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Articolo metodologico

Misurazione della secrezione relativa dell'insulina utilizzando un surrogato Luciferase co-secreted

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⸱

DOI:

10.3791/59926

⸱

25 giugno 2019

 , 
1Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Center

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive come eseguire rapidi analisi della luciferasi a basso costo a medio-velocità utilizzando una luciferasi Gaussia legata all'insulina come proxy per la secrezione di insulina dalle cellule beta. Il saggio può essere eseguito con la maggior parte dei lettori di lastre di luminescenza e pipette multicanale.

Abstract

L'esecuzione di saggi basati su anticorpi per la raccolta post-campione di insulina secreta richiede di solito da poche ore a un giorno di tempo di analisi e può essere costoso, a seconda del saggio specifico. Luciferasi secreto saggia risultati accelerare i risultati e ridurre sostanzialmente il costo di analisi per campione. Qui presentiamo un approccio relativamente sottoutilizzato per misurare l'attività di venosacre dell'insulina dalle cellule del pancreas utilizzando Gaussia luciferate geneticamente inserite all'interno del peptide C. Durante l'elaborazione proteolitica del proinsulino, il peptide C viene ascisa rilasciando la luciferasi all'interno della vescica secretoria dell'insulina dove è co-secreto con insulina. I risultati possono essere ottenuti pochi minuti dopo la raccolta del campione a causa della velocità dei saggi luciferasi. Una limitazione del saggio è che si tratta di una misurazione relativa della secrezione di insulina e non una quantificazione assoluta. Tuttavia, questo protocollo è economico, scalabile e può essere eseguito utilizzando la maggior parte dei lettori di lastre di luminescenza standard. Pipette analogiche e digitali multicanale facilitano più passaggi del saggio. Molte diverse varianti sperimentali possono essere testate contemporaneamente. Una volta deciso un insieme mirato di condizioni, le concentrazioni di insulina dovrebbero essere misurate direttamente utilizzando saggi basati su anticorpi con curve standard per confermare i risultati del test luciferasi.

Introduzione

Il metodo qui presentato consente di testare rapidamente e convenientemente la secrezione di insulina proveniente da una linea di cellule beta geneticamente modificate in formato 96-well-plate. La chiave di questo protocollo è una versione modificata dell'insulina con la Gaussia luciferasi (GLuc, 18 kDa) inserita (vedi figura 1)nel peptide C per generare insulina-Gaussia (InsGLuc)1,2. Altre proteine più grandi, come GFP (25 kDa), sono state inserite con successo nel peptide C dell'insulina e hanno esibito l'atteso trattamento post-traduzionale dal proinsulino-GFP all'insulina e gFP-C-peptide3,4. Per il saggio in questo protocollo, GLuc è stato ottimizzato per la codone per l'espressione dei mammiferi e sono state introdotte due mutazioni per migliorare la cinetica simile al bagliore5,6. Molteplici combinazioni e repliche delle condizioni di trattamento possono essere facilmente testate in formato 96-well-plate e i risultati della secrezione possono essere ottenuti immediatamente dopo l'esperimento.

Un vantaggio importante, come precedentemente osservato2, è il basso costo di questa misurazione della secrezione a base di luciferasi (< 0,01 USD/bene) che la differenzia dai costi relativamente più elevati e dagli aspetti tecnici dei saggi immunosorbena (ELISA) legati agli enzimi ( > 2 USD/bene) e la fluorescenza oomogenea risolta nel tempo (HTRF) o altri saggi basati sul trasferimento di energia di risonanza fàrster (FRET). Rispetto a questi saggi basati su anticorpi, che misurano la concentrazione di insulina facendo riferimento a una curva standard, il saggio di InsGLuc misura l'attività secretoria come un confronto relativo ai pozzi di controllo sulla piastra. Per questo motivo, ogni esperimento richiede l'inclusione di controlli adeguati. Questa distinzione è un compromesso per consentire misurazioni rapide ed economiche. Tuttavia, la secrezione di InsGLuc ha dimostrato di essere altamente correlata alla secrezione di insulina misurata da ELISA1,2. Questa tecnologia è stata scalata per lo screening ad alto throughput1,2,7 e ha portato all'identificazione di nuovi modulatori di secrezione di insulina tra cui un inibitore del canale di potassio tensione-gated7 così come un inibitore naturale del prodotto della funzione cellulare, la cromomicina A28. L'uso di InsGLuc è più appropriato per i ricercatori che intendono testare continuamente molte condizioni di trattamento diverse per il loro impatto sulla secrezione di insulina. Negli esperimenti di follow-up è necessario ripetere i risultati chiave in una linea cellulare di z, e in modo ottimale in isolotti murini o umani, e misurare la secrezione di insulina utilizzando un saggio basato su anticorpi.

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Protocollo

1. Preparazione di reagenti, supporti e buffer (tabella 1)

  1. Preparare il supporto MIN6 completo in 500 mL di penicillina ad alto glucosio (4,5 g/L) Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) con i seguenti additivi: 15% siero bovino fetale (FBS), 100 unità/mL penicillina, 100 g/mL streptomycin, 292g/mL L-amine, 500 il mercaptoetanolo.
    NOTA: La linea cellulare stabile in questo caso viene mantenuta in 250 g/mL di antibiotico G418.
  2. Preparare il buffer di bicarbonato Krebs-Ringer (KRBH) creando una soluzione contenente 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7.4), 24 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2e 1 album di siero bovino mg/mL mg/mL di grado bovino (BSA). Il glucosio deve essere aggiunto dove specificato da un titolo di 2 M.
    NOTA: KRBH viene utilizzato per incubare le cellule con e senza stimolazione al fine di valutare l'insulina e/o la secrezione di luciferasi.
  3. Preparare la soluzione stock coelenterazine (PT) come segue. Preparare il metanolo acidificato aggiungendo 106 -L di HCl concentrato a 10 mL di metanolo. Successivamente, sciogliere l'XT lofilizzato nel metanolo acidificato a 1 mg/mL e conservare a -80 gradi centigradi in tubi a vite.
    NOTA: Questi stock mantengono un'attività sufficiente nei saggi luciferasi di routine, anche dopo 1 anno di conservazione adeguata.
  4. Preparare Gaussia luciferase (GLuc) assaggio buffer basato sulla letteratura9 così come le informazioni sui brevetti10 per aiutare in emivita del saggio di luciferasi della Gaussia in formato 96 ben piastra. Utilizzare la formula: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mg/mL Na2PO4, 300 mM sodio ascorbate, 200 mM Na2SO3 in acqua. Congelare le scorte a -20 gradi centigradi. Dopo lo scongelamento, conservare il buffer a 4 gradi centigradi.
  5. Per preparare la soluzione di lavoro della lucifera di Gaussia, aggiungere al buffer di analisi GLuc 4,2 l/mL della soluzione di 1 mg/mL (2,36 mM) di Unità XT. Questo si traduce in una soluzione di lavoro 2x di 10 M IN XT che avrà una concentrazione finale di 5 M nel saggio.

2. Cultura delle cellule InsGLuc MIN6 e semina per i saggi di secrezione

  1. Per colture cellule MIN6, tripsinizzare e semiare le cellule una volta alla settimana utilizzando tecniche di coltura cellulare standard. Cambiare i supporti sulle celle ogni due o tre giorni. Includere nel supporto un antibiotico di selezione appropriato, ad esempio 250 g/mL di G418.
    1. Per fornire un numero sufficiente di cellule settimanalmente per gli esperimenti, mantenere le cellule in flaconi T75. Semina 6 x 106 cellule per T75 in 10 mL di supporti in genere produrrà 30 x 106 a 40 x 106 celle totali per T75 dopo 7 giorni di coltura.
  2. Per preparare le cellule per la placcatura in piastre da 96 pozzetti, lavare due volte un T75 confluente di cellule InsGLuc MIN6 con PBS e aggiungere 2 mL di provetterina. Incubare a 37 gradi centigradi per 5 min o fino a quando le cellule si dissociano dal pallone. Determinare la concentrazione cellulare per millililatore.
    1. Diluire le celle in un supporto completo a 1 x 106 celle/mL per ottenere 1 x 105 celle in 100 : l per pozzo in una piastra di 96 pozzetti. Le cellule devono essere sufficientemente confluenti per il saggio dopo 3-4 giorni.
      NOTA: Per estendere il periodo di coltura, metà della concentrazione cellulare può essere placcata. I cambiamenti dei media non sono necessari prima del giorno del saggio a meno che le cellule non siano sottoposte a trattamenti sperimentali.

3. Saggio gaussia luciferasi secrezione

  1. Il giorno del saggio preparate abbastanza KRBH per l'esperimento (passaggio 1.2). Sono necessari almeno 50 mL di KRBH per piastra da 96 pozzetti, quindi preparare almeno 75 mL per garantire un buffer sufficiente per l'esperimento. Preparare un buffer aggiuntivo se diverse combinazioni di condizioni di trattamento farmacologico richiederanno KRBH per la diluizione.
  2. Preparare un serbatoio con KRBH senza glucosio. Decantare il mezzo da 96-well plate(s) invertendo rapidamente la piastra su un lavandino di laboratorio e poi macchiare saldamente su una pila di tovaglioli di carta per rimuovere il mezzo in eccesso.
  3. Utilizzando una pipetta elettronica o manuale a 8 canali, pipetta 100 -L /well KRBH dal serbatoio attraverso le lastre di 96 pozzi. Ripetere per un totale di due lavamenti.
  4. (Passaggio facoltativo dei trattamenti composti acuti) Se non esegue trattamenti farmacologici, procedere con i passaggi 3.5 e 3.6 senza modifiche. Per testare gli effetti di piccole molecole sulla secrezione di insulina, i composti possono essere aggiunti alle cellule durante il periodo di preincubazione, il periodo di stimolazione o entrambi.
    1. Una tecnica è quella di aggiungere composti in lotto al KRBH in tubi da 1,5 mL e utilizzare una pipetta digitale a 8 canali regolabile per trasferire il farmaco-KRBH dai tubi alle cellule in piastre di 96 pozzi.
      NOTA: Se non è disponibile una pipetta regolabile, è possibile creare una piastra replica 96 po' di droga-KRBH e utilizzare una pipetta standard a 8 canali per trasferire il buffer. Ulteriori modifiche al paradigma di trattamento possono essere apportate per trattare le cellule per 24 h nei media prima del saggio, come descritto in precedenza1,8.
  5. Aggiungere 100 L di KRBH contenente la concentrazione desiderata di glucosio o composti e mettere il piatto nell'incubatrice a 37 gradi centigradi per 1 ora.
    NOTA: A seconda del layout sperimentale, è estremamente utile avere una pipetta elettronica multicanale che consenta di eseguire la transizione delle distanze del canale da una colonna di otto tubi da 1,5 mL alle 8 fileni di una piastra di 96 pozze.
  6. Dopo l'1 h di preincubazione, decantare il tampone nel lavandino e macchiare saldamente su un tovagliolo di carta. Aggiungere 100 l di KRBH senza glucosio per bene per lavare via lo sfondo accumulato di Luciferasi Gaussia. Decant la piastra di nuovo e aggiungere il controllo e le condizioni stimolanti alla piastra a 100 .L per bene. Collocare il piatto nell'incubatrice a 37 gradi per 1 ora.
  7. Raccogliere con cura 50 -L di supernatant utilizzando una pipetta multicanale, cambiando le punte tra le condizioni di trattamento, se necessario, e trasferire il supernatante in una piastra di saggio bianca bianca pulita da 96 piani.
    NOTA: Le piastre chiare con pareti bianche possono essere utilizzate se necessario, anche se una quantità significativa di segnale luciferasi andrà persa.
  8. Dopo la raccolta di 50 -L di KRBH supernatant, il campione può essere analizzato immediatamente. Se necessario, sigillare e conservare i campioni a 4 gradi centigradi per un paio di giorni (attività GLuc emivita di 6 giorni) o -20 gradi centigradi per un mesedi 11,12.

4. Segreto Gaussia luciferasi assay

  1. Per preparare la soluzione di lavoro dei divini GLuc, pipettare la quantità necessaria di soluzione di stock di CTz (4,2 l/mL) nel buffer di asdetto GLuc. Per evitare il riscaldamento della TTz, pipettare rapidamente il TTz al congelatore -80 gradi o tenere il tubo sul ghiaccio secco.
  2. Utilizzando una pipetta elettronica multicanale, aggiungere rapidamente 50 l della soluzione di lavoro di prova GLuc per bene attraverso il piatto 96-well contenente i supernatants KRBH raccolti. Se ci sono goccioline sui lati di eventuali pozzi, ruotare brevemente la piastra in una centrifuga da tavolo-top-secchio.
  3. Leggete la luminescenza in un lettore di lastre adatto in pochi minuti e leggete ogni pozzo con un tempo di integrazione di 0,1 s.

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Risultati

Per misurare le prestazioni del saggio in condizioni di controllo, è possibile completare una semplice curva dose-risposta del glucosio o una stimolazione utilizzando il paradigma del diazossido. Nel caso del primo, pre-incubare le cellule per 1 h in condizioni prive di glucosio, seguito dal trattamento di 1 h con crescenti concentrazioni di glucosio dovrebbe comportare una scarsa attività secretoria a e al di sotto di 5 mM, mentre si osserva una maggiore secrezione sopra 8 glucosio mM (<...

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Discussione

Qui presentiamo un metodo per valutare rapidamente le risposte di secrezione di insulina stimolate dal glucosio dalle cellule MIN6. Per le migliori risposte nel saggio è importante seminare le cellule MIN6 alla densità corretta e permettere loro di diventare 85-95% confluente. In questo modo le risposte delle cellule al glucosio a causa del miglioramento dei contatti cellulare-cellulare e della sincronizzazione, che si verifica sia negli isolotti primari17,18

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano tutti gli attuali ed ex membri del laboratorio Cobb per il lavoro prezioso e le discussioni, e Dionne Ware per l'assistenza amministrativa. Michael Kalwat è supportato da una Juvenile Diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Questo lavoro è stato reso possibile attraverso NIH R37 DK34128 e Welch Foundation Grant I1243 a Melanie Cobb. Le prime parti di questo lavoro sono state sostenute anche da un NIH F32 DK100113 a Michael Kalwat.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiali per colture cellulari
rIns-GLuc cellule MIN6Linea cellulare MIN6 parentale che esprime stabilmente pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc e mantenuta in 250 ug/ml G418
DMEMSigmaD64294,5 g/L di glucosio media
fetale bovino, inattivato termicamenteSigmaF4135
Penicillina/ StreptomicinaThermo-Fisher ScientificSV30010
beta-mercaptoetanoloThermo-Fisher ScientificBP 176-100
glutamminaThermo-Fisher ScientificBP379-100
Tripsina-EDTASigmaT3924-500
G418Gold BiotechnologyG418-10Soluzione madre 250 mg/mL in acqua. Congelare le aliquote a -20°C.
Palloni per coltura tissutale T75FisherScientific 07-202-000
Piastre per coltura tissutale a 96 pozzettiCelltreat229196
Serbatoi di reagenti (50 mL)Corning4870
Nome>AziendaNumero di catalogoComments
Reagenti per saggi di secrezione
BSA (grado RIA)Thermo-Fisher Scientific50-146-952
D-(+)-GlucosioSigmaG8270-1KG
KClThermo-Fisher ScientificP217-500
NaClThermo-Fisher ScientificS271-3
Hepes, pH 7.4Thermo-Fisher Scientific50-213-365
NaHCO3Thermo-Fisher Scientific 15568414
MgCl2Thermo-Fisher ScientificM9272-500G
CaCl2SigmaC-7902
NameCompanyNumero di catalogoComments
Farmaci opzionali per esperimenti di stimolazione
DiazoxideSigmaD9035Soluzione stock: 50 mM in 0,1N NaOH. Aggiungere una quantità uguale di 0,1 N di HCl a qualsiasi tampone in cui viene aggiunto diazossido.
epinefrina (sale bitartrato)SigmaE4375Soluzione madre: 5 mM in acqua
PMA (forbolo 12-miristato)SigmaP1585Soluzione madre: 100 &; M in DMSO
strong>NomeAziendaNumero di catalogoComments
Guassia assay materials
Disodium phosphate (Na2HPO4)Thermo-Fisher ScientificS374-500
GliceroloThermo-Fisher ScientificG334
Bromuro di sodioThermo-Fisher ScientificAC44680-1000
EDTAThermo-Fisher ScientificAC44608-5000Soluzione madre: 0,5 M pH 8
Tris baseRPIT60040-1000,0Soluzione madre: 1 M pH 8
Acido ascorbicoFisher ScientificAAA1775922Il brevetto statunitense US7718389 suggerisce che l'ascorbato può aumentare la stabilità della celeterazina.
Na2SO3SigmaS0505-250GIl brevetto USA US8367357 suggerisce che il solfito può ridurre il fondo a causa della
BSA Coelenterazina (nativa)Nanolight / Prolume3035MGSoluzione madre: 1 mg/ml in MeOH acidificato (2,36 mM)
OptiPlate-96, bianco opaco 96-pozzetto MicropiastraPerkin Elmer6005290Qualsiasi piastra bianca opaca a 96 pozzetti dovrebbe essere sufficiente. Funzioneranno anche piastre inferiori chiare, tuttavia parte del segnale andrà perso.
NameAziendaNumero di catalogoComments
Equipment
Synergy H1 Lettore di piastre ibrido o equivalenteBioTek8041000È necessario un lettore di piastre con rilevamento della luminescenza e capacità di piastra a 96 pozzetti.
Pipetta VOYAGER a 8 canali (50-1250 &; micro; L)Integra4724Una pipetta multicanale automatizzata è estremamente utile per l'aggiunta rapida di reagenti luciferasi e celle di placcatura in formato 96 pozzetti
a 8 canali 200 & micro; L pipettaTransferpette S 20-200 µ L2703710
stabili siero <

Riferimenti

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