Qui, presentiamo un protocollo per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule e tessuti cerebrali, utilizzando immunofluorescenza colorazione e metodi di DNA dot-blot.
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Articolo metodologico
Il rilevamento di 5-Hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sono state identificate diverse modifiche del DNA nel genoma dei mammiferi. Di questi, sono stati studiati intensamente i meccanismi epigenetici mediati da 5-metilcytosina e 5-idrossimethylcytosine. 5-idrossimetilcitosina mostra caratteristiche dinamiche durante lo sviluppo embrionale e postnatale del cervello, svolge una funzione regolatrice nell'espressione genica, ed è coinvolto in più disturbi neurologici. Qui, descriviamo i metodi dettagliati tra cui l'immunofluorescenza colorazione e DNA dot-blot per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule coltivate e tessuti cerebrali del topo.
Introduzione
Le modifiche epigenetiche, tra cui la modificazione del DNA, la modificazione dell'istone e la modificazione dell'RNA, hanno dimostrato di svolgere funzioni essenziali in diversi processi biologici e malattie1,2,3, 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7. Per lungo tempo, la metilazione del DNA (cioè la metilcitosina 5 mC) è stata vista come un marcatore epigenetico altamente stabile e non può essere ulteriormente modificata nel....
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Hejiang.
1. La coltura delle cellule staminali neurali adulte e dei neuroni
- Isolare le cellule staminali neurali adulte dal prosencefalo di un adulto (8-10 settimane) mouse maschio C57/BL6 come descritto in precedenza31,32.
- Coltura cellule staminali neurali adulte in DMEM/F-12 medio contenente 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% supplemento B27, 1% antibiotico-antimiocolotico, e 2 mM L-Glutamine in un 5% DI CO2 incubatore a 37 . Indurre la differenziazione ....
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Risultati
Per rivelare la distribuzione di 5-hmC nell'ippocampo di topi adulti, abbiamo eseguito l'immunofluorescenza con anticorpi contro le cellule neuronali (NeuN) e 5-hmC. Nell'ippocampo, 5-hmC co-localizzato bene con marcatore cellulare neuronale NeuN (Figura 1A-H), suggerendo un arricchimento di 5-hmC nei neuroni.
Per determinare la dinamica di 5-hmC durante lo sviluppo neuronale, è stato eseguito un punto-blot con campioni di DNA isolati da cellule s.......
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Discussione
Le modifiche epigenetiche svolgono un ruolo essenziale durante lo sviluppo cerebrale, la maturazione e la funzione. Come marcatore stabile per la modifica del DNA, dinamico 5-hmC risponde all'adattamento comportamentale, all'attività neuronale, ed è positivamente correlato con l'espressione genica; così, è coinvolto nella normale funzione del cervello e disturbo neurologico4. Per esplorare la sua funzione nelle cellule e nei tessuti, è necessario rilevare l'esistenza di 5-hmC e confrontare il live.......
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Dichiarazioni
Non esistono interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
XL è stata sostenuta in parte dal National Key R&D Program of China (2017YFE0196600) e dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31771395, 31571518). Q.S. è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2017YFC1001703) e dal Key Research and Development Program della provincia di ehejiang (2017C03009). W.X. è stato sostenuto dalla Fondazione di Scienze Naturali della provincia di ejiang (LY18H020002) e dal Dipartimento di Tecnologia Della Scienza della provincia di Ehejiang (2017C37057).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4'-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / | |
| Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 568 capra anti-topo IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
| anti-5-idrossimetilcitosina | Active Motif | 39769 | |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| B27 integratore | Gibco | 12587-010 | |
| Integratore di B27 | Gibco | 12580-010 | |
| Integratore di B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Microtomo criostato | Leica | CM1950 | |
| DMEM/F-12 medio | OmegaScientific | DM25 | |
| Fattore di crescita epidermico | PeproTech | 100-15 | |
| Fattore di crescita dei fibroblasti-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 | |
| L-Glutammina | Gibco | 25030-149 | |
| Mezzo neurobasale | Gibco | 21103-049 | |
| Siero di capra normale | Vector Laboratories | Z0325 | |
| Membrana in nylon (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | ||
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 | |
| Poli-D-lisina | Sigma | P0899-10 | |
| Proteinasi K | VVR | 39450-01-6 | |
| Acido | retinoicoSigma-Aldrich | R2625 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
Riferimenti
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
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Ristampe e permessi
