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Articolo metodologico

Il rilevamento di 5-Hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi

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DOI:

10.3791/59950

⸱

19 settembre 2019

 ,  ,  ,  , 
1The Children's Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine, Zhejiang University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule e tessuti cerebrali, utilizzando immunofluorescenza colorazione e metodi di DNA dot-blot.

Abstract

Sono state identificate diverse modifiche del DNA nel genoma dei mammiferi. Di questi, sono stati studiati intensamente i meccanismi epigenetici mediati da 5-metilcytosina e 5-idrossimethylcytosine. 5-idrossimetilcitosina mostra caratteristiche dinamiche durante lo sviluppo embrionale e postnatale del cervello, svolge una funzione regolatrice nell'espressione genica, ed è coinvolto in più disturbi neurologici. Qui, descriviamo i metodi dettagliati tra cui l'immunofluorescenza colorazione e DNA dot-blot per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule coltivate e tessuti cerebrali del topo.

Introduzione

Le modifiche epigenetiche, tra cui la modificazione del DNA, la modificazione dell'istone e la modificazione dell'RNA, hanno dimostrato di svolgere funzioni essenziali in diversi processi biologici e malattie1,2,3, 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7. Per lungo tempo, la metilazione del DNA (cioè la metilcitosina 5 mC) è stata vista come un marcatore epigenetico altamente stabile e non può essere ulteriormente modificata nel genoma. Recentemente, è stato scoperto che 5-mC potrebbe essere ossidato a 5-idrossimetilcitosina (5-hmC) da TET (Dieci-undici traslocazioni) proteine di famiglia tra cui TET1, TET2, e TET38,9. Ulteriori studi dimostrano che 5-hmC potrebbe fungere da marcatore stabile e svolgere ruoli biologici attraverso la regolazione dell'espressione genica4,10,11,12.

Le prove attuali indicano che 5-hmC è altamente arricchito nei tessuti neuronali / cellule rispetto ad altri tipi di tessuti nei mammiferi, e presenta caratteristiche dinamiche durante lo sviluppo neuronale13,14. Nel sistema neuronale, le modifiche epigenetiche mediate a 5-hmC svolgono un ruolo importante nella regolazione delle cellule staminali neurali, dell'attività neuronale, dell'apprendimento e della memoria, ed è coinvolta in molteplici disturbi neurologici tra cui la sindrome di Rett, l'autismo, l'Alzheimer malattia di Huntington, ecc.2,13,15,16,17,18,19,20.

Ci sono diversi approcci per rilevare 5-hmC in cellule e tessuti14,21,22,23,24. Qui, descriviamo due metodi per rilevare l'esistenza di 5-hmC e quantificare il livello globale di 5-hmC: colorazione immunofluorescenza e DNA dot-blot. Questi due metodi sono convenienti e sensibili, e sono stati utilizzati con successo negli studi precedenti25,26,27,28,29,30. I passaggi chiave di questi due metodi sono la denaturazione del DNA. Per la colorazione immunofluorescenza di 5-hmC, è necessario pre-trattamento di campioni con 1 M HCl. Per una macchia di punti da 5-hmC, la denaturazione del DNA viene eseguita con soluzione NaOH. Questi due metodi insieme al sequenziamento di nuova generazione sono strumenti molto utili per studiare la funzione di 5-hmC.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Hejiang.

1. La coltura delle cellule staminali neurali adulte e dei neuroni

  1. Isolare le cellule staminali neurali adulte dal prosencefalo di un adulto (8-10 settimane) mouse maschio C57/BL6 come descritto in precedenza31,32.
  2. Coltura cellule staminali neurali adulte in DMEM/F-12 medio contenente 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% supplemento B27, 1% antibiotico-antimiocolotico, e 2 mM L-Glutamine in un 5% DI CO2 incubatore a 37 . Indurre la differenziazione delle cellule staminali neurali adulte con 1 acido retinoico di M e 5 m forskolin per 48 h come descritto in precedenza31,32.
  3. Isolare i neuroni dal giorno embrionale 17 (E17) ippocampi del topo e della coltura con mezzo neurobasale contenente 0.25% L-Glutamine, 0.125% GlutaMax e 2% B27 supplemento in un 5% DI CO2 incubatore a 37 gradi centigradi come precedentemente descritto33.

2. Perfusione transcardiale del topo

  1. Preparare il 10% di idrato cloro, il 4% di paraformaldeide (PFA) e la salina tamponata di fosfato (PBS) un giorno prima dell'esperimento, e conservare a 4 gradi centigradi.
  2. Anestesizzare un topo adulto maschio o femmina C57 BL/6J con 10% di idrato cloro (50 mg/kg, i.p.), e assicurarsi che l'animale sia profondamente anestesizzato controllando la reazione del corpo. Fissare ogni arto con nastro adesivo su una scheda di plastica (in posizione faccia a faccia in su).
  3. Tagliare la pelle e poi il muscolo con forbici chirurgiche. Aprire la cavità toracica con una forbice chirurgica. Esporre il cuore e tagliare una piccola parte dell'atrio destro con una forbice chirurgica fine.
  4. Perfondere il topo con una siringa sterilizzata usa e getta da 10 mL dal ventricolo sinistro con PBS freddo (circa 30 mL per topo adulto).
  5. Perfondere il topo con 4% PFA (circa 30 mL in 10 min per topi adulti) fino a quando non è rigido.
  6. Aprire il cranio del topo con pinze ossee. Rimuovere il cervello e mettere in 5 mL di 4% PFA in un tubo di centrifuga 15 mL per post-fissazione a 4 gradi centigradi.
    NOT: Pulire l'area chirurgica al termine dell'intervento chirurgico.
  7. Almeno 24 h più tardi, trasferire i campioni di cervello in una soluzione di saccarosio 30% per la completa disidratazione a 4 gradi centigradi.

3. Sezionamento del cervello

  1. Incorporare i campioni cerebrali in composto ottimale per la temperatura di taglio (OCT) in un piccolo contenitore e raffreddati a -20 gradi centigradi per almeno 1 h.
  2. Sezione campioni cerebrali con uno spessore di 20-40 m con un microtoma criostatista.
  3. Raccogliere le sezioni in PBS e conservare a 4 gradi centigradi.

4. Immunofluorescenza Colorazione

  1. Raccogliere le sezioni con le regioni cerebrali mirate e metterli in una piastra di 24 pozze con PBS. Per le celle coltivate su un coverslip, andare direttamente al passaggio 4.2.
  2. Lavare con PBS sullo shaker a temperatura ambiente per 10 min. Ripetere questo due volte di più.
  3. Rimuovere PBS e trattare con preriscaldato 1 M HCl per 30 min a 37 gradi centigradi.
    NOT: Preparare 1 M HCl aggiungendo 1 mL di acido cloridrico (36-38%) in 10 mL di acqua in un cappuccio chimico. Preriscaldare 1 M HCl nell'incubatrice a 37 gradi centigradi.
  4. Lavare i campioni con PBS per 5 min.
  5. Campioni a blocchi con PBS contenenti il 3% del siero di capra normale e lo 0,1% Triton X-100 per 1 h sullo shaker a temperatura ambiente.
  6. Incubare sezioni con anticorpi primari specifici durante la notte a 4 gradi centigradi sullo shaker.
    NOT: Utilizzare i seguenti anticorpi primari: anticorpi del coniglio policlonale anti-5-idrossimetilcitosina (1:5.000), anticorpo monoclonale murino anti-NeuN (1:500).
  7. Estrarre i campioni e incubare ulteriormente a temperatura ambiente per 1 h.
  8. Lavare i campioni con PBS per 10 min. Ripetere questo due volte di più.
  9. Incubare con anticorpi secondari corrispondenti agli anticorpi primari a temperatura ambiente per 1 h sullo shaker. Coprire la piastra con l'alluminio.
    NOT: Utilizzare i seguenti anticorpi secondari: Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgG (1:500), Alexa Fluor 568 capra anti-topo IgG (1:500). Nuclei controstain con 4'6-diamidino-2-fenilindole (DAPI).
  10. Lavare i campioni con PBS per 10 min sullo shaker. Ripetilo altre due volte.
  11. Montare le sezioni cerebrali sui vetrini, aggiungere una quantità adeguata di supporto di montaggio anti-dissolvenza (circa 100-150 l) e coprire con vetro di copertura premium. Sigillare con smalto.
  12. Scattare immagini con un microscopio a fluorescenza regolare o confocale.

5. Isolamento del DNA genomico

  1. Eutanasia un topo adulto C57 BL/6J (maschio o femmina) per lussazione cervicale e rimuovere il cervello.
  2. Dissezitano i tessuti dell'ippocampo, della corteccia e del cervelletto su un piatto ghiacciato. Macinare i tessuti con un grinder tissutale in 1 mL di tampone di lisi di DNA e trasferirli nel tubo di microcentrifuga pulito. Aggiungete 250 g di proteinease K per 600 luna di tampone di lisi. Per i pellet cellulari, aggiungere direttamente il tampone di lisi, la proteinasi K e mescolare accuratamente.
    NOT: Preparare il buffer di lisi del DNA: 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl in 100 mM Tris-HCl, pH 8.5. Lavare e autoclare la smerigliatrice dei tessuti prima dell'esperimento.
  3. Il secondo giorno, aggiungere circa 50 g di RNase A per campione per almeno 12 h a 37 gradi centigradi.
  4. Aggiungere un volume uguale di fenolo:cloroformio:alcool isoamyl (25:24:1) e mescolare completamente.
  5. Centrifuga a 20.817 x g per 15 min, e rimuovere il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga.
  6. Aggiungere 600 litri di cloroformio al supernatante per far precipitare il DNA e mescolare accuratamente.
  7. Centrifuga a 20.817 x g per 15 min, e rimuovere il supernatante in un altro nuovo tubo.
  8. Aggiungere 500 l di isopropanolo al supernatante e mescolare accuratamente.
  9. Centrifuga a 20.817 x g per 15 min, e rimuovere completamente il supernatante.
  10. Lavare la precipitazione con 1 mL di 70% etanolo, centrifugare a 20,817 x g per 1 min, e rimuovere completamente il supernatante. Ripetere una volta.
  11. Asciugare completamente il pellet di DNA.
  12. Sciogliere il pellet di DNA con il buffer Tris-HCl (pH 8,5) alla concentrazione corretta.

6. DNA Dot Blot

  1. Preparare le soluzioni: 2 M NaOH, tampone Tris-HCl (pH 8.5), 6x citrato di sodio saline (SSC).
  2. Fare la miscela campione come Tabella 1.
  3. Denaturare i campioni di DNA a 100 gradi centigradi per 10 min e raffreddare sul ghiaccio.
  4. Tagliare la giusta dimensione della membrana di nylon (ad es., Hybond-N) e risciacquare con 6x SSC.
  5. Mettere la membrana sull'apparato punto-macchia e collegare alla pompa a vuoto. Spot 6 - L di miscela per punto sulla membrana.
  6. Ibridare per 30 min a 80 gradi centigradi e bloccare la membrana del campione con latte senza grassi in salina tamponata tris (TBS) per 1 h.
  7. Incubare con anticorpo primario a 4 gradi centigradi durante la notte.
    NOTA: il seguente anticorpo primario: coniglio policlonale anti-5-idrossimetilcitosina (1:5.000).
  8. Il secondo giorno, incubare le membrane del campione a temperatura ambiente per 1 h. Lavare con TBS per 10 min.
  9. Incubare la membrana con anticorpo secondario anti-coniglio (1:5,000) per 30 min a temperatura ambiente.
  10. Lavare con TBS per 10 min. Ripetere questo lavaggio altre due volte.
  11. Visualizzare i segnali di chemiluminescenza e quantificare l'intensità del segnale.

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Risultati

Per rivelare la distribuzione di 5-hmC nell'ippocampo di topi adulti, abbiamo eseguito l'immunofluorescenza con anticorpi contro le cellule neuronali (NeuN) e 5-hmC. Nell'ippocampo, 5-hmC co-localizzato bene con marcatore cellulare neuronale NeuN (Figura 1A-H), suggerendo un arricchimento di 5-hmC nei neuroni.

Per determinare la dinamica di 5-hmC durante lo sviluppo neuronale, è stato eseguito un punto-blot con campioni di DNA isolati da cellule s...

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Discussione

Le modifiche epigenetiche svolgono un ruolo essenziale durante lo sviluppo cerebrale, la maturazione e la funzione. Come marcatore stabile per la modifica del DNA, dinamico 5-hmC risponde all'adattamento comportamentale, all'attività neuronale, ed è positivamente correlato con l'espressione genica; così, è coinvolto nella normale funzione del cervello e disturbo neurologico4. Per esplorare la sua funzione nelle cellule e nei tessuti, è necessario rilevare l'esistenza di 5-hmC e confrontare il live...

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Dichiarazioni

Non esistono interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

XL è stata sostenuta in parte dal National Key R&D Program of China (2017YFE0196600) e dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31771395, 31571518). Q.S. è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2017YFC1001703) e dal Key Research and Development Program della provincia di ehejiang (2017C03009). W.X. è stato sostenuto dalla Fondazione di Scienze Naturali della provincia di ejiang (LY18H020002) e dal Dipartimento di Tecnologia Della Scienza della provincia di Ehejiang (2017C37057).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4'-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)Sigma-AldrichD8417
Adobe Photoshop softwareAdobe Inc./
Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgGThermo FisherA11008
Alexa Fluor 568 capra anti-topo IgGThermo FisherA11001
anti-5-idrossimetilcitosinaActive Motif39769
anti-NeuNMilliporeMAB377
B27 integratoreGibco12587-010
Integratore di B27Gibco12580-010
Integratore di B27Gibco17504-044
Microtomo criostatoLeicaCM1950
DMEM/F-12 medioOmegaScientificDM25
Fattore di crescita epidermicoPeproTech100-15
Fattore di crescita dei fibroblasti-basicPeproTech100-18B
ForskolinSigma-AldrichF6886
GlutaMaxThermo35050061
L-GlutamminaGibco25030-149
Mezzo neurobasaleGibco21103-049
Siero di capra normaleVector LaboratoriesZ0325
Membrana in nylon (Hybond™-N+ )Amersham Biosciences
OCTLeica14020108926
Pen StrepGibco15140-122
Fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24:1 )Sigma-Aldrich516726
Poli-D-lisinaSigmaP0899-10
Proteinasi KVVR39450-01-6
AcidoretinoicoSigma-AldrichR2625
Triton X-100SolarbioT8210
RPN303B

Riferimenti

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