Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth

Il sistema motore oculare fornisce un elegante sistema per studiare i meccanismi di guida degli assoni. È relativamente semplice, costituito da tre nervi cranici che innervadono sei muscoli extraoculari (EOM) che muovono l'occhio, e la superiorità levatore palpebra (LPS) che solleva la palpebra. Il nervo oculomotore innerva l'LPS e quattro EOM - i muscoli obliqui inferiori e mediali, inferiori e superiori. Gli altri due nervi, il trochlear e l'abducens, ognuno solo innervare un muscolo, il superiore obliquo e muscolo di retto laterale, rispettivamente. I movimenti oculari forniscono una facile lettura, mostrando se l'innervazione era appropriata, mancante o aberranti. Inoltre, ci sono disturbi del movimento dell'occhio umano che derivano da deficit nello sviluppo neuronale o guida assone, collettivamente chiamato i disturbi didisinnervazione cranica congeniti (CCDD)¹.

Nonostante questi vantaggi, il sistema motorio oculare è raramente utilizzato negli studi di guida degli assoni^{2,3,4,5,6,7,8, 9} (in vie ^{, 10}, a causa di inconvenienti tecnici. I saggi di guida assoni in vitro hanno molti svantaggi¹¹. I saggi di co-coltura, in cui gli espiante neuronali vengono coltivati insieme agli espianti del tessuto bersaglio¹² o delle cellule trasfette¹³, dipendono sia dalla simmetria dell'espianto che dal posizionamento preciso tra l'espianto e il tessuto bersaglio. I saggi Striscia^14,15, in cui due spunti sono disposti a strisce alternate e gli assoni sono valutati per la crescita preferenziale su una striscia, indicano solo che un substrato è preferibile all'altro, non che uno dei due sia attraente o ripugnante, o fisiologicamente rilevante. Le camere microfluidiche possono formare precisi gradienti chimici, ma soggetti a picconi in crescita per inclinare lo stress di taglio^16,17,18, che possono influenzare la loro crescita. Inoltre, in ciascuno di questi approcci, la raccolta di espianti o cellule dissociate richiede che gli assoni in crescita in crescita siano assitopi e quindi questi saggi esaminino effettivamente la rigenerazione degli assoni, piuttosto che la crescita iniziale degli assoni. Infine, questi approcci in vitro rimuovono il microambiente che influenza gli assoni e le loro risposte ai segnali lungo diversi punti del loro corso, e tradizionalmente testano solo un segnale in isolamento. A complicare questi svantaggi, le piccole dimensioni di ogni nucleo nel sistema motorio oculare rendono la dissezione tecnicamente difficile per gli espianti o per le colture dissociate. Inoltre, le colture primarie di motoneuroni oculari sono di solito eterogenee, hanno una morte cellulare significativa e dipendono dalla densità, richiedendo il raggruppamento di cellule da embrioni multipli (Ryosuki Fujiki, comunicazione personale). I metodi in vivo, tuttavia, compresi i modelli di topo a foratura, sono inappropriati da utilizzare per lo screening, dati i tempi e le spese richiesti.

Metodi sviluppati per la coltura di embrioni interi¹⁹ consentono l'etichettatura delle cellule migratorie²⁰ o il blocco di molecole specifiche²¹, ma le colture intere embrionali richiedono incubazione in bottiglie a rulli che preclude l'imaging in tempo reale di etichettato Strutture. Sono possibili anche tecniche chirurgiche che consentono la manipolazione dell'embrione e il successivo ulteriore sviluppo sia nell'utero che nell'addome della madre (mantenendo la connessione placentare)^22, ma anche queste non consentono il time-lapse Imaging.

Per superare gli ostacoli dei saggi in vitro e consentire uno screening rapido dei percorsi di segnalazione, è stata sviluppata una tecnica di coltura a fette embrionale ex vivo²³, adattata da un protocollo precedentemente pubblicato per la escrescenza del nervo periferico²⁴. Utilizzando questo protocollo, il nervo oculomotore in via di sviluppo può essere immaginato nel tempo in presenza di molte delle strutture circostanti lungo la sua traiettoria, compresi gli obiettivi dell'oOM. Aggiungendo inibitori di piccole molecole, fattori di crescita o indicazioni guida ai media di coltura, possiamo valutare le perturbazioni di orientamento in più punti lungo la traiettoria dell'assone, consentendo una valutazione più rapida dei potenziali fattori di crescita e di guida.

Tutto il lavoro sugli animali qui descritto è stato approvato ed eseguito in conformità con i protocolli del Boston Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Accoppiamenti a tempo

1. Posizionare ISL^MN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP)1Slp/J Stock No: 017952) topi maschi e femmine insieme durante la notte. Pesare le femmine e registrare i pesi prima dell'accoppiamento.
   NOTA: ISL^MN:GFP etichetta specificamente i motoneuroni con un GFP farnesillated che non è citotossico, si localizza alla membrana cellulare dei motoneuroni e dei loro assoni e consente di visualizzare i nervi durante lo sviluppo²⁵. Potrebbero essere utilizzate anche altre linee con etichetta fluorescente.
2. Verificare la presenza di spine vaginali al mattino presto. La data in cui una spina viene identificata è designata come E0.5.
3. Confermare la gravidanza utilizzando l'aumento di peso e/o gli ultrasuoni a E10.5. Le dighe incinte devono aver guadagnato almeno 1 g. Gli embrioni possono essere visti con ultrasuoni a E10.5.

2. Preparazione di reagenti e vibratome per la coltura della sezione

1. Preparare 500 mL di tampone di affettare: aggiungere 5 mL di HEPES e 5 mL di penicillina/streptomicina a 500 mL di Soluzione di sale equilibrato di Hank (HBSS) senza Ca² e Mg².  Raffreddare a 4 gradi centigradi.
   NOTA: il buffer di affettatura supplementare deve essere memorizzato a 4 gradi centigradi e può essere utilizzato per futuri esperimenti di coltura delle fette.
2. Preparare 50 mL di supporti di coltura: In un cofano sterile, aggiungere 12,5 mL di HBSS, 12,5 mL di siero fetale bovino, 250 litri di glucosio, 250 -L di L-glutammina, 125 l di HEPES a 24,4 mL di Fluorobright DMEM. (concentrazioni finali: FlouroBright DMEM con 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% glucosio, 1 mM glutammina, e 2.5 mM HEPES.).  Riscaldare i mezzi di coltura a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua sterile.
   NOTA: I supporti di coltura possono essere conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 settimane.
   1. In un cappuccio sterile, aggiungere 1,5 mL di supporti di coltura ad ogni pozzo di una piastra di 6 pozze.  Aggiungere un inserimento di impostazioni cultura delle celle (Tabella dei materiali) a ogni pozzo.  Mettere in un'incubatrice sterile di 37 e 5% di CO 2.
3. Preparare il 4% di agarose a bassa temperatura di fusione: sciogliere 2 g di agarose a bassa temperatura di fusione in 50 mL di PBS sterile. Microonde a intervalli di 30-60 s fino a completa dissoluzione. Mettere in un bagno d'acqua a 40 gradi centigradi per mantenere il liquido.
   NOTA: l'agarose extra può essere conservato a temperatura ambiente (RT) e fuso per futuri esperimenti di coltura delle fette.
4. Set up vibratome: Posiziona una nuova lama sul vibratome. Controllare le impostazioni: spessore 400-450 m. Pre-raffreddare lo stadio vibratoma. Mettere del ghiaccio nella camera esterna. Utilizzare una camera e un palco dedicati alle fette vive. Non utilizzare la stessa camera vibratoma per il tessuto fisso in quanto il fissativo residuo potrebbe danneggiare le fette.
5. Preparare l'incubatrice superiore dello stadio al microscopioa 37 gradi centigradi e al 5% di CO 2.
6. Preparare la dissezione: Pulire gli strumenti chirurgici e spruzzare con 70% etanolo. Riempire due piatti Petri con HBSS, posto sul ghiaccio. Aprire una piastra di coltura del tessuto 12 pozzo e posizionare il coperchio sul ghiaccio con la parte inferiore rivolta verso l'alto. Aprire una piastra di coltura dei tessuti a 6 pozze e posizionare inserti di membrana di coltura cellulare e 1,5 mL di coltura cellulare in ogni pozzo. Preriscaldare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi centigradi e al 5% di CO 2.

3. Raccogliere embrioni E10.5 e preparare fette

NOTA: Tutti i passaggi da questo punto devono essere eseguiti il più rapidamente possibile. Mantenere gli embrioni sempre sul ghiaccio.

1. Eutanasia la diga incinta (E10.5) in una camera DI CO_2. Eseguire lussazione cervicale.
2. Spruzzare l'addome con il 70% di etanolo. Tagliare l'addome con le forbici, rimuovere l'utero e metterlo in una teglia Petri con HBSS ghiacciato per lavare rapidamente via il sangue. Spostare l'utero lavato in un secondo Petri riempito con piatto ghiaccio freddo HBSS.
3. Sotto un ambito di dissezione, rimuovere gli embrioni dal corno uterino e sacche amniotiche individuali. Posizionare gli embrioni sulla parte inferiore del coperchio di una piastra di 12 pozze. Tieniti sul ghiaccio.
4. Sotto un ambito di dissezione, utilizzare la carta da filtro per rimuovere qualsiasi liquido che circonda ogni embrione.
   NOTA: Gli embrioni si attaccano alla carta da filtro se toccati.
5. Incorporare gli embrioni in agarose. Versare l'agarosa sciolta su ogni embrione per coprirlo. Tieniti sul ghiaccio. Non appena l'agarose si è indurita, capovolgere ogni embrione e versare agarose aggiuntive sull'altro lato. Tieniti sul ghiaccio.
6. Utilizzando un ambito di dissetazione fluorescente, tagliare l'agarose intorno a ogni embrione in modo che sia orientata correttamente quando incollata allo stadio vibratoma. Il nucleo oculomotore e la rapida escrescenza assonale sono fluorescenti. Allineare l'embrione in modo che il nucleo, gli assoni in crescita e l'occhio formino una linea, e tagliare l'agarose con una lama di rasoio tagliata parallelamente a questa linea (dorsale all'embrione, vedere Figura 1A).
   NOTA: Questo sarà il lato incollato allo stadio vibratoma (l'embrione sarà posizionato sulla schiena, la testa più vicina alla lama del vibratoma). Una linea tra il nucleo oculomotore e l'occhio deve essere parallela alla lama vibratoma.
7. Riempire la camera vibratoma con tampone a fette ghiacciate. Superincollare l'embrione allo stadio vibratoma in modo che la lama sia parallela al nucleo oculomotore e agli occhi. Una volta che la supercolla è asciutta, immergere lo stadio vibratoma in modo che l'embrione sia orientato verso l'allontanamento dalla lama.
8. Affettare 400-450 fette di m.  Raccogliere ogni fetta con un pipet di trasferimento sterile. Mettere nel buffer di affettare a freddo.
9. Sotto il mirino di dissezione, scegliere la fetta contenente i nuclei oculomotori e gli occhi. Utilizzando un pipet di trasferimento sterile, posizionarlo sul inserto di coltura cellulare nella piastra 6 pozzo. Riportare la piastra all'incubatrice di 37 gradi centigradi. In alternativa, chiedi a una persona di affettare e a un'altra di posizionare le fette. Ridurre al minimo il tempo che intersechi e lo inserimento nell'incubatrice.
   NOTA: Le fette devono essere orientate in modo che la massima fluorescenza emessa dai nuclei e dagli assoni sia più vicina all'obiettivo del microscopio di imaging. In un microscopio invertito, le fette devono essere posizionate sulla membrana con i nuclei e gli assoni più vicini all'obiettivo sotto la piastra.
10. Togliere l'agarose residua dallo stadio vibratoma, superincollare l'embrione successivo allo stadio e ripetere i passaggi 3.7-3.9 fino a quando tutti gli embrioni sono stati affettati e placcati.
11. Aggiungere inibitore o molecola ricombinante di scelta ai media in ogni pozzo per creare una curva dose-risposta.  Diluire in un solvente appropriato.
    NOTA: se si utilizza DMSO, utilizzare solo DMSO di grado di coltura dei tessuti. In alternativa, le perle proteiche possono essere posizionate in posizioni specifiche della fetta.
12. Posizionare al microscopio nella camera 37 e 5% CO 2.  Impostare il microscopio per scattare il contrasto di fase e le fotografie fluorescenti di ogni fetta ogni 30 min (o più spesso se lo si desidera). Le fette possono essere mantenute per 48-72 h.

Risultati normali: la figura 1 fornisce uno schema dell'esperimento. A partire dall'E9.5 nel topo, i primi assoni cominciano ad emergere dal nucleo oculomotore26. Con E10.5, un nervo oculomotore a fasciculato, che contiene i primi neuroni pionieri, può essere visto nel mesenchyme. C'è una significativa variabilità tra gli embrioni a E10.5 (anche all'interno della stessa lettiera) in quanto il nervo è progredito verso l'orbita, probabilmente a causa delle differenze di sviluppo di poche ore. Durante lo sviluppo normale in utero, i primi assoni oculomotori positivi alla GFP raggiungono l'orbita/occhio rispetto ai successivi 18-24 h (per E11.5), quindi iniziano a ramificare ai loro obiettivi finali27. Nella cultura delle sezioni, questa temporizzazione viene recapitata (Figura 2, Video 1). La fetta cresce e si espande (in tutte le direzioni) fino a 72 h, e gli assoni possono essere visti estendersi dal nucleo verso l'occhio. Abbiamo trovato il primo 36-48 h più utile per valutare l'escrescenza dell'assone oculomotore. I motoneuroni a volte possono essere visti muoversi all'interno del nucleo (non mostrato). In alcune fette, a seconda dell'orientamento, è presente anche il nucleo trocleare. Gli assoni trocleari si estendono lateralmente all'interno della fetta e spesso si bloccano, perché il loro corso normale è quello di uscire dal nucleo trocleare lateralmente, prima di girare dorsalmente e caudalmente, che sarebbe fuori dalla fetta. Occasionalmente, gli assoni trocleari sembrano unirsi agli assoni oculomotori e volgersi verso l'occhio, il che rende la fetta difficile da interpretare, in quanto quegli assoni possono avere un effetto secondario sulla guida degli assoni oculomotori.

Esempio di inibizione di un importante percorso di guida ascia: inibire la segnalazione CXCR4 causa la crescita dorsale piuttosto che ventrale degli assoni oculomotori. Abbiamo valutato il ruolo della segnalazione CXCR4 sullo sviluppo oculomotorio aggiungendo 1 g/mL (1,26 mL) di AMD3100, un inibitore di piccole molecole solubili in acqua di CXCR428, direttamente ai mezzi di coltura non appena viene preparata la coltura della sezione. Gli assoni oculomotori possono quindi essere visti uscire dal nucleo oculomotore dorsalmente e crescere lontano dall'orbita ("indietro") (Figura 2,Video 2). Gli assoni che avevano già lasciato il midbrain e che erano in rotta verso l'orbita a E10.5 continuano sul loro cammino. L'inibizione di CXCR4 influisce anche sulla crescita complessiva della fetta.

L'orientamento della sezione è fondamentale. Le sezioni non sono interpretabili se non sono orientate correttamente. Alcuni esempi di sezioni orientate in modo improprio sono mostrate nella Figura 3. Se l'embrione è inclinato di lato, solo un nucleo oculomotore è nella fetta (Figura 3A).  Se l'embrione incorporato è inclinato troppo verso la sua parte posteriore, gli occhi non sono nella fetta, e invece l'arto superiore e il cervello posteriore o il midollo spinale possono essere nella fetta (Figura 3B).  In questo caso, la normale traiettoria degli assoni oculomotori non è presente e tendono a crescere in modo casuale. Durante il posizionamento della fetta sulla membrana di coltura, può diventare piegato (Figura 3C).

I solventi possono essere tossici. Prestare attenzione quando si dissolvono inibitori o fattori di crescita nei solventi organici. Figura 4 viene illustrato un esempio di una sezione che è morta dopo l'aggiunta di etanolo al supporto. 118 l è stato aggiunto a 1,5 mL di supporti (concentrazione finale 7,8%), e questa alta concentrazione si è dimostrata tossica. Per evitare questo, sciogliere i soluti nella quantità minima di solvente possibile (al limite di solubilità). Quando possibile, sciogliere in acqua. Se si utilizza DMSO, assicurarsi che sia sterile, coltura dei tessuti grado DMSO.

Figura 1 : Schematica. Gli embrioni E10.5 IslMN-GFP (A: foto, B: schematic) vengono tagliati su un vibratoma (spesso 400-450 m) in modo che le sezioni includano sia il nucleo oculomotorio che l'orbita. Le linee tratteggiate parallele in A e B indicano la posizione dei tagli vibratomi. La linea tratteggiata inferiore in A mostra dove l'agarose deve essere tagliata e incollata allo stadio vibratoma. (C) Le sezioni sono disposte su una membrana di coltura tissutale, consentendo lo scambio di nutrienti e gas, e collocate in un incubatore di fasi per la microscopia time-lapse. In questa fase, gli inibitori possono essere aggiunti ai media di crescita. (D) Le colture possono essere mantenute per 24-72 h, e gli assoni oculomotori possono essere visti crescere fino all'occhio. Adattato con il permesso di Whitman, et. al. 201823. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : inibizione di CXCR4 causa un errore di instradamento di CN3. Le colture affettate da embrioni E10.5 Isl-GFP immagini a 0, 12, 24 e 36 h in coltura. Il pannello superiore mostra un embrione di controllo di tipo selvaggio e CN3 (verde) cresce verso gli occhi e rami ampiamente nel corso di 36 h. Vedere anche Video 1. Il pannello inferiore mostra una fetta con 1 amD3100 (inibitore specifico per CXCR4) aggiunto e gli assoni escono dal nucleo oculomotore dorsalmente. Quelli che erano già usciti ventralmente continuano verso l'occhio. Vedere anche Video 2. D: dorsale, V: ventrale, E: occhio, N: nucleo oculomotore, SMN: neuroni motori spinali, frecce: assoni oculomotori (bianco: proiezione wildtype, giallo: proiezioni aberranti). La barra della scala è uguale a 200 m. Consultate anche Video 1 e Video 2.  Una figura simile che mostra altri esempi è stata presentata a Whitman, et. al. 201823. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : l'orientamento delle sezioni è fondamentale. Immagini iniziali (tempo 0 h) di sezioni rappresentative non orientate. A mostra una fetta in cui l'embrione è stato inclinato di lato in modo che la proiezione di assoni CN3 sono stati axotomizzati. Gli assoni sporchi sono presenti solo sul lato destro della sezione (freccia).  B mostra una fetta in cui l'embrione è stato inclinato all'indietro in modo che i nuclei CN3 con assoni spumanti (freccia) siano visibili bilateralmente, ma gli occhi non sono presenti nella fetta. Invece possono essere osservati i motoneuroni spinali (SMN) e le proiezioni dei motoneuroni agli arti. C mostra una fetta che si piega durante il posizionamento sulla membrana. Le sezioni come quelle mostrate qui devono essere scartate. Le barre della scala rappresentano 500 m in ogni pannello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : i solventi possono essere tossici. L'imaging time-lapse delle colture di fette da embrioni E10.5 Isl-GFP a 0 e 12 h in coltura. Una fetta coltivata in supporti senza additivi (A-B) cresce normalmente per 12 h con gli assoni CN3 che si proiettano verso l'occhio. Una fetta coltivata nei media con un'alta concentrazione di etanolo (7,8%) (C-D) non cresce normalmente. A 12 h, CN3 non è cresciuto ed è appena visibile, e il tessuto ha iniziato a disintegrarsi. Le barre della scala rappresentano 500 m in ogni pannello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: CN3 escresce nella cultura delle fette. Immagine time-lapse di una coltura di fetta di controllo da un embrione Isl-GFP E10.5. Immagini scattate ogni 30 min su 18 h in coltura. CN3 (verde) cresce dal nucleo (in alto) verso gli occhi e inizia a ramificarsi. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Video 2: Mirino non corretto di CN3 con inibizione della segnalazione CXCR4. L'imaging time-lapse delle colture di fette da embrioni E10.5 Isl-GFP oltre 48 h in coltura. Quando 1 AMD3100 (inibitore specifico per CXCR4) viene aggiunto direttamente al supporto, gli assoni CN3 che non sono ancora nella periferia escono dal nucleo oculomotore dorsalmente (sinistra) piuttosto che a vendicatura (a destra). Ristampato con il permesso di Whitman, et. al. 201823. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Gli autori non hanno nulla da rivelare.