Articolo metodologico

Identificare le mutazioni con lo scioglimento ad alta risoluzione in una popolazione di riso TILLING

DOI:

10.3791/59960

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2 settembre 2019

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1National Key Laboratory of Rice Biology, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Resources, Institute of Crop Science, Zhejiang University, 2Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, 4The New Countryside Development Institute at Zhejiang University

In questo articolo

Sommario

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In questo articolo, presentiamo il protocollo descritto come ad alta risoluzione di fusione di analisi di fusione (HRM)-based Target Induced Local Lesions In ducedato In genomes (TILLING). Questo metodo utilizza cambiamenti di fluorescenza durante la fusione del DNA duplex ed è adatto per lo screening ad alto throughput di inserimento/eliminazione (Indel) e singola sostituzione di base (SBS).

Abstract

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Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) è una strategia di genetica inversa per lo screening ad alto throughput delle mutazioni indotte. Tuttavia, il sistema TILLING ha meno applicabilità per il rilevamento di inserimento/eliminazione (Indel) e TILLING tradizionale richiede passaggi più complessi, come la digestione di nucleale CEL I e l'elettroforesi gel. Per migliorare la produttività e l'efficienza di selezione, e per rendere possibile lo screening di entrambi gli Indels e le singole sottostizioni di base (SBS), viene sviluppato un nuovo sistema DI fusione ad alta risoluzione (HRM) basato su . Qui, presentiamo un protocollo DETTAGLIATO HRM-TILLING e mostriamo la sua applicazione nello screening delle mutazioni. Questo metodo è in grado di analizzare le mutazioni degli amplificatori PCR misurando la denaturazione del DNA a doppio filamento ad alte temperature. L'analisi HRM viene eseguita direttamente dopo la PCR senza ulteriori elaborazioni. Inoltre, un metodo di estrazione del DNA semplice, sicuro e veloce (SSF) è integrato con HRM-TILLING per identificare sia Indels che SBS. La sua semplicità, robustezza e produttività elevata lo rendono potenzialmente utile per la scansione delle mutazioni nel riso e in altre colture.

Introduzione

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I mutanti sono importanti risorse genetiche per la ricerca di genomica funzionale delle piante e l'allevamento di nuove varietà. Un approccio genetico in avanti (cioè dalla selezione mutante alla clonazione genica o allo sviluppo di varietà) era il metodo principale e unico per l'uso di mutazioni indotte circa 20 anni fa. Lo sviluppo di un nuovo metodo di genetica inversa, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) di McCallum et al.1 ha aperto un nuovo paradigma e da allora è stato applicato in un gran numero di specie animali e vegetali2. TILLING è particolarmente utile per l'allevamento di tratti tecnicament....

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Protocollo

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1. Preparativi

  1. Sviluppo delle popolazioni mutagenizzate a raggi di raggi
    1. Trattare circa 20.000 semi di riso essiccati (con contenuto di umidità di ca. 14%) di una linea di riso japonica (ad esempio, DS552) con 137raggi gamma Cs a 100 Gy (1 Gy/min) in un impianto di irradiazione z (ad esempio, cellula gamma).
      NOTA: I semi utilizzati per il trattamento devono avere un'elevata redditività (ad esempio, con un tasso di germinazione >85%). La dose di irradiazione per il riso indica potrebbe essere aumentata a 150 Gy.
    2. Semina i semi irradiati dopo la germinazione su un letto di piantina e trapiant....

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Risultati

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Scansione e analisi HRM

In totale, sono stati prodotti e sottoposti ad amplificazione PCR 1.140 campioni di DNA in pool da 4.560 M2. Due frammenti delle dimensioni di 195 bp e 259 bp sono stati amplificati rispettivamente per OsLCT1 e SPDT(tabella2). La maggior parte dei campioni presentava curve di fusione non significativamente diverse da quella del WT (WT & lt; 0,05). Le curve HRM significativamente diverse dal WT (F > 0,.......

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Discussione

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TILLING si è dimostrato un potente strumento genetico inverso per identificare le mutazioni indotte per l'analisi funzionale genica e l'allevamento delle colture. Per alcuni tratti non facilmente osservabili o determinati, TILLING con rilevamento di mutazioni ad alto contenuto di velocità PCR può essere un metodo utile per ottenere mutanti per diversi geni. Il metodo HRM-TILLING è stato utilizzato nelle popolazioni mutagenizzate Di pomodoro12,grano11 e vine

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (n. 2016YFD0102103) e dalla National Natural Science Foundation of China (N. 31701394).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2&volte; Taq plus PCR Master MixTiangen, CinaKT201PCR tampone, dNTP e polimerasi per amplificazione PCR
Piastra a 96 pozzettiBio-rad, AmericaMSP-9651Piastra specifica per PCR nell'analisi HRM
Mastercycler nexusEppendorf, tedesco6333000073Amplificazione PCR
LightScannerIdaho Technology, USALCSN-ASY-0011Per il campionamento a fluorescenza e elaborazione
CALL-IT 2.0Idaho Technology, USAPer l'analisi della variazione di fluorescenza
EvaGreenBiotium, USA31000-TColorante a fluorescenza di HRM
Nanodrop 2000Thermo Scientific, USAND2000Per la quantificazione del DNA

Riferimenti

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  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P.

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Screening delle mutazioniEstrazione del DNAOttimizzazione della PCRAnalisi HRMElettroforesi su gelSequenziamento di SangerColtivazioni di risoRilevamento di indel

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