Questo protocollo descrive diverse procedure per la preparazione di campioni di tessuto congelato di alta qualità al momento della necroscopia per l'uso nel saggio della cometa per valutare il danno al DNA: 1) tessuto macinato, 2) cellule epiteliali raschiate dal tratto gastrointestinale e 3) tessuto immatolato campioni, richiedendo l'omogeneizzazione utilizzando un dispositivo di mincing dei tessuti.
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Articolo metodologico
Uso di tessuto congelato nel saggio Cometa per la valutazione del danno del DNA
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'analisi della cometa sta guadagnando popolarità come mezzo per valutare il danno del DNA nelle cellule e nei tessuti coltivati, in particolare dopo l'esposizione a sostanze chimiche o altri fattori di stress ambientali. L'uso del saggio della cometa nei test normativi per il potenziale genotossico nei roditori è stato guidato dall'adozione di una linea guida di prova dell'Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) nel 2014. Cometa sdolcino i vetrini sono tipicamente preparati da tessuto fresco al momento della necropsia; tuttavia, il congelamento dei campioni di tessuto può evitare le sfide logistiche associate alla preparazione simultanea di vetrini da più organi per animale e da molti animali per studio. Il congelamento consente inoltre la spedizione di campioni dall'impianto di esposizione a un altro laboratorio per l'analisi, e lo stoccaggio di tessuto congelato facilita il rinvio della decisione di generare dati sui danni al DNA per un determinato organo. Il saggio di cometa alcalina è utile per rilevare le rotture del DNA a doppio e singolo filamento correlate all'esposizione, le lesioni alcali-labile e le rotture del filamento associate alla riparazione incompleta dell'escissione del DNA. Tuttavia, il danno al DNA può anche derivare da una tosatura meccanica o da procedure di elaborazione del campione improprie, confondendo i risultati del test. La riproducibilità nella raccolta e nella lavorazione di campioni di tessuto durante le necroscopia può essere difficile da controllare a causa della fluttuazione del personale di laboratorio con diversi livelli di esperienza nella raccolta dei tessuti per il saggio della cometa. Migliorare la coerenza attraverso la formazione di aggiornamento o l'impiego di unità mobili con personale di laboratorio esperto è costoso e potrebbe non essere sempre fattibile. Per ottimizzare la generazione coerente di campioni di alta qualità per l'analisi del saggio della cometa, è stato valutato un metodo per omogeneizzare i cubi congelati flash di tessuto utilizzando un dispositivo di mincing dei tessuti personalizzato. I campioni preparati per il test della cometa con questo metodo sono stati confrontati favorevolmente in termini di qualità a campioni di tessuto fresco e congelato preparati dalla maciazione durante la necropsia. Inoltre, il basso danno del DNA di base è stato misurato in cellule da cubetti congelati di tessuto dopo un accumulo prolungato.
Introduzione
Il test della cometa è sempre più usato come mezzo per valutare il danno del DNA nelle cellule coltivate e nei tessuti esposti a sostanze chimiche o altri fattori di stress ambientali1. L'analisi è in grado di rilevare rotture a doppio e singolo filamento del DNA, lesioni alcali-labili e rotture a singolo filamento associate alla riparazione incompleta del DNA. L'International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guideline for Pharmaceutical testing raccomanda una rottura del filamento di DNA, come il saggio della cometa come secondo test per integrare il micronucleo eritrocite del roditore....
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Protocollo
I tessuti sono stati raccolti durante lo svolgimento di studi effettuati presso impianti accreditati Da AALAC presso i laboratori contrattuali NTP in conformità con le norme sulla buona pratica di laboratorio (21 CFR Part 58) e i protocolli di utilizzo degli animali approvati dall'Institutional Animal Comitato per la cura e l'uso (IACUC) in ogni laboratorio.
1. Raccolta e lavorazione dei tessuti
NOT: È utile preparare tubi campione duplicati (ad esempio, fegato) o trasferire circa la metà di un campione in un altro tubo di stoccaggio (ad esempio, duodenum, stomaco) per consentire la rianalisi, se ne....
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Risultati
Studio 1
Il fegato è stato raccolto da due coorti di ratti Maschi Sprague Dawley somministrato olio di mais per 4 giorni, sfalsati da una settimana. I vetrini sono stati preparati da tessuto appena macinato, tessuto macinato congelato e tessuto a cubetti congelato lavorato nella soluzione media o di maciazione del tessuto utilizzando il dispositivo di maci; I tessuti congelati ottenuti da animali della prima coorte sono stati valutati dopo lo stoccaggio del congelatore per 3,5 mesi. I tessuti congelat.......
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Discussione
Come dimostrato in precedenza7,12,13, correttamente gestito flash tessuto macinato congelato fornisce buoni risultati nel test cometa. Infatti, i valori del DNA della coda % di base per il ratto macinato congelato e il fegato di topo preparati nel nostro laboratorio sono in genere ,6%, come raccomandato dalla guida del test dell'OCSE9 per campioni di fegato di ratto appena macinato. Buoni risultati sono s.......
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Dichiarazioni
Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca Intramurale del NIH, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) sotto contratto HHSN273201300009C; tuttavia, le dichiarazioni, le opinioni o le conclusioni in esso contenute non rappresentano necessariamente le dichiarazioni, le opinioni o le conclusioni del NIEHS, della NIH o del governo degli Stati Uniti.
Ringraziamenti
Gli autori sono in debito con Lincoln Martin e Kelley Owens per l'assistenza tecnica esperta nella preparazione e nel punteggio delle diapositive della cometa e della dott.ssa Carol Swartz per l'esecuzione di analisi statistiche. Gli autori riconoscono anche i contributi di supporto dei membri dei programmi di tossicologia genetica, tossicologia investigativa e necropsia presso ILS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Fogli di cera dentale | Microscopia elettronica Scienze | 72670 | |
| Dissezione (tritatura) Micro forbici | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hank | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Provette per microfugiosi a basso punto di fusione | Lonza | 50081 | |
| 1,7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2 HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Formalina tamponata neutra | Leica | 600 | |
| Lame per bisturi | Miltex | 4-110 | |
| Stantuffo per siringa (1 mL) | Fisher Scientific o Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Siringa per tubercolina Becton Dickinson o Monoject |
| Dispositivo di tritatura dei tessuti | NorGenoTech (Oslo, Norvegia) | Nessuno | Piccola variabilità di diametro osservata che può influire sulla tenuta dello stantuffo. |
| Pinzette, plastica | Alisei Diretto | DF8088N | Nylon rinforzato, non sterile, punta smussata, autoclavabile; tradewindsdirect.com |
| Pesa Barche | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
Riferimenti
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH.
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Ristampe e permessi
