Articolo metodologico
Questo protocollo descrive come eseguire rapidi analisi della luciferasi a basso costo a medio-velocità utilizzando una luciferasi Gaussia legata all'insulina come proxy per la secrezione di insulina dalle cellule beta. Il saggio può essere eseguito con la maggior parte dei lettori di lastre di luminescenza e pipette multicanale.
L'esecuzione di saggi basati su anticorpi per la raccolta post-campione di insulina secreta richiede di solito da poche ore a un giorno di tempo di analisi e può essere costoso, a seconda del saggio specifico. Luciferasi secreto saggia risultati accelerare i risultati e ridurre sostanzialmente il costo di analisi per campione. Qui presentiamo un approccio relativamente sottoutilizzato per misurare l'attività di venosacre dell'insulina dalle cellule del pancreas utilizzando Gaussia luciferate geneticamente inserite all'interno del peptide C. Durante l'elaborazione proteolitica del proinsulino, il peptide C viene ascisa rilasciando la luciferasi all'interno della vescica secretoria dell'insulina dove è co-secreto con insulina. I risultati possono essere ottenuti pochi minuti dopo la raccolta del campione a causa della velocità dei saggi luciferasi. Una limitazione del saggio è che si tratta di una misurazione relativa della secrezione di insulina e non una quantificazione assoluta. Tuttavia, questo protocollo è economico, scalabile e può essere eseguito utilizzando la maggior parte dei lettori di lastre di luminescenza standard. Pipette analogiche e digitali multicanale facilitano più passaggi del saggio. Molte diverse varianti sperimentali possono essere testate contemporaneamente. Una volta deciso un insieme mirato di condizioni, le concentrazioni di insulina dovrebbero essere misurate direttamente utilizzando saggi basati su anticorpi con curve standard per confermare i risultati del test luciferasi.
Il metodo qui presentato consente di testare rapidamente e convenientemente la secrezione di insulina proveniente da una linea di cellule beta geneticamente modificate in formato 96-well-plate. La chiave di questo protocollo è una versione modificata dell'insulina con la Gaussia luciferasi (GLuc, 18 kDa) inserita (vedi figura 1)nel peptide C per generare insulina-Gaussia (InsGLuc)1,2. Altre proteine più grandi, come GFP (25 kDa), sono state inserite con successo nel peptide C dell'insulina e hanno esibito l'atteso trattamento post-traduzionale dal proinsulino-GFP ....
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1. Preparazione di reagenti, supporti e buffer (tabella 1)
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Per misurare le prestazioni del saggio in condizioni di controllo, è possibile completare una semplice curva dose-risposta del glucosio o una stimolazione utilizzando il paradigma del diazossido. Nel caso del primo, pre-incubare le cellule per 1 h in condizioni prive di glucosio, seguito dal trattamento di 1 h con crescenti concentrazioni di glucosio dovrebbe comportare una scarsa attività secretoria a e al di sotto di 5 mM, mentre si osserva una maggiore secrezione sopra 8 glucosio mM (<.......
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Qui presentiamo un metodo per valutare rapidamente le risposte di secrezione di insulina stimolate dal glucosio dalle cellule MIN6. Per le migliori risposte nel saggio è importante seminare le cellule MIN6 alla densità corretta e permettere loro di diventare 85-95% confluente. In questo modo le risposte delle cellule al glucosio a causa del miglioramento dei contatti cellulare-cellulare e della sincronizzazione, che si verifica sia negli isolotti primari17,18
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Gli autori ringraziano tutti gli attuali ed ex membri del laboratorio Cobb per il lavoro prezioso e le discussioni, e Dionne Ware per l'assistenza amministrativa. Michael Kalwat è supportato da una Juvenile Diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Questo lavoro è stato reso possibile attraverso NIH R37 DK34128 e Welch Foundation Grant I1243 a Melanie Cobb. Le prime parti di questo lavoro sono state sostenute anche da un NIH F32 DK100113 a Michael Kalwat.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali per colture cellulari | |||
| rIns-GLuc cellule MIN6 | Linea cellulare MIN6 parentale che esprime stabilmente pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc e mantenuta in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4,5 g/L di glucosio media |
| fetale bovino, inattivato termicamente | Sigma | F4135 | |
| Penicillina/ Streptomicina | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoetanolo | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutammina | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Tripsina-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Soluzione madre 250 mg/mL in acqua. Congelare le aliquote a -20°C. |
| Palloni per coltura tissutale T75 | Fisher | Scientific 07-202-000 | |
| Piastre per coltura tissutale a 96 pozzetti | Celltreat | 229196 | |
| Serbatoi di reagenti (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Nome | >Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Reagenti per saggi di secrezione | |||
| BSA (grado RIA) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucosio | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific 15568414 | ||
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Farmaci opzionali per esperimenti di stimolazione | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Soluzione stock: 50 mM in 0,1N NaOH. Aggiungere una quantità uguale di 0,1 N di HCl a qualsiasi tampone in cui viene aggiunto diazossido. |
| epinefrina (sale bitartrato) | Sigma | E4375 | Soluzione madre: 5 mM in acqua |
| PMA (forbolo 12-miristato) | Sigma | P1585 | Soluzione madre: 100 &; M in DMSO |
| strong>Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glicerolo | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Bromuro di sodio | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Soluzione madre: 0,5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000,0 | Soluzione madre: 1 M pH 8 |
| Acido ascorbico | Fisher Scientific | AAA1775922 | Il brevetto statunitense US7718389 suggerisce che l'ascorbato può aumentare la stabilità della celeterazina. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | Il brevetto USA US8367357 suggerisce che il solfito può ridurre il fondo a causa della |
| BSA Coelenterazina (nativa) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Soluzione madre: 1 mg/ml in MeOH acidificato (2,36 mM) |
| OptiPlate-96, bianco opaco 96-pozzetto Micropiastra | Perkin Elmer | 6005290 | Qualsiasi piastra bianca opaca a 96 pozzetti dovrebbe essere sufficiente. Funzioneranno anche piastre inferiori chiare, tuttavia parte del segnale andrà perso. |
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Lettore di piastre ibrido o equivalente | BioTek | 8041000 | È necessario un lettore di piastre con rilevamento della luminescenza e capacità di piastra a 96 pozzetti. |
| Pipetta VOYAGER a 8 canali (50-1250 &; micro; L) | Integra | 4724 | Una pipetta multicanale automatizzata è estremamente utile per l'aggiunta rapida di reagenti luciferasi e celle di placcatura in formato 96 pozzetti |
| a 8 canali 200 & micro; L pipetta | Transferpette S 20-200 µ L | 2703710 |
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