Ottimizzazione, progettazione ed evitare le falle nella immunostiera fluorescente manuale

Summary

L'immunohistochimica fluorescente multiplex è una tecnologia emergente che consente la visualizzazione di più tipi di cellule all'interno del tessuto incorporato in parina (FFPE) intatto. Le linee guida presentate sono linee guida per garantire un multiplex a 7 colori di successo con istruzioni per ottimizzare anticorpi e reagenti, preparare diapositive, progettare e suggerimenti per evitare problemi comuni.

Abstract

La valutazione microambiente del tessuto intatto per l'analisi dell'infiltrazione cellulare e dell'organizzazione spaziale è essenziale per comprendere la complessità dei processi della malattia. Le tecniche principali utilizzate in passato includono l'immunosintochimica (IHC) e l'immunofluorescenza (IF) che consentono la visualizzazione delle cellule come un'istantanea nel tempo utilizzando tra 1 e 4 marcatori. Entrambe le tecniche presentano carenze, tra cui difficoltà a macchiare obiettivi scarsamente antigenici e limitazioni legate alla reattività tra specie. IHC è affidabile e riproducibile, ma la natura della chimica e della dipendenza dallo spettro della luce visibile consente di utilizzare solo pochi marcatori e rende difficile la co-localizzazione. L'uso di IF amplia i potenziali marcatori, ma in genere si basa sul tessuto congelato a causa dell'estesa autofluorescenza dei tessuti dopo la fissazione della formalina. Citometria di flusso, una tecnica che consente l'etichettatura simultanea di più epitopi, abroga molte delle carenze di SE e IHC, tuttavia, la necessità di esaminare le cellule come una singola sospensione cellulare perde il contesto spaziale delle cellule che scartano importanti sostanze biologiche Relazioni. L'immunohistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) collega queste tecnologie consentendo la fenotipizzazione cellulare multi-epitopo nel tessuto incorporato a paraffina fissa di formalina (FFPE), preservando l'architettura complessiva del microambiente e lo spazio relazione delle cellule all'interno di tessuto intatto senza interruzioni. L'alta intensità fluorescente fluorofori che si legano covalentmente all'epitopo tissutale consente l'applicazione multipla di anticorpi primari senza preoccuparsi della reattività incrociata specifica delle specie da parte di anticorpi secondari. Anche se questa tecnologia ha dimostrato di produrre immagini affidabili e accurate per lo studio della malattia, il processo di creazione di un'utile strategia di colorazione mfIHC può richiedere molto tempo e richiede molto tempo e richiede grazie a un'ampia ottimizzazione e progettazione. Al fine di creare immagini robuste che rappresentano interazioni cellulari accurate in loco e per mitigare il periodo di ottimizzazione per l'analisi manuale, presentate qui sono metodi per la preparazione delle diapositive, l'ottimizzazione degli anticorpi, la progettazione del multiplex e gli errori comunemente riscontrato durante il processo di colorazione.

Introduction

La visualizzazione di un microambiente tumorale intatto (TME) è essenziale nella valutazione non solo dell'infiltrazione cellulare nelle neoplasie solide, ma anche delle interazioni tra cellule e cellule. L'immunoistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) è emersa come uno strumento efficace per la fenofitipo multi-antigene delle cellule nello studio del cancro e delle malattie associate^{1,2,3,4, 5,6,7}. Questo, in combinazione con nuovi s....

Protocol

Tutto il lavoro è stato approvato dal comitato di revisione interna dell'Università del Michigan.

1. Ottimizzazione degli anticorpi primari e preparazione dello scivolo

1. Determinare la concentrazione ideale di anticorpi per multiplex utilizzando IHC convenzionale.
   1. Testare gli anticorpi per il multiplex mediante immunoistochimica convenzionale manuale (IHC)¹³.
   2. Utilizzare tessuti specifici che hanno un tipo di cellula abbondante per ogni anticorpo testato come l'utilizzo di tessuto tonsille per il test anticorpale CD3.
   3. Utilizzare la concentrazione di riferimento per IHC raccomandata d....

Results

Il processo complessivo di ottenimento di un multiplex assay a 7 colori segue un modello ripetitivo. Figura 1 descrive il processo in una forma diagrammatica. Una volta che i vetrini vengono tagliati e asciugati o vengono ricevuti dal laboratorio e cotti in un forno di ibridazione a 60 gradi centigradi per 1 h, quindi procedere alla deparaffinazione e alla reidratazione, fissare nuovamente i vetrini in formalina seguiti dal recupero dell'antigene. Ogni round di multiplexing inizia al recuper.......

Discussion

I campioni di tessuto intatti della biopsia tumorale solida e della resezione chirurgica rimangono importanti strumenti diagnostici e predittivi per l'analisi della malattia e la prognosi del paziente. L'immunohistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) è una nuova tecnica che combina i benefici dell'immunostochimica (IHC), l'immunofluorescenza (IF) e la citometria di flusso. Precedenti metodi per sondare le cellule in situ hanno permesso la valutazione delle disposizioni da cellula a cellula in un ambiente tissutale

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% etanolo	Fisher	HC8001GAL
70% etanolo	Fisher	HC10001GL
95% etanolo	Fisher	HC11001GL
Software di analisi	Akoya Biosciences	CLS135783	inForm versione 2.3.0
Montante antisbiadimento	ThermoFisher	P36961	ProLong
Diamond Blocking solution	Vector	SP-6000	Bloxall
Albumina di siero bovino (BSA)	Sigma Life Sciences	A9647-100G
Vetrini di copertura	Fisher	12-548-5E
Salvietta delicata	Kimberly-Clark	34120
Diluente	fluorescente Akoya Biosciences	ARD1A01EA	Diluente opale TSA
Fluoroforo 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	1:100
Fluoroforo 540	Akoya Biosciences	FP1494001KT	1:100
Fluoroforo 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	1:100
Fluoroforo 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	1:100
Fluoroforo 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	1:100
Fluoroforo 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	1:100
Fluoroforo DAPI	Akoya Biosciences	FP1490	3 gocce in TBST o PBS
Scatola resistente al calore	Tissue-Tek	25608-904	Scatola di vetrini in plastica-camera
umidificata	Ibi Scientific	AT-12
Forno di ibridazione	FisherBiotech
Penna barriera idrofobica	Microscopio vettoriale	H-4000	ImmEdge
	Perkin Elmer	CLS140089	Mantra workstation di patologia quantitativa
Microonde	Panasonic	NN-A661S	con tecnologia inverter
Formalina tamponata neutra	Fisher Scientific	SF100-4	10% formalina tamponata neutra
pH 6 tampone tampone per il recupero dell'antigene	Akoya Biosciences	AR600	AR6
Tampone per il recupero dell'antigene pH 9	Akoya Biosciences	AR900	AR9
Soluzione salina tamponata con fosfato	Fisher	BP3994	PBS
Scatola di vetrini in plastica	Tissue-Tek	25608-906
Involucro di plastica	Fisher	NC9070936
Polisorbato 20	Fisher	BP337-800	Tween 20
Primario anticorpo CD163	Lecia	NCL-LCD163	1:400
Anticorpo primario CD3	Dako	A0452	1:400
Anticorpo primario CD8	Spring Bio	M5390	1:400
Anticorpo primario FOXP3	Dako	M3515	1:400
Anticorpo primario pancitocheratina	Cell Signaling	12653	1:500
Anticorpo primario PD-L1	Cell Segnalazione	13684	1:200
Anticorpo	secondario Akoya Biosciences	ARH1001EA	Polimero opale
Set di coloranti per vetrini	Microscopia elettronica	Scienze 6254001
soluzione salina tamponata Tris	Corning	46-012-CM	TBS
Rack verticale per vetrini	Microscopia elettronica Scienze	50-294-72
Xilene	Fisher