Articolo metodologico

Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)

DOI:

10.3791/59913

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10 luglio 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Center for RNA Biology, The Ohio State University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per arricchire i siti endogeni di legame dell'RNA o "impronte" di nasi: proteine (RNP) complessi da cellule di mammiferi. Questo approccio comporta due immunoprecipitazioni di sottounità RNP ed è quindi soprannominato immunoprecipitazioni di RNA in tandem (RIPiT).

Abstract

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L'immunoprecipitazioni dell'RNA in tandem (RIPiT) è un metodo per arricchire le impronte di RNA di una coppia di proteine all'interno di un complesso RNA:proteina (RNP). RIPiT impiega due fasi di purificazione. In primo luogo, l'immunoprecipitazioni di una sottounità RNP con tag è seguita da una lieve digestione di RNase e dalla successiva elusione di affinità non denatura. Una seconda immunoprecipitazioni di un'altra sottounità RNP consente l'arricchimento di un complesso definito. A seguito di una diluizione di RNA e proteine, le impronte di RNA vengono convertite in librerie di sequenziamento del DNA ad alto valore di produzione. A differenza del più popolare approccio ultravioletto (UV) seguito da immunoprecipitazioni (CLIP) per arricchire i siti di legame RBP, RIPiT è UV-crosslinking indipendente. Quindi RIPiT può essere applicato a numerose proteine presenti nell'interactoma dell'RNA e oltre che sono essenziali per la regolazione dell'RNA, ma non contattano direttamente l'RNA o UV-crosslink scarsamente all'RNA. Le due fasi di purificazione in RIPiT offrono un ulteriore vantaggio nell'identificare i siti di legame in cui una proteina di interesse agisce in collaborazione con un altro cofattore. La strategia di doppia purificazione serve anche a migliorare il segnale limitando lo sfondo. In questo caso, forniamo una procedura passo-passo per eseguire RIPiT e per generare librerie di sequenziamento ad alta velocità da impronte di RNA isolate. Delineiamo anche i vantaggi e le applicazioni di RIPiT e discutiamo alcune delle sue limitazioni.

Introduzione

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All'interno delle cellule, l'RNA esiste in complesso con proteine per formare complessi di RNA:proteina (RRP). Gli RPP sono assemblati intorno alle proteine leganti l'RNA (RBP, quelle che legano direttamente l'RNA) ma comprendono anche non-RP (quelli che legano gli RBP ma non l'RNA) e sono spesso di natura dinamica. Gli RBP e i loro cofattori funzionano collettivamente all'interno dei RSP per eseguire funzioni normative. Ad esempio, nel percorso di decadimento dell'mRNA mediato senza senso (NMD), le proteine UPF (UPF1, UPF2 e UPF3b) riconoscono il ribosoma terminato prematuramente. Ognuna delle proteine UPF può legarsi all'RNA, ma è solo quando si assemblano insieme che inizia a formarsi un complesso nmD attivo. All'interno di questo complesso, UPF1 è ulteriormente attivato dalla fosforilazione da un SMG1 non-RBP, e tale attivazione UPF1 alla fine porta al reclutamento di fattori di induzione del decadimento mRNA1,2. In questo esempio, gli RBP richiedono cofattori non RBP per il reclutamento e l'attivazione del complesso RNP che attiva NMD. Un'altra proprietà degli RNP è la loro eterogeneità compositiva. Si consideri il spicchio, che esiste in distinti complessi E, A, B o C. Diversi complessi spliceo hanno proteine sovrapposte e distinte3. Per studiare le funzioni di RNP, è importante chiarire quali RNA sono legati da un RBP e le sue proteine associate. Esistono molti metodi per raggiungere questo obiettivo, con ogni approccio che ha i suoi vantaggi e svantaggi distinti4,5,6,7.

I metodi molto popolari per identificare i siti di legame RBP - crosslinking seguito da immunoprecipitazioni (CLIP) e le sue varie variazioni - si basano sulla luce ultravioletta (UV) per collegare un RBP all'RNA8. Tuttavia, questo non è un approccio efficace per i non-RBP all'interno dei RSP, che non contattano direttamente l'RNA. Qui, descriviamo un approccio alternativo applicabile sia agli RBP che ai non-RBP, per isolare e identificare i loro siti di legame dell'RNA. Questo approccio chiamato immunoprecipitazioni dell'RNA in tandem (RIPiT) è costituito da due fasi di immunoprecipitazioni, che aiutano a raggiungere una maggiore specificità rispetto a una singola purificazione (Figura 1)9,10. Poiché le singole fasi di immunoprecipitazioni (IP) possono essere eseguite a una cordenza inferiore rispetto al CLIP, RIPiT non dipende dalla disponibilità di anticorpi in grado di resistere alla presenza di forti detergenti durante l'immunoprecipitazioni. Il vantaggio più unico di RIPiT è la capacità di indirizzare due diverse proteine in due fasi di purificazione; questo fornisce un modo potente per arricchire un complesso RNP compositivamente distinto da altri complessi simili11.

Piccole variazioni alla procedura RIPiT possono migliorare ulteriormente l'arricchimento del RNP. Ad esempio, alcune interazioni RNA-proteina o proteina-proteina all'interno dei RNP sono transitorie e può essere difficile purificare in modo efficiente le impronte di tali complessi. Per stabilizzare tali interazioni, i RNP possono essere incrociati all'interno delle cellule con formaldeide prima della lisi cellulare e RIPiT. Ad esempio, abbiamo osservato che una debole interazione tra il fattore centrale del complesso di giunzione dell'esonio (EJC), EIF4AIII e il fattore di smontaggio dell'EJC, IL PYM12 può essere stabilizzato con il trattamento della formaldeide in modo che vengano arricchite più impronte di RNA (dati non (visualizzato). Prima della raccolta cellulare e RIPiT, le cellule possono anche essere trattate con farmaci per stabilizzare o arricchire i RNP in un determinato stato. Ad esempio, quando si studiano proteine che vengono rimosse dall'mRNA durante la traduzione (ad esempio, l'EJC13, UPF114), il trattamento con inibitori di traduzione come la damacina, il cicloseximide o l'armonica può portare ad un aumento dell'occupazione di proteine sugli RNA.

La quantità di RNA recuperata da RIPiT è solitamente bassa (0,5-10 pmoles, cioè 10-250 ng RNA considerando una lunghezza media dell'RNA di 75 nt). La ragione principale di questo è che solo una piccola frazione di una data proteina è presente in complesso con altre proteine all'interno di RRP (qualsiasi proteina "libera" IP'ed nel primo passo viene persa durante il secondo IP). Per generare librerie RNA-Seq da questo RNA, abbiamo anche delineato qui un adattamento del protocollo pubblicato in precedenza adatto a tali input di RNA bassi15,16 (Figura 2), che produce campioni pronti per la sequenziamento ad alta velocità in 3 Giorni.

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Protocollo

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1. Istituzione di linee cellulari HEK293 stabili che esprimono le proteine di interesse marcate FLAG indecicabili da Tetraciclina (POI)

  1. Cellule di semi HEK293 con un punto di destinazione di ricombinazione Flp (FRT) stabilmente integrato ad una densità di 10 x 104 celle/mL in mezzo di crescita (il mezzo di Eagle modificato di Eagle [DMEM] - 10% siero bovino fetale [FBS] - 1% penicillina-streptomycin [penn/sp]) in 6- piatti ben. Consentire alle cellule di crescere durante la notte in un'incubatrice umidificata a 37 e 5% di CO2 (condizioni di crescita standard per tutti i passaggi successivi).
  2. Il giorno successivo, le cellule dovrebbero essere confluenti del 70%. Secondo il protocollo di reagente di trasfezione, trasfecare le cellule HEK293 che contengono il sito FRT con un rapporto 9:1 di pcDNA5-TETO-FLAG-POI:pOG44.
    NOT: Il tag FLAG ha il motivo della sequenza DYKDDDDK (D - acido aspartico, Y e tirosina e K - lisina).
  3. Dopo 24 h, iniziare la selezione degli antibiotici. Rimuovere i supporti e aggiungere un nuovo mezzo di crescita integrato con 100 g/mL di igromycina. Entro 72 h, le cellule non trastrante dovrebbero iniziare a morire.
  4. Ogni 48-72 h, cambiare i media di crescita e integrare con igromycina fresca.
  5. Dopo 2 settimane di selezione, cominceranno a comparire colonie discrete di cellule rescissive e stabile. Una volta che le colonie sono visibili ad occhio nudo, aggiungere 1 mL di trypsin alla piastra e incubare per 5 min a 37 gradi centigradi. Risospendere le cellule in DMEM, trasferire le cellule in una nuova piastra di 10 cm e regolare il volume a 10 mL di mezzo di crescita fresco integrato con 100 g/mL di igromicina. Consentire alla piastra di raggiungere la confluenza dell'80% per espandere ulteriormente le cellule per preparare scorte permanenti.
  6. Determinare la quantità di tetraciclina (Tet) necessaria per ottenere il livello ottimale di espressione FLAG-POI per l'esperimento. Far crescere le cellule in formato 12-well e condurre una titolazione di Tet tra 0-1,000 ng/mL gamma per 16-24 h. Eseguire macchie occidentali sui campioni di titolazione con anticorpo contro il POI.
    NOT: Per le proteine fino a 60 kDa, il FLAG-tagged e la copia endogena della proteina possono essere risolti sul sodio dodecyl sodecyl sodecyl solfato-polyacrilie gel elettroforesi (SDS-PAGE) per confrontare i livelli di espressione di FLAG-POI con la sua controparte endogena. Per le proteine più grandi, l'intensità del segnale nei campioni indotti da Tet può essere paragonata a un campione non indotto. La soluzione di stock di tetraciclina può essere preparata a 1 mg/mL in 100% di etanolo. Le diluizioni dello stock per il lavoro di coltura cellulare dovrebbero essere in acqua sterile o saline tampone fosfato (PBS). Lo stock di tetraciclina deve essere preparato fresco una volta al mese.

2. Cellule di coltura per l'induzione di tetraciclina e la procedura RIPiT

  1. Seme opportunamente integrato FLAG-POI HEK293 ad una densità di 3 x 105 celle / mL in mezzo di crescita in piastre da 15 cm. Consentire alle cellule di crescere a 37 e 5% di CO2.
    NOT: In generale, da tre a cinque piastre da 15 cm produrranno da 2 a 20 pm di impronte di RNA a seconda dell'abbondanza di RNP di interesse. Se gli RNP saranno incrociati e purificati da parte di RRN in condizioni rigorose, potrebbe essere necessario il doppio dell'input.
  2. Aggiungere tetraciclina a una concentrazione ottimale predeterminata ai media per indurre l'espressione del FLAG-POI (vedi passo 1.6) 16-24 h prima della raccolta delle cellule.
    NOT: Non è necessario cambiare il mezzo di crescita. Le cellule devono essere pronte per la raccolta di circa 72 h dopo la semina o quando le piastre sono confluenti dell'80%. È importante evitare che le cellule diventino confluenti.

3. Raccolta cellulare, trattamento di formaldeide e lisi cellulare

  1. Lavare delicatamente le cellule monostrato con 15 mL di PBS refrigerati per ogni piastra da 15 cm. Poi raschiare le cellule in 30 mL di PBS. Se le cellule sono state trattate con farmaci prima della raccolta, integrare PBS con il farmaco. Raccogliere tutte le cellule in tubo conico da 50 mL.
    NOT: Per preservare le interazioni deboli, le cellule possono essere incrociate con la formaldeide: aggiungere formaldeide alla sospensione cellulare dal passaggio 3.1 a una concentrazione finale dello 0,1% e incubare su un rocker a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere 3 mL del tampone di spegnimento (Tabella 1 ) e roccia per altri 5 minuti.
  2. Cellule di Pellet a 400 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e scartare il supernatante.
  3. Cellule di lyse in 4 mL di tampone di lisi ipotonica ghiaccio-freddo (HLB; Tabella 1). Utilizzare una pipetta P1000 per risospendere le celle. Trasferire su un tubo da 5 mL e incubare il lisa su ghiaccio per 10 min.
  4. Mettere il lisato in un bagno di ghiaccio e sonicare al 10% di ampiezza per 30 s con impulso 1 s con 2 s pause. Quindi, regolare la concentrazione del sale a 150 mM aggiungendo 108 L di 5 M NaCl.
    NOT: I campioni incrociati di formaldeide possono essere soggetti a lisi e purificazione più rigorosi includendo lo 0,1% ciascuno di SDS e deossicolato di sodio nel buffer di lisi.
  5. Cancellare il lisato con la centrifugazione a 21.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere 20 supernatali lla (estratto cellulare) in un tubo etichettato per l'analisi western blot dei livelli di proteine in ingresso (vedere Figura 3A).
    NOT: Mentre il lisato è in centrifuga, le perle di agarose FLAG possono essere lavate (vedi passo 4.1). Le perle di agarose FLAG devono essere pre-lavate 3 volte in 4 mL di tampone di lavaggio isotonico ghiacciato (IsoWB, Tabella 1).

4. Immunoprecipitazioni FLAG

  1. Applicare il rimanente supernatante dal passo 3,5 al 750 - perline di agarose FLAG pre-lavate in un tubo da 5 mL (il volume del letto delle perline di agarose FLAG lavate sarà 375 . Incubare le perline di agarose FLAG e l'estratto cellulare per 1-3 h a 4 gradi centigradi con una leggera miscelazione.
    NOT: Questo volume di perline di agarose FLAG dovrebbe essere sufficiente per una vasta gamma di proteine, ma può essere ottimizzato, se necessario.
  2. Pellet FLAG agarose perline di centrifugazione a 400 x g per 1 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere 20 l del supernatore in un tubo etichettato per l'analisi macchia occidentale dei livelli di proteine in estratto di cellule esaurite (vedere Figura 3A). Scartare il super-attuoso rimanente.
  3. Per lavare le perline di agarose FLAG, aggiungere 4 mL di IsoWB e risospendere. Perline di pellet a 400 x g per 1 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere con attenzione supernatante. Ripetere 4x.
    NOT: Per lavaggi rigorosi degli IP incrociati di formaldeide, lo 0,1% di ciascuno di SDS e deossicolato di sodio può essere incluso nel buffer di lavaggio per le prime due fasi di lavaggio.

5. Digestione di RNase I

  1. Diluire RNase I a 0,002-0.01 unità/mL in 750 -L di IsoWB (la concentrazione appropriata per le dimensioni dell'impronta desiderata deve essere determinata empiricamente). Aggiungere IsoWB-RNase I alle perline di agarose FLAG lavate e incubare con una leggera miscelazione a 4 gradi centigradi per 10 min.
  2. Perline di pellet a 400 x g per 1 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere 20 supernatant (RNase I elution) in un tubo etichettato per l'analisi delle macchie occidentali. Scartare IsoWB-RNase I e lavare le perline di agarose FLAG 4x con IsoWB come descritto al punto 4.3.

6. Elusione dell'affinità

  1. Preparare uno stock di tampone di tampone di eluizione (peptide FLAG a 250 ng/mL in IsoWB). Applicare 375 LL di tampone di eluizione alle perline di agarose FLAG e agitare delicatamente a 4 gradi centigradi per 1-2 h. Pellet FLAG agarose perline e raccogliere un 15 -L dell'eluizione per le macchie occidentali di proteine in FLAG IP (vedi Figura 3A).
    NOT: Quando l'elusione di affinità è in corso, è possibile eseguire la sezione 7.

7. Coniugazione magnetica per perline-anticorpo

  1. Lavare 50 perline magnetiche (ad es. Dinale; Tabella dei materiali) 3x in 1 mL IsoWB in tubo da 1,5 mL. Risospendere le perline magnetiche in 100 gradi l di buffer di coniugazione. Aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (quantità esatta di anticorpo da utilizzare per IP dovrà essere empiricamente determinato per ogni anticorpo).
    NOT: Le perle magnetiche proteiche A sono ottimali per gli anticorpi prodotti nel coniglio, mentre le perle magnetiche proteiche G sono più appropriate per gli anticorpi murini. Grafico di compatibilità perline magnetiche è disponibile sul sito web del fornitore per scegliere perline appropriate per ogni anticorpo.
  2. Lavare perline magnetiche 2x nel buffer di coniugazione (Tabella 1). Incubare la miscela a temperatura ambiente per almeno 10 min. Resospendia perline magnetiche in 375 : L di tampone di diluizione RIPiT. Conservare sul ghiaccio fino al passo successivo.

8. Seconda immunoprecipitazioni

  1. Applicare l'eludiazione di affinità FLAG rimanente dal passo 6.1 alle perle magnetiche accoppiate agli anticorpi contro la proteina di interesse. Incubare con una leggera miscelazione a 4 gradi centigradi per 1-2 h. Catturare perline magnetiche su un magnete e raccogliere 15 - L di supernatante per l'analisi delle proteine non legate tramite blot occidentale. Lavare perline magnetiche 7x con 1 mL di IsoWB.

9. Denaturing Elusione

  1. Aggiungete 100 l di buffer campione trasparente (Tabella 1) alle perline magnetiche e sospendete con una pipetta P200. Incubare sul ghiaccio per 10 min. Flick delicatamente per risospendere periodicamente le perline.
  2. Catturare perline magnetiche su un magnete e raccogliere 15 - L di eluizione per l'analisi delle proteine in eluzione RIPiT tramite macchia occidentale (vedi Figura 3A). Trasferire l'eluzione residua in un nuovo tubo etichettato da 1,5 mL.
    NOT: Se i campioni sono stati crosslinked di formaldeide, allora i campioni devono essere incubati a 65 gradi centigradi per 1 h per invertire il crosslinking.
  3. Eseguire macchie occidentali su campioni raccolti in varie fasi (ingresso, deplezione dell'IP FLAG, IP FLAG, secondo esaurimento IP, seconda eluizione IP). Blot con anticorpi contro le due proteine esca, gli altri interattori se noti, e almeno un RBP non interagente come controllo negativo (Figura 3A).

10. Estrazione dell'RNA e curazione finale

  1. All'eluizione RIPiT, aggiungere 320 -L di RNase-free ddH2O, 400 L di alcool isonomico fenolo-cloroforminato (PCIAA, pH 4.5), e vortice per 30 s e girare a temperatura ambiente a 12.000 x g per 5 min. Aggiungere 35 ld di acetato di sodio da 3M, 1/L di 1 M MgCl 2, 10 g di glicogeno e 1 mL di 100% di etanolo. Incubare per una notte a -20 gradi centigradi.
  2. Per pellet RNA, centrifugare a 12.000 x g per 30 min a 4 gradi centigradi. Lavare l'RNA nel 70% di etanolo.
  3. Per rimuovere il fosfato 3' lasciato sull'RNA dopo la scissione di RNase I, risospendere il pellet di RNA in 17 : L di ddH2O senza RNASe, e aggiungere 2 L di 10x T4 polynucleotide chinase (TableofMaterials) e 1 L di T4 PNK. Incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.
    NOT: L'attività 3' fosphatase di T4 PNK ha un'attività ottimale a pH 617. Il buffer di reazione PNK è ottimizzato per l'attività della chinasi 5' di T4 PNK e ha un pH di 7,6. Mentre è stato tentato di regolare il pH della reazione finale, questo passaggio può essere ulteriormente ottimizzato.
  4. Aggiungete al tubo 380 l di RNase-free ddH2O e 400 -L di PCIAA pH 4.5. Vortice per 30 s, centrifugare a 12.000 x g per 5 min. Raccogliere acquosa e aggiungere 35 L di acetato di sodio 3 M, 1 L di 1 M MgCl2, 10 g di glicogeno, e 1 mL di 100% etanolo.
  5. Incubare per una notte a -20 gradi centigradi. Pellet e lavare RNA con 70% etanolo come sopra. Risospendere l'RNA in 4,5 litri di acqua senza RNase.

11. Stima delle dimensioni e dell'abbondanza dell'impronta di RNA

  1. Un RIPiT di successo dovrebbe produrre 1 pmol o più di frammenti di RNA. Per quantificare la resa effettiva, trasferire 0,7 litri di RNA RIPiT (1/6 del rendimento totale) in un nuovo tubo. Aggiungete 2 L di 10x T4 PNK, 1 luna di 1 mM ATP, 40 Ci e32P-ATP (0,5,1,0 L del titolo) e 1 L di T4 PNK. Regolare il volume a 10 gradi centigradi e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.
    1. Nelle reazioni PNK parallele, etichettare un DNA Ladder a bassa portata e 0,1 pmol di un RNA sintetico o oligo del DNA (20-40 nt) per utilizzare uno standard di dimensioni e quantità.
  2. Risolvere l'etichettatura RNA/DNA su gel urea-PAGE 26% (20 x 27 x 0,45 mm3). Gel deve essere pre-run per 30 min a 35 W. Pozzi di lavaggio prima di pre-esecuzione e prima di caricare i campioni ed eseguire a 35 W fino a quando fronte colorante blu bromofenolo ha quasi raggiunto la fine del gel.
  3. Rimuovere con attenzione il gel dalle lastre di vetro su un pezzo di carta filtrante 8 x 11 pollici. Con gel sulla parte superiore della carta, mettere in gel asciugatura apparato e coprire con un pezzo di involucro di plastica. Gel secco a 80 gradi centigradi per 1 h con vuoto.
  4. Esporre gel essiccato a un fosforo durante la notte o fino a quando non viene rilevato un segnale adeguato. Schermo fosforo dell'immagine. RNA di buona qualità da un RIPiT dovrebbe apparire come uno striscio nella corsia, con bande di primo piano (Figura 3B). Per quantificare l'RNA, confrontare l'intensità del segnale dei frammenti di RNA di dimensioni desiderati nella corsia RIPiT con il segnale da 0,1 pmol di oligo sintetico etichettato.
    NOT: In alternativa, le dimensioni e le quantità di impronta dell'RNA possono essere verificate utilizzando un bio/analyzer ad alta sensibilità (Figura 3C).

12. Ligazione dell'adattatore

  1. Preparare l'RNA RIPiT in modo che almeno 3 pmol di RNA venga disciolto in 3,8 : l'acqua.
  2. In un tubo a catena di reazione alla catena di polimerasi da 0,2 mL (PCR), unire 3,8 litri di RNA, 1 -L di adattatore pre-adenilato miR-CAT-33 (7 M) (Tabella dei materiali). Incubare la miscela su un ciclore termico a 65 gradi centigradi per 10 min, 16 gradi centigradi per 5 min, quindi tenere a 4 gradi centigradi.
    NOT: Il linker pre-adenlato può essere ordinato dal servizio di sintesi oligo, o un oligo di DNA personalizzato non densato da qualsiasi servizio di sintesi oligo può essere adenlato utilizzando Mth RNA ligase (Tabella dei materiali) e gel purificato.
  3. Allo stesso tubo, aggiungere 1,5 L di 10x T4 RNA ligase buffer, 7,5 L del 50% di polietilene glicole 8000 (PEG-8000), 0,75 L di 20 m dithiothreitol (DTT)e 0,45 L di T4 RNL2 Tr.
    NOTA: il 50% peg-8000 viene fornito con legamento di RNA e tampone acquistato. Le soluzioni PEG-8000 sono viscose e devono essere reindirizzate lentamente.
  4. Incubane la reazione nel ciclore termico a 30 gradi centigradi per 6 h, il calore inattiva la ligia a 65 gradi centigradi per 10 minuti, quindi tenere premuto a 4 gradi centigradi.

13. Trascrizione inversa

  1. Al tubo con la miscela di legatura dal punto 12.4, aggiungere 11,25 l of 4x deoxynucleotide triposfata (dNTP) mix, che contiene un mix di dNTP regolari e biotinylati (vedi tabella1), 1,0 l di 10 - M RS primer (Tabella dei materiali) e 6,8 L di Acqua senza RNasi. Incubare a 65 gradi centigradi per 5 min, quindi tenere a 4 gradi centigradi.
  2. Trasferire i tubi sul ghiaccio e aggiungere 9,0 loff di 5 volte il buffer del primo filamento (FS) senza MgCl2 (Tabella 1), 2,25 L di 100 mM DTT, 1,2 l di enzima della trascrizione inversa a un volume finale di 45 ( Tabelladei materiali).
  3. Incubare in un ciclore termico a 55 gradi centigradi per 30-60 min.

14. Purificazione del prodotto RT

  1. Aggiungere 45 - L di 2x urea load buffer (Tabella 1) alla reazione RT. Diluire 1 g di un DNA Ladder a basso raggio in 45 gradi l e aggiungere 45 lof2 buffer di carico di urea.
  2. Preparare il gel urea-PAGE 10% (20 x 28 x 0,15 cm3; Tabella 1) con pettine a 8 pozze. Utilizzando siringhe o pipet, lavare i pozzi con buffer 0.5x Tris/borate/EDTA (TBE).
    NOT: I gel fatti in casa di cui sopra offrono una migliore risoluzione nel separare il prodotto RT esteso dal primer RT non esteso. In alternativa, possono essere utilizzati anche gel urea-PAGE pre-cast (Tabella dei materiali). Poiché i gel pre-cast consentono volumi massimi più piccoli per pozzo, quindi i campioni dovranno essere suddivisi in più pozzetti. I gel pre-cast devono essere eseguiti a 150-200 V.
  3. Pre-eseguire il gel a 35 W per 30 min. Lavare i pozzi di nuovo, caricare i campioni ed eseguire gel a 35 W fino a quando fronte fronte fronte mormoreanolo blu colorante è migrato a circa 1 pollice dalla fine del gel.
    NOT: Utilizzare il dissipatore di calore metallico durante la pre-esecuzione e la corsa finale per evitare il surriscaldamento del gel.
  4. Macchiare il gel per 5 min in 1x oro nucleico acido soluzione macchia gel preparato in 0.5x TBE. Questo tinriè è sensibile alla luce, quindi evita l'esposizione alla luce.
  5. Gel di immagini su scanner fluorescente per scopi di documentazione utilizzando l'eccitazione di 520 nm e filtri di emissione 580 nm. Se uno scanner fluorescente non è disponibile, utilizzare un transilluminatore a luce blu. Il prodotto RT dovrebbe apparire come uno striscio a partire da sopra il primer RT non esteso (Figura 4).
    NOT: Anche se la colorante colorante per gel acido acido coculico d'oro è facilmente visualizzabile su un documento gel con fonte di luce UV, è fondamentale non esporre il prezioso prodotto RT ai raggi UV per prevenire danni.
  6. Visualizzare il gel su un transilluminatore a luce blu e accisare il prodotto RT dal gel. Si raccomanda di tagliare il DNA con estensioni che vanno da 30-200 nt (Figura 4). Posizionare i pezzi di gel asformati su una superficie pulita e macinare la fetta in piccoli pezzi per aumentare la superficie. Trasferire con attenzione su un tubo da 1,5 mL e aggiungere 800 l di buffer di eluizione del DNA (Tabella 1).
  7. Incubare i pezzi di gel con una leggera miscelazione con buffer di eluizione del DNA durante la notte a temperatura ambiente.
  8. Separare il tampone di eluizione dal gel passando il liquame attraverso una colonna di filtro in acetato di cellulosa (Tabella dei materiali) collocata in un tubo di raccolta da 2 mL.
  9. In tubo da 1,5 mL, lavare 10 o più di perline magnetiche di streptavidin con 500 L di tampone di lavaggio perline di streptavidin (Tabella 1). Ripetere per tre lavamenti totali. Non lasciare asciugare le perline. Risospendere le perline in 10 : L del buffer di eluizione del DNA (Tabella 1).
  10. Trasferire il tampone di eluizione separato dai pezzi di gel al punto 14.8 al tubo contenente le perle magnetiche streptavidinlava lavate.
  11. Incubare con miscelazione delicata per almeno 8 h a temperatura ambiente. Catturare perline su un magnete, rimuovere le perline magnetiche supernatali e respendere le perline magnetiche in 10 -L di acqua senza RNase e trasferirle su un tubo PCR da 0,2 mL.

15. Circolarizzazione del Prodotto RT

  1. I prodotti RT catturati su perline streptavidin sono circolari mentre sono legati su perline. Per il liquame magnetico di perline, aggiungere 2,0 L di 10x buffer di reazione circolari, 1,0 L di 1 mM ATP, 1,0 L di 50 mM MnCl2, 4,0 L di 5 M betaina, 1,0 l di ssDNA ligase I (Tabelladeimateriali), e 1,0 L di RNase-free water.
  2. Incubare la reazione di circolarizzazione su un ciclore termico a 60 gradi centigradi per 4 h. Il calore inattiva la ligase ssDNA i riscaldando a 80 gradi centigradi per 10 minuti, quindi tenere a 4 gradi centigradi.

16. Prova PCR

  1. Prima di procedere a una PCR su larga scala, utilizzare una porzione di prodotto circolare per determinare il numero ideale di cicli di amplificazione per ogni campione. Questo passaggio consente di prevenire l'amplificazione eccessiva e limitare gli artefatti PCR come componenti di reazione PCR diventano limitanti a cicli PCR più elevati.
  2. Preparare una reazione PCR da 45 LlL con 4,0-6,0 l del prodotto circolare a partire dal punto 15,2, 9,0 L di 5 volte buffer di reazione, 0,9 Ll 10 M dNTP, 2,25 M di 10 M PE1.0 primer (Tabella dei materiali), 2,25 l di 10M PE2.0 primer ( Tabella deimateriali) , e 0,045 l di polimerasi del DNA ad alta fedeltà (Tabella dei materiali) e acqua.
  3. Mescolare bene la reazione e dividere in tre reazioni da 15 l. Ognuna di queste tre reazioni sarà soggetta a un numero variabile di cicli PCR. Il numero ideale di cicli dovrebbe essere compreso tra 7 e 14. Quindi eseguire PCR di prova per 8, 11, e 14 cicli.
  4. Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: 98 s - 30 s; 98 s - 5 s; 65 s - 10 s; 72 s - 15 s; 72 s - 2 min; 12 gradi centigradi - tenere premuto.
  5. Aggiungere 3 -L L di 6x gel carico di carico e risolvere su 10% nativo gel PAGE fino a quando il fronte colorante blu ha migrato 3/4 del gel. Macchiare il gel utilizzando la macchia del gel acido nucleico d'oro e l'immagine come nei passi 14.4 e 14.5 (Figura 5).
  6. Per scegliere il numero ideale di cicli PCR, confrontare i prodotti PCR da un numero crescente di cicli. Scegliere il numero di ciclo che produce la massima quantità di prodotto della dimensione prevista senza artefatti di sovraamplificazione (ad esempio, sbavatura di DNA molto più grande del prodotto previsto e in cui non si osserva un esaurimento apprezzabile dei primer PE1.0 e PE2.0 (vedere la freccia rossa Figura 5).

17. PCR su larga scala

  1. Preparare una reazione PCR da 45 LL, come nel passaggio 16,2 e ripetere la PCR. Risolvere la PCR su 10% nativo PAGE a 150 V, macchia con 1x oro nucleico acido gel macchia e immagine su un transilluminatore luce blu.
  2. Accisa il prodotto PCR dal gel e trasferire a una siringa da 3 mL. Utilizzare la siringa per schiacciare il gel ed estrudere in un tubo da 1,5 mL.
    NOT: Il prodotto RT non esteso al momento della circolarizzazione produce un prodotto PCR di 151 bp. Pertanto, in questa fase è necessario ridimensionare selezionare i prodotti che sono superiori a 151 bp (Figura 6).
  3. Aggiungere 900 l di tamponi di eluizione del DNA e incubare a temperatura ambiente durante la notte con una leggera miscelazione.
  4. Trasferire il liquame gel in una colonna di filtro in acetato di cellulosa collocata in un tubo di raccolta da 2 mL. Girare a 12.000 x g per 3 min, raccogliendo supernatant in un tubo fresco.
  5. Aggiungere altri 400 l di tamponi di eluizione del DNA al gel frantumato e trasferirli in un tubo da 1,5 mL. Incubare con miscelazione delicata per altre 4 ore per una seconda eluizione.
  6. Mettere in comune tutte le eluzioni e dividere in 3 tubi con 400 . Precipitare il DNA aggiungendo 1 mL di 100% etanolo e 10 g di glicogeno. Vortice e incubare almeno 2 h a -20 gradi centigradi.
  7. Dna di Pellet a 12.000 x g per 30 min a 4 gradi centigradi. Lavare il pellet di DNA con il 70% di etanolo.
  8. Rimuovere con attenzione tutto l'etanolo pipettando e rispendere rapidamente il pellet di DNA in 20 .
    NOT: In questa fase, è importante non lasciare che il pellet di DNA si asciughi, poiché l'essiccazione del DNA può denaturarlo.
  9. Utilizzare una piccola porzione di campione di DNA per determinare le dimensioni e la concentrazione del prodotto PCR tramite fluorometro e bio/ira/ del DNA ad alta sensibilità. I campioni possono ora essere inviati per la sequenza su una delle piattaforme.
  10. Le letture in sequenza possono essere elaborate (ad esempio, rimozione dell'adattatore, taglio per mantenere le sequenze >30 Phred score), allineate al genoma di riferimento e visualizzate su un browser come il browser del genoma UCSC (Figura 7).

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Risultati

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Un RIPiT di successo comporterà l'immunoprecipitazioni di proteine di interesse e di altre proteine interagenti note, e l'assenza di proteine non interagenti. Come si è visto nella Figura 3A, sia Magoh che EIF4AIII sono stati rilevati nell'eluzione di RIPiT, ma HNRNPA1 non lo era (lane 6). Parallelamente, le impronte di RNA che hanno co-purificato con i complessi RNP sono state rilevate tramite l'autoradiografia (Figura 3B) o il...

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Discussione

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Discutiamo qui alcune considerazioni chiave per eseguire con successo RIPiT. In primo luogo, i singoli IP devono essere ottimizzati per ottenere la massima efficienza possibile in ogni fase. La quantità di perline di agarose FLAG per il numero di ingresso di cellule qui descritte si è dimostrata robusta per una vasta gamma di proteine che abbiamo testato. Poiché solo una piccola frazione delle proteine partner è co-immunoprecipitata con la proteina FLAG, la quantità di anticorpi necessari per un IP secondo efficiente è s...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH GM120209 (GS). Gli autori ringraziano oSUCCC Genomics Shared Resources Core per i loro servizi (CCC Support Grant NCI P30 CA16058).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Gel di affinità anti-FLAGSigmaA2220
ATP, [γ-32P]- 3.000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 &; Siringhe monouso CiPerkinElmerBLU502A250UC
BD con punte Luer-Lok (200)Fisher14-823-435
Betaina 5MSigmaB0300
biotina-dATPTriLinkN-5002
biotina-dCTPPerkin ElmerNEL540001EA
Sonificatore Branson, modello SSE-1Branson
CircLigasi IVWR76081-606ssDNA ligasi I
DMEM, alto glucosioThermoFisher11995-065
tampone di carico del DNA NEBNEB
Dynabeads Protein ALifeTech10002D
Flp-In-T-REx 293 Linea cellulareThermoFisherR78007
GeneRuler Scaladel DNA a basso raggioThermoScientificFERSM1203
Hygromycin BThermoFisher10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 pozzettiBio-Rad4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea GelBio-Rad4566033
miRCAT-33 adattatore 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′Qualsiasiquesto protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
Mirus transIT-X2 reagente di trasfezioneMirusMIR 6004
Mth RNA ligasiNEBE2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACGACGCTCTTGATC*T-3′		Qualsiasiquesto protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC
GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′		Qualsiasidi questo protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
Fenolo/Cloroformio/Alcool isoamilico (25:24:1, pH 6,7, 100 mLl)FisherBP1752I-100
Purple Gel Loading Dye (6x)NEB NEB #7025
Q5 DNA polimerasiNEBM0491S/L
RNasi I, E. coli, 1.000 UEppicenterN6901K
Colonna SPIN-XCorningCLS8160-24EA
Perle di streptavidinaThermoFisher60210
Superscript III (SSIII)ThermoScientific18080044enzima trascrittasi inversa
SybrGoldThermoFisherS11494colorante in gel per acido nucleico in oro
T4 Polinucleotide chinasi-2500UNEBM0201L
T4RNL2 Tr. K227QNEBM0351S
TetraciclinaSigma87128
Termostabile 5&acuto; App DNA/RNA LigasiNEBM0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		Qualsiasiquesto protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Qualsiasiquesto protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA
GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		Qualsiasiquesto protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Qualsiasiquesto protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		Qualsiasiquesto protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		Qualsiasiquesto protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		Qualsiasiquesto protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		Qualsiasidi questo protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTGTGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		Qualsiasiquesto protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT
TCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		Qualsiasiquesto protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT
CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Qualsiasiquesto protocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		Questoprotocollo è compatibile solo con la piattaforma di sequenziamento Illumina
Typhoon 5 Bimolecular ImagerGE Healthcare Life Science29187191

Riferimenti

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