Questo articolo fornisce una guida passo-passo per studiare le dinamiche di localizzazione subcellulare delle proteine e per monitorare i cambiamenti morfologici utilizzando la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.
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Articolo metodologico
Microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le indagini sui fattori che influenzano la divisione cellulare e la forma cellulare nei batteri sono comunemente eseguite in combinazione con la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione, poiché le osservazioni fatte a livello di popolazione potrebbero non riflettere realmente ciò che si verifica a livello di singola cellula. La microscopia a tempo variabile a cellule vive consente agli sperimentatori di monitorare i cambiamenti nella divisione cellulare o nella morfologia cellulare che forniscono preziose informazioni sulla localizzazione subcellulare delle proteine e sulla tempistica dell'espressione genica, come accade, per aiutare potenzialmente a rispondere a importanti domande biologiche. Qui, descriviamo il nostro protocollo per monitorare i cambiamenti fenotipici in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus utilizzando un microscopio di deconvoluzione ad alta risoluzione. L'obiettivo di questa relazione è quello di fornire un protocollo semplice e chiaro che può essere adottato da altri ricercatori interessati a condurre esperimenti di microscopia a fluorescenza per studiare diversi processi biologici nei batteri e in altri organismi.
Introduzione
Il campo della biologia cellulare batterica è stato notevolmente migliorato dai recenti progressi nelle tecniche di microscopia1,2. Tra gli altri strumenti, i microscopi in grado di condurre esperimenti di microscopia a fluorescenza timelapse rimangono uno strumento prezioso. I ricercatori possono monitorare vari eventi fisiologici in tempo reale utilizzando proteine fluorescenti come le proteine fluorescenti verdi (GFP) e le fusioni di reporter traslazionali, gli amminoacidi D-aminoacidi fluorescenti (FDAA)3o utilizzare altre macchie per etichettare la parete cellulare, la membrana e i....
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Protocollo
1. Condizioni generali di crescita
- Inoculare 2 mL di mezzo di crescita appropriato integrato con antibiotici (dove richiesto) con una singola colonia del ceppo (s) da immaginare. Incubare queste colture di semi durante la notte a 22 gradi centigradi in un incubatore agitazione.
NOTA: Le condizioni specifiche di crescita batterica utilizzate in questo articolo sono fornite nella sezione dei risultati rappresentativi. - Diluire le colture durante la notte 1:20 in supporti freschi in un flacone da 125 mL, integrare con antibiotici (dove richiesto).
- Coltivare colture a 37 gradi centigradi in un'incubatrice tremante fino alla fase media del l....
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Risultati
Fenotipi GpsB
In precedenza abbiamo dimostrato che Sa-GpsB è una proteina essenziale come esaurimento di GpsB utilizzando un RNA antisenso risultati in lisi cellulare9. Qui descriviamo come l'emergere di vari fenotipi della divisione cellulare e i cambiamenti nella localizzazione delle proteine potrebbero essere catturati utilizzando il protocollo di microscopia timelapse descritto in questo articolo. A questo scopo, S. aureus sforza RB143 [SH1000 che ospita pEPSA5 (ve.......
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Discussione
La microscopia è rimasta un pilastro negli studi relativi agli organismi microbici. Data la loro dimensione cellulare su scala micron, gli studi a livello di cellula singola si sono tradizionalmente basati sulla microscopia elettronica (EM). Sebbene EM sia diventata una tecnica piuttosto potente negli ultimi anni, ha i suoi limiti intrinseci oltre al limitato accesso degli utenti16. I miglioramenti nelle tecniche di microscopia a fluorescenza e lo sviluppo di diverse sonde fluorescenti, come FDAA<.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i nostri membri del laboratorio per i loro commenti su questo articolo. Questo lavoro è stato finanziato da una start-up della University of South Florida (PE).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | Fisher BioReagents | BP160-100 | Grado di biologia molecolare - Basso EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopia |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | |
| Microscopia Piatto inferiore in vetro | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Microscopia IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Senza |
| Microscopio | GE | DeltaVision Elite | Personalizzato Olympus IX-71 Supporto per Microscopio Invertito; Torre di illuminazione personalizzata e modulo illuminatore a luce trasmessa. Obiettivi: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OLIO (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); Prisma DIC Nomarski per obiettivo 100X; Fotocamera CoolSnap HQ2; Assemblaggio SSI a 7 colori; Camera di controllo ambientale - opaca. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inibitore |
| SoftWorx | GE | Software di imaging fornito dal produttore |
Riferimenti
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in ....
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Ristampe e permessi
