Presentato qui è un protocollo ottimizzato per isolare, coltivare, tradurre e differenziare i monociti primari umani da individui infettati dall'HIV e dai controlli sani.
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Articolo metodologico
Isolamento, trasfezione e cultura dei monociti umani primari
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) rimane una delle principali preoccupazioni per la salute, nonostante l'introduzione della terapia antiretrovirale combinata (cART) a metà degli anni '90. Mentre la terapia antiretrovirale abbassa in modo efficiente il carico virale sistemico e ripristina il normale CD4- conteggi di cellule T, non ricostituisce un sistema immunitario completamente funzionale. Un sistema immunitario disfunzionale in individui infettati da HIV sottoposti a cART può essere caratterizzato da attivazione immunitaria, invecchiamento precoce delle cellule immunitarie o infiammazione persistente. Queste condizioni, insieme ai fattori comorbidi associati all'infezione da HIV, aggiungono complessità alla malattia, che non può essere facilmente riprodotta nei modelli cellulari e animali. Per studiare gli eventi molecolari alla base della disfunzione immunitaria in questi pazienti, viene presentato un sistema per la coltura e la manipolazione dei monociti primari umani in vitro. In particolare, il protocollo consente la coltura e la trasfezione del CD14 primario- monociti ottenuti da individui affetti da HIV sottoposti a cART e da controlli HIV-negativi. Il metodo prevede l'isolamento, la cultura e la trasfezione di monociti e macrofagi derivati da monociti. Mentre sono impiegati kit e reagenti disponibili in commercio, il protocollo fornisce importanti suggerimenti e condizioni ottimizzate per il successo dell'aderenza e della trasfezione dei monociti con mimimi e inibitori di miRNA, nonché con i siRNA.
Introduzione
L'infezione da virus immunodeficienza umana-1 (HIV-1) causa una grave disfunzione immunitaria, che può portare a infezioni opportunistiche e sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS). Anche se i pazienti affetti da HIV sottoposti a cART sono caratterizzati da bassi carichi virali e normali conteggi di cellule CD4- T, il funzionamento del sistema immunitario può essere compromesso in questi individui, portando ad una risposta immunitaria disfunzionale che è stata collegata ad un aumento del rischio di sviluppare il cancro1. I meccanismi della disfunzione immunitaria nei pazienti affetti da HIV su cART rimangono in gran parte scono....
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Protocollo
Tutti i metodi descritti di seguito sono stati approvati dal Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board. Tutto il sangue è stato raccolto dopo aver ottenuto il consenso informato.
NOTA: L'intera procedura viene eseguita in condizioni sterili in un impianto di biosicurezza di livello 2 (BSL2) in modo che venga utilizzata cautela per la gestione di materiali biologici. In particolare, ogni passo viene eseguita utilizzando tecniche sterili sotto un armadietto di biosicurezza. Dopo ogni fase che coinvolge sangue, prodotti sanguigni, cellule o pipettaggio di prodotti cellulari, è importante sciacquar....
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Risultati
Utilizzando la procedura descritta, sono stati isolati i monociti umani primari di individui affetti da HIV e donatori sani. Tutti i dati qui presentati sono stati ottenuti daHIV: soggetti sottoposti a cART con basso (<20 copie/mL) o carichi virali non rilevabili e normali conteggi di cellule CD4e T. Subito dopo l'isolamento, le cellule sono state macchiate, e la citometria di flusso è stata eseguita per confermare la purezza delle popolazioni di cellule. I risult.......
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Discussione
Il protocollo presentato dimostra l'uso di cellule primarie di soggetti infettati da HIV come modello per studiare monociti e macrofagi. HIV- I pazienti sottoposti a cART vivono con infezione per più anni e possono anche avere altre co-infezioni correlate a un sistema immunitario compromesso. Per studiare l'immunomodulazione in presenza di infezione cronica da HIV, le cellule sono state raccolte direttamente dai pazienti. Poiché i miRNA hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nello sviluppo cellulare .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il nucleo del biorepository clinico/tumorale dell'HIV per aver fornito campioni di pazienti e il nucleo del metabolismo dell'immunologia cellulare per la fornitura dell'analisi della citometria del flusso. Questo progetto è stato finanziato da NIH P20GM121288 e P30GM114732.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD con K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Citometria a flusso |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Citometria a flusso - anticorpo coniugato |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Citometria a flusso - anticorpo coniugato |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Citometria a flusso - anticorpo coniugato |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Citometria a flusso - anticorpo coniugato |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Citometria a flusso - anticorpo coniugato |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Kit di isolamento diretto dei monociti umani Easy Sep | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Anticorpo monoclonale per Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Siero fetale Bovin Definito calore inattivato | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Citometro a flusso di Gallios | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Anticorpo monoclonale per Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Tampone bloccante la citometria a flusso |
| Software di analisi Kaluza | Beckman Coulter | B16406 | Software per analizzare i dati della citometria a flusso |
| Lipopolisaccaridi da Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic has-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Controllo negativo | Sigma | HMC0002 | miRNA strapazzato coniugato con un colorante nel vicino infrarosso |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140122 | |
| umano ricombinante GM-CSF | R& D Systems | 215-GM-050 | |
| IFN umano ricombinante-γ | R& D Systems | 285-IF-100 | |
| IL-4 umano ricombinante | R& D Systems | 204-IL-010 | |
| M-CSF umano ricombinante | D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 con L-Glutammina | Corning | 10040CVMP | |
| Controllo criptato siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Kit di reagenti per trasfezione Viromer Blue | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Reagente per la proliferazione cellulare | Roche | 5015944001 | Test colorimetrico per valutare la vitalità cellulare |
Riferimenti
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638(2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug D....
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Ristampe e permessi
