Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

Sommario

Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

Abstract

Durotaxis è il processo attraverso il quale le cellule percepiscono e rispondono a gradienti di tensione. Per studiare questo processo in vitro, la rigidità del substrato sottostante una cellula deve essere manipolata. Mentre gli idrogel con rigidità graduata e saggi di migrazione a lungo termine si sono dimostrati utili negli studi di durotassi, le risposte immediate e acute ai cambiamenti locali nella tensione del substrato consentono uno studio mirato dei movimenti delle singole cellule e degli eventi di segnalazione subcellulare. Per testare ripetutamente la capacità delle cellule di rilevare e rispondere alla rigidità del substrato sottostante, viene utilizzato un metodo modificato per l'applicazione di gradienti acuti di maggiore tensione alle singole cellule coltivate su idrogel deformabili che consente in tempo reale manipolazione della forza e della direzione dei gradienti di rigidità impartiti sulle cellule in questione. Inoltre, ottimizzando i dettagli e i parametri dell'analisi, come la forma e le dimensioni della micropipetta o la posizione relativa, il posizionamento e la direzione del gradiente applicato, il saggio può essere ottimizzato per lo studio di qualsiasi tipo di cella e sistema sensibili. Questi parametri possono essere modificati per modificare in modo affidabile lo stimolo applicato ed espandere la funzionalità e la versatilità del saggio. Questo metodo consente l'esame sia del movimento durotattico a lungo termine che dei cambiamenti più immediati nella segnalazione cellulare e nella dinamica morfologica in risposta al cambiamento di rigidità.

Introduzione

Negli ultimi decenni, l'importanza delle proprietà meccaniche dell'ambiente di una cellula ha ottenuto un crescente riconoscimento nella biologia cellulare. Tessuti diversi e matrici extracellulari hanno diverse rigidità relative e, quando le cellule migrano in tutto il corpo, navigano questi cambiamenti, utilizzando queste proprietà meccaniche per guidarli^{1,2,3 , 4 DEL psu' , 5} Del numero 3( ^{, 6} È possibile: ^{, 7.}Le cellule usano la rigidità di un dato tessuto per informare il loro comportamento motile durante processi come lo sviluppo, la guarigione delle ferite e la metastasi del cancro. Tuttavia, i meccanismi molecolari che permettono la sensazione e la risposta a questi input meccanici rimangono in gran parte sconosciuti^{1,2,3,4,5, 6} È possibile: ^{, 7}.

Per studiare i meccanismi attraverso i quali le cellule rispondono ai segnali ambientali fisici, la rigidità o rigidità delle cellule aderenti sottostanti deve essere manipolata. Nel 2000, Chun-Min Lo, Yu-Li Wang e colleghi hanno sviluppato un saggio⁸ in base alla quale la risposta motilica di una singola cellula ai cambiamenti di segnali meccanici potrebbe essere testata direttamente allungando la poliacrilammide rivestita egicolofosa ECM idrogel su cui sono state placcate le cellule. Le cellule mostrano una preferenza significativa per migrare verso substrati più rigidi, un fenomeno che hanno soprannominato "durotaxis".

Dalla relazione originale del 2000, molte altre tecniche sono state impiegate per lo studio del durotassi. I gradienti di rigidità ripida sono stati fabbricati mediante la colata di gel su caratteristiche rigide come perline in polistirolo⁹ o pali polimerici rigidi¹⁰ o polimerizzando il substrato intorno ai bordi di un vetro coverlips¹¹ per creare meccanica ' passo-confini'. In alternativa, gli idrogel con gradienti di rigidità più bassi ma fissi sono stati fabbricati con una varietà di metodi come gradienti di crosslinker creati da dispositivi microfluidici^12,13 o goccioline di soluzione idrogel side-by-side di diversa rigidità⁸, o idrogel con crosslinker fotoreattivo trattati con esposizione alla luce UV graduata per creare un gradiente di rigidità lineare^14,15. Queste tecniche sono state utilizzate con grande effetto per indagare il movimento cellulare durotattico in massa nel tempo. Tuttavia, in genere queste caratteristiche sono fabbricate in anticipo rispetto alla placcatura cellulare e le loro proprietà rimangono coerenti nel corso dell'esperimento, basandosi sul movimento casuale delle cellule per il campionamento di gradienti meccanici. Nessuna di queste tecniche è suscettibile di osservazione di rapidi cambiamenti nel comportamento cellulare in risposta a stimoli meccanici acuti.

Per osservare le risposte cellulari ai cambiamenti acuti nell'ambiente meccanico, i saggi durotaxis a singola cella offrono diversi vantaggi. In questi saggi, alle singole cellule viene dato uno stimolo acuto e meccanico allontanando il substrato sottostante dalla cellula con una micropipetta di vetro, introducendo così un gradiente direzionale di tensione cell-matrice. I cambiamenti nel comportamento motile, come la velocità o la direzione della migrazione, sono poi osservati dalla microscopia a contrasto di fase delle cellule vive. Questo approccio facilita l'osservazione diretta delle relazioni di causa ed effetto tra gli stimoli meccanici e la migrazione cellulare, in quanto consente una rapida e iterativa manipolazione della direzione e della grandezza del gradiente di tensione e la valutazione della conseguente risposte cellulari in tempo reale. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato anche per stimolare meccanicamente le cellule che esprimono proteine di fusione fluorescente o biosensori per visualizzare i cambiamenti nella quantità, nell'attività o nella localizzazione subcellulare delle proteine che si sospetta siano coinvolte nella meccanosensing e durotaxis.

Questa tecnica è stata utilizzata da gruppi che studiano durotaxis^8,16 ed è descritta qui come è stata adattata dal Laboratorio Howe per studiare il comportamento durotattico delle cellule tumorali ovariche SKOV-3 e i meccanismi molecolari che sotto durotaxis¹⁷. Inoltre, viene descritto un metodo modificato per la fabbricazione di idrogel con un singolo strato uniforme di microsfere fluorescenti vicino alla superficie di coltura cellulare; ciò facilita la visualizzazione e l'ottimizzazione dei gradienti di deformazione generati da micropipette e può consentire la valutazione della contrattilità cellulare mediante microscopia della forza di trazione.

Protocollo

1. Fabbricazione di idrogel di polimembrano deformabile con microsfere fluorescenti incorporate

NOT: Le direzioni descrivono la polimerizzazione di un idrogel di 25 kPa di 22 m di diametro e spesso circa 66 m. Ognuno o tutti questi parametri possono essere modificati e le direzioni per farlo possono essere trovate nella tabella 1 e nelle note¹⁷.

1. Attivazione di piatti o coverlips con fondo in vetro
   1. Preparare la soluzione di lavoro a levida per l'attivazione di un piatto di imaging con fondo di vetro o di un coverslip che si inserisca in una camera di imaging a celle vive. Mescolare 950 -L di 95% di etanolo, 50 l di acido acetico glaciale e 5 -L di lega silano (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane).
      NOT: L'utilizzo di una coverslip inferiore più grande rispetto alla coverslip superiore darà spazio aggiuntivo per lavorare durante la preparazione del gel e faciliterà il posizionamento della micropipetta di vetro nelle fasi successive. Inoltre, se si utilizza un coverslip anziché un piatto di imaging con fondo di vetro, pulire la coverslip come descritto nella sezione seguente.
   2. Attivare la superficie del vetro per 20 s con una bacchetta corona e sovrapporre immediatamente 50 gradi della soluzione di lavoro a lestraglio. Lasciare asciugare la soluzione per 10 min.
   3. Risciacquare due volte con il 95% di etanolo, poi due volte con isopropanolo e poi lasciare che le coverlips ariedano per circa 20 min.
      NOTA: Il vetro attivato può essere conservato per un massimo di una settimana in un desiccatore.
2. Pulizia superiore coprelips
   1. Pulire i coperchi superiori da 22 mm incubando in 2% HCl a 70 s per 30 min, quindi lavare in ddH₂O per 10 min due volte.
   2. Incubare i copricapi in una soluzione di 2% pulizia cuvette concentrarsi in ddH₂O a 50 s per 30 min, quindi lavare in ddH₂O per 10 min due volte.
   3. Incubare le coverine in ddH₂O a 90 gradi centigradi per 30 min, poi nel 70% di etanolo a 70 gradi centigradi per 10 min, quindi asciugare all'aria a 60 gradi centigradi per un minimo di 2 h.
      NOT: I coperchi puliti possono essere conservati a tempo indeterminato in un desiccatore pulito.
3. Microsfera fluorescente/deposizione di perline sui coperchi dei coperchi superiori
   1. Sonicare la soluzione stock di microsfere fluorescenti per 1 h in un bagno d'acqua ultrasonico. Fare una soluzione di perline di lavoro diluindo perline stock 1:200 in 100% etanolo e sonicare di nuovo per 1 h.
   2. 15 min prima che la soluzione di perline ha finito di onorare, pulire accuratamente i copricopertine mettendoli verticalmente in un portacoprile in ceramica e trattando con plasma camera-aria per 3 min in un plasma pulito tavolo.
   3. Per facilitare la movimentazione e prevenire lo scorrimento del coperchio durante i passaggi successivi, posizionare un pezzo di parafilm in un coperchio della piastra Petri da 60 mm o in un contenitore simile. Posizionare il coperchio nello stabilizzatore e toccare leggermente, garantendo un buon contatto tra il parafilm e il coperchio.
   4. Per un coperchio da 22 mm, aggiungere 150 l della soluzione di perline di lavoro sulla parte superiore del coperchio. Immediatamente aspirare la soluzione di etanolo fuori dal lato della vela, lasciando le perline sul coperchio. Lasciare asciugare il coperchio.
      NOTA: La quantità di perline di lavoro aggiunta deve essere di 4 x L/cm² e può essere ridimensionata per adattarsi a qualsiasi dimensione coverslip.
4. Getto idrogel con perline fluorescenti incorporate
   1. Preparare la soluzione idrogel di acrilammide e bis-acrilammide. Mescolare la soluzione secondo la tabella 1, quindi aggiungere 2,5 luna di 10% APS e 0,5 L di TEMED. Mescolare bene. Passare immediatamente al passaggio successivo.
      NOTA: La miscela di soluzione idrogel può essere modificata per variare il modulo del Young, o rigidità, dell'idrogel cambiando il rapporto tra acrilammide e bis-acrilammide come mostrato nella Tabella 1. Questi valori sono stati verificati per l'uso nel laboratorio Howe utilizzando la microscopia a forza atomica, ma dovrebbero essere confermati all'interno della propria istituzione.
   2. Subito dopo aver fatto la soluzione idrogel, aggiungere una goccia di 25 l sul lato attivato del piatto in vetro o coverslip inferiore, quindi posizionare immediatamente il coperchio rivestito di perline sulla soluzione, lato di perline verso il basso. Contattare la goccia con il lato più lontano del coperchio seguito da abbassamento lento aiuta a evitare di intrappolare bolle d'aria all'interno dell'idrogel.
      NOTA: L'altezza dell'idrogel deve essere ben entro la distanza di lavoro della lente obiettivo da utilizzare nell'esperimento successivo. Un'altezza di idrogel di 66 m funziona bene per la maggior parte dei sistemi. La dimensione dell'idrogel può essere scalata aggiungendo più o meno soluzione idrogel a seconda delle dimensioni del coperchio. Per calcolare il volume appropriato della soluzione idrogel, utilizzare l'equazione per il volume di un cilindro, V s² hdove r è il raggio coverslip e h è l'altezza desiderata hydrogel. Tipicamente, questo calcolo prevede con precisione l'altezza effettiva dell'idrogel, come misurato preparando un gel con coprilabbra rivestiti di perline sia sulla parte superiore che inferiore e utilizzando un microscopio confocale per misurare la distanza tra i due piani di perline. Tuttavia, è stato osservato che l'altezza effettiva dell'idrogel può discostarsi da questo calcolo di 20 m (adesempio, a seconda dello spessore e del produttore della copertina superiore). Si raccomanda la misurazione diretta dell'altezza del gel utilizzando il metodo descritto sopra.
   3. Lasciare il gel a polimerizzare per 30 min, quindi rimuovere delicatamente lo scivolo superiore con pinze. L'aggiunta di 50 m HEPES pH 8,5 al piatto può facilitare la rimozione. Lavare per 5 min in 50 mM HEPES pH 8,5 tre volte.
5. Attivazione di idrogel e rivestimento a matrice extracellulare
   1. Attivare la superficie idrogel incubando in 0,4 m Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) esanotato) in 50 m HEPES pH 8.5. Esporre immediatamente a una lampada ad arco UV in un'area chiusa.
      NOTA: Proteggere Sulfo-SANPAH dalla luce prima dell'attivazione. Per una lampada da 400 W, posizionare il gel a 10 cm di distanza dalla lampadina all'interno della scatola luminosa e illuminare per 100 s. La soluzione Sulfo-SANPAH cambierà da arancione brillante a marrone scuro.
   2. Lavare per 5 min in 50 mM HEPES pH 8,5 tre volte.
      NOTA: I gel idratati possono essere conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana.
   3. Incubare l'idrogel attivato in fibronectina da 20 g/mL in 50 mM DI HEPES pH 8,5 per 1 h a 37 .
   4. Aspirare la soluzione fibronectina e lavare per 5 min in salina fosfata-buffered (PBS) tre volte. Sterilizzare l'idrogel e il coperchio del piatto per 15 min sotto la luce UV in una cappa di coltura tissutale con un basso volume di PBS. Lavare una volta in PBS sterile.
      NOTA: Altri tipi di proteine ECM possono essere utilizzati per rivestire l'idrogel tra cui collagene e lamininina.

2. Plating cellule

1. Aggiungete 3 mL di supporti contenenti 21.000 celle per riempire un piatto di 60 mm per una densità cellulare finale di 1000 celle/cm². Regolare la densità di semina in base alle esigenze per prevenire l'affollamento e consentire la libera circolazione delle singole cellule.
2. Lasciare che le cellule si riprendano a 37 gradi centigradi per almeno 4 h e fino a 18 h prima dell'imaging. Preparare l'imaging risciacquando con i supporti di imaging due volte prima di aggiungere i supporti di imaging. Lasciare che le cellule eclacino per almeno 30 min prima dell'imaging.
   NOTA: In anticipo, si passa nodi le condizioni dei supporti per determinare le condizioni che ottimizzeranno la migrazione nella riga cellulare utilizzata. Per le cellule SKOV-3, DMEM senza fenolo rosso, contenente 20 mHe HEPES e 12,5 ng/mL fattore di crescita epidermica stimola la maggior parte della migrazione. Le condizioni ottimali per le cellule Ref52 sono Ringer's Buffer con 10% siero bovino fetale (FBS) e 25 fattori di crescita derivati dalle piastrine ng/mL.

3. Preparazione della micropipetta di vetro: tiratura e forgiatura delle pipette

1. Tirare micropipette di vetro borosilicate lunghe 100 mm con un esterno di 1,0 mm e un diametro interno di 0,58 mm in un processo a due fasi per ottenere un cono superiore a 2 mm che si riduce a 50 m nel primo millimetro e si estende fino a un tubo lungo e parallelo di 10 m di diametro nell'ultimo millimetro.
2. Caricare il tubo tirato in una microforforgia. Formail tubo per avere una punta smussata di 15 m che è racchiusa alla fine di una sezione di 250 m piegata ad un angolo di 35 gradi rispetto al resto del tubo. Il diametro approssimativo alla curva dovrebbe essere di circa 30 m per dare forza alla punta.
   NOTA: Le dimensioni coniche e di punta possono essere regolate per applicare correttamente la forza desiderata (vedere il punto 5). Il tirare le micropipette a 65 gradi centigradi per il primo passo per 3 mm, e 60 gradi centigradi per il secondo passo produce le dimensioni descritte al punto 3.1. I risultati che utilizzano diversi tiratori pipet possono variare.
3. Sterilizzare la micropipetta nel 70% di etanolo prima dell'uso.

4. Posizionamento del micromanipolatore e della micropipetta

1. Rimuovere il coperchio del piatto e caricare il piatto sullo stadio del microscopio e al centro. Utilizzare un obiettivo di ingrandimento 10X o altrettanto basso. Coprire il supporto con olio minerale per evitare l'evaporazione dei supporti.
2. Inserimento del pipet tirato
   1. Inserire il tubo tirato nella fauna micropipetta, puntando il gancio verso il piatto. La punta del gancio sarà il punto più basso quando abbassato al gel.
   2. Inserire la guaina nel micromanipolatore e regolare fino a quando la punta del pipet non è centrata sulla lente obiettivo in entrambe le direzioni X e Y.
   3. Abbassare il pipet con manipolatore grossolano fino a toccare solo la superficie del liquido.
3. Utilizzando il contrasto di fase o il campo luminoso, concentrare il microscopio sullo strato di perline nella parte superiore del gel. Questo sarà il piano di riferimento.
4. Garantire che l'obiettivo non sia in pericolo di colpire il campione o lo stadio, portare la messa a fuoco sopra il gel per trovare la punta della micropipetta, utilizzando piccole regolazioni del manipolatore grossolano nelle direzioni X e Y per proiettare ombre sul piano focale. Abbassare la micropipetta solo quando è certo che la punta stessa del pipet è nel campo visivo.
5. Assicurarsi che la punta smussata della micropipetta sia rivolta verso il basso ruotando il tubo nella guaina o ruotando la guaina nel micromanipolatore fino a quando la punta non è perpendicolare al piano focale. Ripetere i passaggi 4.4 e 4.5 in base alle esigenze. Concentrarsi sulla punta del pipet.
6. Riportare verso il basso verso il basso per lo strato superiore del gel per misurare quanto il pipet è dalla superficie del gel. Riportare il fuoco su un piano che si trova a metà strada tra il gel e la punta del pipet. Abbassare lentamente il tubo per raggiungere il piano focale intermedio.
7. Ripetere il passaggio 4.6 fino a quando le ombre molto deboli dalla punta della micropipetta possono essere apprezzate quando si mette a fuoco sull'idrogel. Aumentare al successivo ingrandimento più alto.
8. Abbassare il micromanipolatore fino a quando le ombre e le rifrazioni della punta stessa della micropipetta possono essere apprezzate all'interno del piano focale strato di perline.
9. Aumentare l'ingrandimento a quello che verrà utilizzato nell'esperimento. Abbassare il tubo fino a quando non si libra appena sopra la superficie dell'idrogel.

5. Calibrare il micromanipolatore e la generazione di forza

1. In fase o in campo luminoso, abbassare la micropipetta in bilico per toccare la superficie dell'idrogel. Osservare come il pipet guarda al contatto con l'idrogel. Continuare a abbassare la micropipetta in , fino a quando le regolazioni in X e Y causano trazione e deflessione dell'idrogel in quelle direzioni. Utilizzare le microsfere o le cellule vicine come segni fiduciari.
   NOTA: Se il micromanipolatore è collegato al braccio del condensatore di fase o al banco e non allo stadio del campione stesso, disinserire sempre il gel prima di spostare lo stage per evitare di rompere il pipet o disturbare le cellule. Se il pipet si rompe, tornare al passaggio 3 e 4.
2. Trova un'area priva di cellule per coinvolgere il gel. Tirarlo in tutte le direzioni e mettersi a proprio agio con il modo in cui la micromanipolazione si traduce in deformazione del gel.
3. Prendere immagini fluorescenti del campo di perline senza manipolazione, con il pipet impegnando il gel, e con il pipet impegnato tirando il gel. Ripetere questo più volte prendendo buone note per quanto riguarda i segni di graduazione sul micromanipolatore, il modo in cui la punta pipet appare in fase o brightfield in ogni fase di tirare, e la distanza la punta si muove utilizzando tale manipolazione.
4. Utilizzare ImageJ come descritto in precedenza^16,17 per calcolare gli spostamenti relativi di perline e la forza applicata alle perline confrontando il campo di perline null con il campo di perline senza ingoiare pipet, il campo di perline con il gel impegnato, e il gel tirato.
5. Per regolare in modo lineare lo stimolo di tensione, confrontare l'applicazione della forza utilizzando diverse dimensioni della punta della micropipetta, delle distanze dalla cella o della distanza estratta dal micromanipolatore dal punto iniziale del touchdown. L'effetto della dimensione della punta micropipetta sull'applicazione della forza dà grande flessibilità all'utente, ma dimostra anche la necessità di generare mappe di forza per nuove micropipette, anche quando le dimensioni e la forma assomigliano molto a punte precedentemente calibrate.

6. Condurre il saggio durotassino

1. Prima di eseguire l'esperimento, esercitati a coinvolgere il gel vicino a una cellula e osserva la deformazione della cellula quando il micromanipolatore viene riposizionato.
2. Monitorare un gruppo di cellule che hanno una chiara polarità e sembrano muoversi per 30 minuti per identificare le cellule che si muovono in modo diretto.
3. Scegliere una cella che si muove in una singola direzione chiara e monitorarla alla frequenza fotogrammi desiderata per altri 30 min.
4. Se si desidera la determinazione delle forze esercitate sulla cellula o la tensione esercitata dalla cellula, catturare le immagini del campo di perline ad ogni acquisizione. Se la cellula cambia il suo corso di direzione durante il monitoraggio, scegliere una cella diversa da monitorare in quanto questo renderà difficile determinare l'effetto della stimolazione.
5. Impegnare l'idrogel a circa 50 m di distanza dalla cella. Posizionare il tubo davanti al lato vicino del bordo iniziale e spostare il micromanipolatore in modo che il gel sia deformato ortogonale mente alla direzione di viaggio della cella. Osservare la cellula nel tempo in quanto risponde al gradiente acuto e locale di rigidità.
   NOTA: La tempistica qui fornita è efficace quando si monitorano i fibroblasti SKOV3 o Ref52, tuttavia, l'intervallo e il percorso temporale complessivo devono essere regolati in base al tipo di cellula e all'evento biologico osservato. Se si associa con la microscopia a fluorescenza, mettere in pausa l'acquisizione fluorescente immediatamente prima del passaggio 6.5., utilizzare il contrasto di fase o il campo luminoso per posizionare la micropipetta e tirare e riavviare l'acquisizione fluorescente subito dopo.
6. Se il pipet scivola o se il gradiente è altrimenti rilassato o rilasciato, trovare una nuova cella ripetendo i passaggi 6.2 e 6.3.

7. Determinazione della risposta alla migrazione di durotattici

1. Utilizzando ImageJ¹⁹ o un altro programma di analisi dell'immagine, calcolare l'angolo di svolta disegnando una linea tra il centro del bordo iniziale della cella a 0 min e 30 min post monitor (riflettendo la traiettoria originale della cella) e un'altra linea tra il centro di il bordo iniziale appena prima e 80 min dopo la stimolazione e la misurazione dell'angolo tra queste due linee.

Risultati

Preparando le micropipette (Figura 1) e normalizzando la generazione della forza dei pull (Figura 2 e Figura 3) come descritto in precedenza, sono state identificate condizioni di durotassiche ottimali per più linee cellulari. Utilizzando questa tecnica, come descritto nella Figura 4, entrambe le cellule tumorali ovariche SKOV-3¹⁷ e i fibroblasti embrionali di ratto Ref52 (

Discussione

Divenuto qui è un test di durotassire ripetibile e a singola cellula che consente di valutare la capacità di una cellula di alterare il suo comportamento di migrazione in risposta a segnali meccanici acuti. Questa tecnica può essere utilizzata anche in combinazione con la microscopia a fluorescenza e proteine o biosensori di fusione appropriate per esaminare la segnalazione subcellulare e gli eventi citoscheletrici entro secondi di stimolazione meccanica o su una scala cronologica più lunga durante movimento durotattico....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
acrilammide 40 %	Persolfato di	diagnostico nazionale EC-810
	Fisher	BP179-25
BD20A Generatore ad alta frequenza	Electro Technic Products	12011A	115 V -  Lega la bacchetta corona portatile
Silano (y-metacrilossipropiltrimetossisilano) (	Sigma Aldrich	M6514
Bis-acrilammide 2%	National Diagnostic	EC-820
Capillari in vetro borosilicato	World Precision Instruments	1B100-4
Branson 2510 Pulitore ad ultrasuoni	Bransonic		a frequenza 40 kHz
	Narshige	MC35A
DMEM	Corning	10-013-CV
DMEM senza fenolo rosso	Sigma Aldrich	D5030
Estrattore per micropipette in vetro a doppio stadio	Narshige	PC-10
Fattore di crescita epidermico	Peprotech	AF-100-15
Etanolo	Pharmco-aaper	111000200
Siero bovino fetale (One Shot qualificato)	Gibco	A31606-02
Fibronectina	EMD Millipore	FC010
Fluosfere carbossilato 0,2 um	Invitrogen	F8810, F8807, F8811
Fugene 6	Roche	1815091	1.5 μ g DNA / 6 μ L fugene 6 per 35 mm
piatto Acido acetico glaciale	Fisher Chemical	A38SI-212
Piatto con fondo in vetro	CellVis	D60-60-1.5-N
Vetrino coprioggetti Microscopia	elettronica	Scienze 72224-01	22 mm, #1.5
HCl	JT Baker	9535-03
Hellmanex III  Concentrato detergente speciale	Sigma Aldrich	Z805939	Utilizzato al 2% in ddH2O per la pulizia dei vetrini coprioggetti
Polvere	HEPES Sigma Aldrich	H3375	Tampone HEPES Make 50mM, pH 8,5
Intelli-Ray 400 Proiettore UV con otturatore	Uviton International	UV0338
Isopropanolo	Fisher Chemical	A417-4
Microforge	Narshige	MF900
Micromanipolatore	Narshige	MHW3
Olio Minerale	Sigma Aldrich	M5904
Nanopure Life Science UV/UF System	Barnstead	D11931	ddH2O
Nikon Eclipse Ti	Nikon
OptiMEM	Invitrogen	31985062
Parafilm M	Bemis Company, Inc	PM-992
PBS			139 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 28,6 mM Na2HPO4, 1,6 mM KH2PO4, pH 7,4
Fattore di crescita derivato piastrinico-BB (PDGF-BB)	Sigma Aldrich	P4056
Ref52			Linea cellulare di fibroblasti embrionali di ratto; Coltura in DMEM + 10%
FBS Tampone			134 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2,4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-glucosio, pH 7,4
SKOV-3		colture di tipo americano	Coltura in DMEM + 10% FBS
Sulfo-SANPAH	Covachem	12414-1
Pulitore al plasma da tavolo	Harrick Plasma	PDC-32G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-50