. Togliere dal magnete e ri-sospendere le perline in 24 - L di 10 mM Tris HCl pH 8.0. Incubare il magnete per 3 min seguito da un'incubazione di 2 min sul magnete. Trasferire 20 -L del secondo prodotto di pulizia PCR su una nuova piastra PCR da 96 po' di ben.
      NOTA: Si tratta di un punto di arresto sicuro e le librerie possono essere memorizzate a -20 gradi centigradi per l'archiviazione a lungo termine o procedere immediatamente alla quantificazione della libreria.
  11. Quantitation libreria
    1. Rimuovere la raccolta quantitation master mix e gli standard da -20 s di archiviazione e lasciare a temperatura ambiente equilibrato.
    2. Eseguire la diluizione 1:5 di tutte le librerie (secondo prodotto PCR) utilizzando 10 mM Tris HCl pH 8.0 seguita da una diluizione seriale di 1:199, 1:199 e 20:80 utilizzando 10 mM Tris HCl pH 8.0 0.05% polisarino. Le ultime due diluizioni rispettivamente di 1:200.000 e 1:1.000.000 saranno eseguite in triplice copia.
    3. Aggiungete 6 le le 2.00 di miscela principale in ogni pozzetto di una piastra ottica da 96 pozzetto seguita da 4 -L di diluizione o standard appropriati. Ruotare la piastra e caricarla sullo strumento qPCR. Utilizzare le seguenti condizioni di ciclismo: 1 ciclo 95 C 5 min, 35 cicli 95 C 30 s (4,4 s /s velocità rampa) - 60 C 45 s (2,2 gradi C / s velocità rampa).
    4. Una volta completata la quantificazione delle librerie e determinate le concentrazioni delle librerie (attraverso la media di entrambe le diluizioni testate), normalizzare tutte le librerie a 2 nM utilizzando 10 mM Tris HCl pH 8.0. Creare la piscina della biblioteca combinando 10 l di ogni libreria normalizzata in un tubo di centrifuga micro da 1,5 mL.
  12. Sequenza delle librerie
    1. Rimuovere la cartuccia reagente del sequencer da -20 gradi centigradi e mettere in acqua deionizzata (DI) fino alla linea di riempimento per almeno 1 h. Inoltre, rimuovere il kit di reagente sequencer da 4 gradi centigradi e lasciare che l'equilibrato a temperatura ambiente sia equilibrato per almeno 1 ora. Il numero massimo di librerie che possono essere sequenziate su questa piattaforma di sequenziamento è 8 (una delle quali deve essere il controllo positivo).
    2. Crea la piscina denaturata della biblioteca di amplificatori (DAL) combinando 10 gradi l della piscina della biblioteca con 10 -L di 0,2 N NaOH e incuba per 5 min a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione di 5 min aggiungere 10 -L di 200 mM Tris HCl pH 7.0, seguito da 970 -L di buffer di ibridazione HT1.
    3. Fare il tubo di carico finale combinando 300 L di HT1, 25 - L di 20 pM PhiX e 675 L della piscina DAL. Vortice e girare verso il basso il tubo di carico. Aggiungere l'intero volume del tubo di carico al pozzo campione della cartuccia di reagente del sequencer e caricare la cartuccia nel sequencer eseguendo 2 letture 2 x 151 bp con 2 letture indice.

2. Analisi dei dati

  1. Gestione e analisi dei dati di sequenziamento
    1. Scarica le metriche di sequenziamento dallo strumento NGS.
    2. Assicurarsi che i dati di sequenza rientrino negli intervalli seguenti (specifici per il kit utilizzato in questo esempio). Densità cluster (densità [K/mm 2]): 945–1600 K; % di letture che passano il filtro (cluster PF [%]): >90%; punteggi di qualità (% : Q30): >85%; Allineamento PhiX (%) allineato: 1,5-6,0%; Tasso di errore PhiX (tasso di errore [%]): <1,0%; legge il filtro di passaggio (legge PF [M]): >22 milioni.
      NOTA: le sequenze che non soddisfano queste metriche sono soggette a ripetizioni.
    3. Esaminare la percentuale di letture attribuite a ciascun campione (ad esempio, ogni indice specifico del campione). Per una tipica esecuzione in cui il PhiX spike-in è stato di 5% e 8 campioni sono stati sequenziati, ogni campione dovrebbe idealmente rappresentare circa l'11,9% delle letture. L'intervallo accettabile per ogni campione è di 5-25%. Se i campioni non rientrano in questo intervallo, ripetere la quantificazione e la sequenza della libreria.
  2. Invio di dati di sequenza non elaborati all'algoritmo di analisi
    NOTA: la versione 4.1.1.7 di ArcherDx Analysis è descritta qui. In questo esempio, il software di analisi viene distribuito come 'macchina virtuale' eseguito in un server interno. Per ogni campione da analizzare contemporaneamente (in genere vengono elaborati 8 campioni che richiedono 8 CPU e 96 GB di RAM). L'elaborazione richiede in genere 3/8 h.
    1. Utilizzate le impostazioni di analisi predefinite all'interno del sistema di analisi, ad eccezione di MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (modificato da 10 a 20) e READ_DEPTH_NORMALATION (impostato su 0 per impedire il down-campionamento).
    2. Per avviare un processo di analisi, fare clic su Esegui analisi nell'interfaccia utente, inviare un nome per il processo e quindi selezionare i file FASTQ necessari (assicurando che sia le letture [R1 che R2] siano selezionate per ogni campione).
    3. Selezionare RNA Fusion per i tipi di analisi dell'RNA, Illumina (accoppiato) per la piattaforma e FusionPlex Solid Tumor Panel per la regione bersaglio. Quindi fare clic su Invia analisi.
  3. Interpretazione dei dati di analisi
    1. Aprire l'interfaccia utente del sistema di analisi e selezionare il lavoro desiderato. Selezionare il campione di controllo positivo. Assicurarsi che tutte le fusioni e le isoforme oncogeniche previste siano state rilevate e siano elencate nella scheda Prove forti.
      NOTA: Se una qualsiasi delle fusioni tracciate nel controllo positivo non viene rilevata per una determinata esecuzione del test, può essere un'indicazione di un problema in quella corsa, che richiede una ripetizione (dall'inizio del test).
    2. Esaminare le statistiche di lettura per ogni campione clinico nell'esecuzione facendo clic sulla scheda Leggi statistiche. Ogni campione deve essere rappresentato da almeno 1 milione di frammenti totali. Se inferiore a 1 milione, ri-sequenziare la libreria con considerazioni per la ri-quantificazione per garantire che la quantificazione iniziale non fosse aberranti.
      NOTA: i campioni di buona qualità vengono generalmente visualizzati On Target % >85% e l'RNA Molecular Bins dovrebbe essere >20,000 e comprendere >30% delle letture. Tuttavia, la mancata riunione di queste metriche non attiva automaticamente l'errore del campione.
    3. Esaminare il valore Media siti iniziali univoci per controllo GSP2.
      NOTA: Questo valore è una misura della complessità di sequenziamento da primer a quattro geni di pulizia. Questa metrica è un fattore determinante della qualità dell'RNA nel campione (se il sequenziamento dei geni che si prevede di esprimere nel campione è scarso, allora la fiducia nella capacità di rilevare una fusione genica espressa è bassa). Il limite per questa metrica è 20. Se un campione mostra un valore inferiore a 20, i risultati del campione devono essere segnalati come poco informativi se non viene trovata alcuna fusione ad alta confidenza. Lo stato di questa metrica può essere determinato anche nella pagina di riepilogo della corsa (lo stato sarà elencato come Fusion QC: Pass o Fusion QC: Number of Unique RNA GSP2 Control Start Sites Low a seconda che il valore sia maggiore o minore di 20). Una fusione ad alta confidenza in un campione che non ha superato questa metrica QC può ancora essere segnalata se è ritenuta reale (vedi sotto). In genere, punteggi QC più elevati che utilizzano questa metrica sono correlati a punteggi PreSeq Ct più bassi, come previsto (Figura 2).
  4. Interpretazione delle chiamate fusion
    1. Esaminare attentamente ogni fusione chiamata nella scheda Strong Evidence (la maggior parte delle fusioni di prove forti chiamate dal sistema sono artifactuali). Anche la scansione del bidone di fusione di prove deboli, anche se la presenza di una fusione non artifactualine in questo contenitore è un evento estremamente raro. Per valutare la validità di una fusione, prendere nota prima delle metriche Letture (Sezione / %) e Siti iniziali.
      NOTA: In generale, la fiducia in una fusione chiamata aumenta più alte sono queste metriche. Le fusioni supportate da meno di 5 siti di partenza e da meno del 10% delle letture dall'iniziatore di supporto devono essere considerate altamente sospette come artifactuali.
    2. Prendere nota delle icone visualizzate nella colonna Filtri.
      NOTA: Molte di queste icone avvisano l'utente di una potenziale fonte di un invito artifactuali. Frequenti tra questi (e si trovano principalmente nel deboli contenitore di prove di cosiddette fusioni) sono casi in cui i partner sono noti paralogi o mostrano somiglianza tra loro in sequenza (che indica probabile allineamento mis-priming o errato). Un'altra fonte comune di chiamate di fusione artifactualisi si verifica quando le letture che sostengono la fusione contengono un alto tasso di errore che è indicativo di scarsa mappatura al genoma di riferimento, e questo è associato a un'icona distinta. Gli eventi di lettura trascrizionale vengono identificati tramite un'altra icona. Questi sono comuni e sono generalmente ignorati. Nell'interfaccia utente vengono utilizzate anche diverse altre icone, ma una descrizione completa di tutti esula dall'ambito di questo articolo. Gli artefatti comuni che generalmente possono essere ignorati senza ulteriori indagini includono: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, NOTCH1-RET, RELA-RET, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8, e FCGR2C-MAST.
    3. Visualizza le letture di supporto per ogni potenziale fusione facendo clic sul link Visualizza nell'interfaccia utente, che porta l'utente a una vista JBrowse basata sul Web di pile di singole letture che supportano la fusione. Confermare che le letture sono generalmente prive di disallineamento (anche se è prevedibile un certo rumore), che una parte significativa (idealmente >30 basi) delle letture si allinea al partner di fusione e che le sequenze immediatamente adiacenti al punto di interruzione tra i geni e i siti di associazione primer sono privi di inserimenti o eliminazioni. Verificare che la sequenza allineata includa la porzione 3' delle sequenze di rilegatura del primer per i primer che supportano le letture di fusione (se le parti di 3' non sono incluse, può essere un'indicazione di mis-priming).
    4. Se nella fusione sono coinvolte sequenze di codifica di entrambi i geni, assicurarsi che il partner 3' rimanga in frame. Fare clic sul collegamento Traduzione nell'interfaccia (che darà uno stato True o False per ogni combinazione di sequenze di riferimento) e anche confermare manualmente che la fusione è in frame attraverso l'ispezione dei punti di interruzione chiamati in un browser genomico. I punti di interruzione chiamati possono essere determinati passando il mouse sopra i punti rossi nello schema di fusione.
      NOTA: Poiché la maggior parte (ma non tutti) i punti di interruzione genomici per le fusioni legittime si verificano in regioni intronica e si traducono in giunzione insieme di interi esoni, le fusioni in cui i confini degli esoni comprendono i punti di interruzione per entrambi i partner sono generalmente visti con un grado più elevato di fiducia. Tuttavia, poiché ci sono molti esempi pubblicati di punti di interruzione mid-exonic nelle fusioni, questo non dovrebbe essere usato come criteri assoluti nell'interpretazione di una fusione.
    5. Per ogni fusione, assicurarsi manualmente che le sequenze adiacenti al punto di interruzione non siano omologhe alle base contigue previste per ogni partner. Ispezionare tutti i possibili esoni contigui in un browser genomico.
      NOTA: Una fonte comune di fusione artifactuali è il disallineamento o il disinnamento a causa dell'omologia tra due partner genetici, e questo non è sempre chiamato dal sistema tramite le icone sopra descritte.

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Risultati

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Illustrato Figura 3, Figura 4 e Figura 5 sono screenshot dall'interfaccia utente di analisi che dimostra i risultati di un esempio di adenocarcinoma polmonare. Nella figura 3, viene visualizzato il riepilogo dell'esempio (in alto) che elenca le cosiddette fusioni di prove complesse, nonché lo stato QC (cerchiato in rosso). La fusione ADCK4-NUMBL (di cui sono elencati 3 isoformi) viene immediata...

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Discussione

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L'arricchimento e la preparazione della libreria basati su PCR multiplex ancorati seguiti dal sequenziamento di nuova generazione sono adatti per la valutazione della fusione genica multiplexneista in campioni di tumore clinici. Concentrandosi sull'input di RNA piuttosto che sul DNA genomico, si evita la necessità di sequenziare introni di grandi dimensioni e ripetitivi. Inoltre, poiché questo approccio amplifica le fusioni geniche indipendentemente dall'identità del partner di fusione, vengono rilevate nuove fusioni. Qu...

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Dichiarazioni

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D.L.A. ha ricevuto commissioni di consulenza da Bayer Oncology, Genentech, AbbVie e Bristol Myers Squibb. K.D.D. ha ricevuto viaggi sponsorizzati da ArcherDx.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dalla Molecular Pathology Shared Resource dell'Università del Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) e dal Colorado Center for Personalized Medicine.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10 mM Tris HCl pH 8.0IDT11-05-01-13Utilizzato per la diluizione del
TNA 1M Tris pH 7.0Thermo FisherAM9850GUtilizzato nel pooling di librerie
25 mL Serbatoio di reagenti con divisoreUSA Scientific9173-2000Per l'uso con pipettatori multicanale e grandi volumi di reagenti
Semi-gonna TemPlate a 96 pozzetti Piastra PCR da 0,1 mL-naturaleUSA Scientific1402-9700Piastra utilizzata per le fasi del termociclatore
Agencourt AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881Utilizzato nella purificazione dopo diverse fasi di analisi
Agencourt Formapure KitBeckman CoulterA33343Utilizzato nell'estrazione TNA
Archer FusionPlex Solid Tumor KitArcherDXAB0005Questo kit contiene la maggior parte dei reagenti necessari per eseguire la preparazione della libreria per il sequenziamento Illumina (sono disponibili anche kit per il sequenziamento Ion Torrent)
Blocco freddo, 96 pozzettiLight LabsA7079Utilizzato per mantenere i campioni refrigerati in varie fasi
EthanolDecon LabsDSP-MD.43Utilizzato per il lavaggio delle microsfere
Quantificazione della libreria per lo standard di controllo interno IlluminaKapa BiosystemsKK4906Utilizzato per la quantificazione delle librerie
Primer per quantificazione di librerie e miscela ROX Low qPCRKapa BiosystemsKK4973Utilizzato per la quantificazione di librerie
Standard di quantificazione per librerieKapa BiosystemsKK4903Utilizzato per la quantificazione di librerie
Piastra magnetica, 96 pozzetti (grado N38)AlpaquaA32782Utilizzato nelle fasi di purificazione delle perle
Set di adattatori MBC BArcherDXAK0016-48Adattatori che contengono indici specifici del campione per consentire il sequenziamento multiplex
Micro CentrifugaUSA Scientific2641-0016Utilizzato per la centrifuga di provette PCR
MicroAmp EnduraPlate Piastra ottica a 96 pozzettiThermo-Fisher4483485Utilizzato per la quantificazione di librerie QCpre-Seq
Pad di compressione per film ottici MicroampBiosystemsapplicati 4312639Utilizzato per la quantificazione di librerie
Mini filatore per piastreLabnetMPS-1000Utilizzato per la raccolta del liquido sul fondo dei pozzetti della piastra Kit
di reagenti MiSeq v3 (600 cicli)IlluminaMS-102-3003Contiene i componenti necessari per un ciclo di sequenziamento MiSeq
Sistema MiSeqDxStrumento di sequenziamento
Modello 9700 TermociclatoreBiosistemiUtilizzato per diverse fasi durante acqua
priva di nucleasiAmbion9938Utilizzato come diluente
generale Coperture ottiche per piastre PCR ABI a 96 pozzettiThermo-Fisher4311971 Utilizzato per la quantificazione della libreria QCpre-Seq
Stazione di lavoro PCR Modello 600Sistemi di pulizia dell'ariaBZ10119636Fasi di analisi da banco umido eseguite in questa "scatola d'aria morta"
Proteinasi KQiagen1019499Utilizzato nell'estrazione del TNA
QuantStudio 5Applied BiosystemsLSA28139strumento qPCR utilizzato per PreSeq e quantificazione della libreria
Kit di analisi HS dell'RNA QubitLife TechnologiesQ32855Utilizzo per determinare la concentrazione di RNA nei campioni di TNA
RNase AwayFisher12-402-178Utilizzato per la decontaminazione generale dell'RNasi delle aree di lavoro
Materiale di riferimento per RNA di fusione tumorale FFPE Seraseq v2SeraCare0710-0129Utilizzato come controllo positivo del test
Idrossido di sodioFisherBP359-212Utilizzato nelle fasi di pulizia e per l'impostazione del sequenziamento
SYBR Green SupermixBio Rad172-5120Componente del test PreSeq QC
TempAssure PCR 8 strisce di provetteUSA Scientific1402-2700Utilizzato per la miscelazione di reagenti e campioni, ecc.
Modello RT PCR filmUSA Scientific2921-7800Utilizzato per la copertura di piastre a 96 pozzetti
Micropiastra a 96 pozzetti con fondo a ULSP MP8117-RUtilizzato durante la purificazione delle microsfere
Illumina NGS applicati

Riferimenti

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