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Articolo metodologico

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

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DOI:

10.3791/60002

⸱

22 luglio 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, 2III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, 3Department of Nephrology, Monash Health, 4Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, 5Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, 6Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, 7Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

In questo articolo

Sommario

La combinazione di etichettatura anticorpale, compensazione ottica e microscopia luminosa avanzata consente l'analisi tridimensionale di strutture o organi completi. Descritto qui è un metodo semplice per combinare l'etichettatura di fette renali spesse, la compensazione ottica con il cinnamate etilico e l'imaging confocale che consente la visualizzazione e la quantificazione delle strutture renali tridimensionali.

Abstract

Le tecniche di compensazione ottica rendono trasparente il tessuto bilanciando l'indice di rifrazione in un campione per la successiva imaging tridimensionale (3D). Hanno ricevuto grande attenzione in tutte le aree di ricerca per il potenziale di analizzare strutture multicellulari microscopiche che si estendono su distanze macroscopiche. Dato che i tubuli renali, la vascolatura, i nervi e i glomeruli si estendono in molte direzioni, che finora sono stati catturati solo parzialmente dalle tradizionali tecniche bidimensionali, la pulizia dei tessuti ha aperto anche molte nuove aree di ricerca sui reni. L'elenco dei metodi di compensazione ottica è in rapida crescita, ma rimane difficile per i principianti in questo campo scegliere il metodo migliore per una determinata domanda di ricerca. Fornito qui è un metodo semplice che combina l'etichettatura anticorpale di fette di rene di topo spesse; sgombera ottica con cinnamate chimico a buon mercato, non tossico e pronto all'uso; e l'imaging confocale. Questo protocollo descrive come perfondere i reni e utilizzare un passaggio di recupero dell'antigene per aumentare il legame degli anticorpi senza richiedere attrezzature specializzate. La sua applicazione è presentata nell'imaging di diverse strutture multicellulari all'interno del rene, e come risolvere la scarsa penetrazione degli anticorpi nel tessuto è affrontato. Discutiamo anche delle potenziali difficoltà dell'imaging dei fluorofori endogeni e dell'acquisizione di campioni molto grandi e di come superarli. Questo semplice protocollo fornisce uno strumento facile da configurare e completo per studiare il tessuto in tre dimensioni.

Introduzione

Il crescente interesse nello studio di interi organi o di grandi strutture multicellulari ha portato allo sviluppo di metodi di compensazione ottica che coinvolgono l'imaging di tessuto trasparente in tre dimensioni. Fino a poco tempo fa, i metodi migliori per stimare il numero di cellule, la lunghezza o il volume di intere strutture sono stati la stereologia o il sezionamento seriale esaustivo, che si basa sul campionamento sistemico del tessuto per l'analisi successiva in due dimensioni1, 2 Il nome del sistema , 3. Tuttavia, questi metodi richiedono molto tempo e necessitano di un elevato livello di formazione e competenza4. I metodi ottici di compensazione superano questi problemi bilanciando l'indice di rifrazione in tutto un campione per rendere il tessuto traslucido per l'imaging 3D5,6,7.

Sono stati sviluppati diversi metodi di compensazione ottica che rientrano in due categorie principali: metodi basati su solventi e acquosi. I metodi basati su aqueous possono essere ulteriormente suddivisi in semplice immersione8,9, iperidratazione10,11e idrogel incorporando12,13. I metodi a base di solvente disidratano il tessuto, rimuovono i lipidi e normalizzano l'indice di rifrazione a un valore intorno a 1,55. Limitazioni della maggior parte dei metodi a base di solventi sono la dorching della fluorescenza endogena di proteine reporter comunemente usate come GFP, tossicità dei solventi, capacità di sciogliere le colle utilizzate in alcune camere di imaging o lenti oggettive, e il restringimento dei tessuti durante disidratazione14,15,16,17,18,19,20,21. Tuttavia, i metodi basati sui solventi sono semplici, efficienti in termini di tempo e possono funzionare in diversi tipi di tessuto.

I metodi basati su aqueous si basano sull'immersione del tessuto in soluzioni acquose che hanno indici di rifrazione nell'intervallo di 1.38-1.528,11,12,22,23,24 . Questi metodi sono stati sviluppati per preservare l'emissione di proteine endogeniche di reporter fluorescenti e prevenire il restringimento indotto dalla disidratazione, ma i limiti della maggior parte dei metodi di compensazione basati su acquosi includono una durata più lunga del protocollo, l'espansione dei tessuti e modificazione delle proteine (cioè denaturazione parziale delle proteine mediante urea in protocolli iperidratanti come ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS ha affrontato l'espansione dei tessuti combinando l'urea con il sorbitolo, che controbilancia per disidratazione l'espansione dei tessuti indotta dall'urea, e ha conservato l'ultrastruttura dei tessuti valutata dalla microscopia elettronica10. Il restringimento o l'espansione dei tessuti influisce sulle dimensioni assolute delle strutture, sulle distanze tra gli oggetti o sulla densità delle cellule per volume; pertanto, la misurazione delle dimensioni cambia al momento della compensazione del tessuto può aiutare a interpretare i risultati ottenuti7,26.

In generale, un protocollo per la compensazione ottica è costituito da più passaggi, tra cui pretrattamento, permeabilizzazione, immunolabeling (se necessario), corrispondenza dell'indice di rifrazione e imaging con microscopia luminosa avanzata (ad esempio, a due fotone, confocali o microscopia a fluorescenza del foglio luminoso). La maggior parte degli approcci di compensazione sono stati sviluppati per visualizzare il tessuto neuronale, e studi emergenti hanno convalidato la loro applicazione in altri organi5. Questo strumento completo è stato dimostrato in precedenza per consentire un'analisi affidabile ed efficiente delle strutture renali, tra cui glomeruli27,28, infiltrati immunitari28, vascolatura28e segmenti di tubulo 29, ed è un approccio ideale per migliorare la comprensione della funzione glomerare e del rimodellamento del tubulo in salute e malattia.

Riassunto qui è un metodo a base di solventi che combina l'immunostaining dei tubuli renali; sgombera ottica con cinnamate chimico a buon mercato, non tossico e pronto all'uso (ECi); e l'imaging a microscopia confocale che consente una visualizzazione completa del tubulo e la quantificazione. Questo metodo è semplice, combina antigene-recupero di fette di rene con colorazione di anticorpi commerciali, e non richiede attrezzature specializzate, che lo rende accessibile alla maggior parte dei laboratori.

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Protocollo

NOT: Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Oregon Health and Science University di Portland, Oregon, USA e dalle autorità locali competenti di Aquisto, in Germania.

1. Retrogrado Perfusione aortica addominale e fissazione dei reni del topo

  1. Preparare le soluzioni lo stesso giorno o sera prima e conservare in frigorifero durante la notte. Soluzioni calde alla temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.
  2. Fare un lotto fresco di 3% paraformaldeide (PFA) in 1x salina tampone fosfato (PBS). Sono necessari circa 50-100 mL PFA per mouse.
    1. Per fare 1 L del 3% PFA: Pesare 30 g di PFA e aggiungere 800 mL di acqua distillata nella cappa del fuma. Mescolare e riscaldare a 50-60 gradi centigradi. Non riscaldare al di sopra di 70 gradi centigradi.
      AVVISO: il PFA è tossico. Preparare l'APE nella cofano dei fumi.
    2. Aggiungere lentamente diverse gocce di 2N NaOH. Attendere qualche minuto fino a quando PFA entra nella soluzione o aggiungere qualche goccia in più. Alcuni piccoli pezzi non si dissolveranno.
    3. Togliere la soluzione dal fuoco. Aggiungere 50 mL di 20x PBS. Rilassare sul ghiaccio a RT.
    4. Regolare il pH a 7,3-7,4 con HCl. Aggiungere acqua distillata a 1 L.
    5. Rimuovere le particelle non dissolte filtrando 1x PBS e 3% PFA con filtro 0,22 m.
  3. Aggiungere 1.000 unità di Eparin a 1 L di 1x PBS. Trasferire 1x PBS contenente eparina e 3% PFA in 1x PBS in siringhe di plastica da 50 mL separate.
    NOT: Se disponibile, pompa a pressione controllata impostata a 80-100 mmHg o pressione idrostatica (metodo a goccia, l'altezza delle soluzioni di perfusione: 160-200 cm sopra l'animale) può essere utilizzato per la perfusione renale.
  4. Collegare il PBS, PFA e un ago a farfalla 21 G smussato a un stopcock a tre vie. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nell'intero sistema.
  5. Etichettare un tubo conico da 15 mL e dispensare 10 mL di PFA.
  6. Anestesizzare profondamente un topo C57BL/6 maschio o femmina 12-24 settimane di età utilizzando 120 mg/kg di peso corporeo ketamina e 16 mg/kg di peso corporeo xylazina. L'animale deve essere controllato per la completa assenza di reattività pizzicando i riflessi prima di procedere alla chirurgia (ad esempio, riflesso pizzico di dita dei pipista).
  7. Una volta che l'animale ha raggiunto un piano chirurgico di anestesia, posizionarlo sulla schiena sotto il microscopio dissetante. Aprire chirurgicamente l'addome con un'incisione addominale mediana utilizzando una forbice operativa ed esporre l'aorta addominale.
  8. Stringere l'aorta addominale proprio sopra la ramificazione all'arteria iliaca con un emotoma curvo. Quindi bloccare l'aorta addominale proprio sotto le arterie renali con un micro serrefine. Fare una piccola incisione (1 mm) sull'aorta addominale tra i due morsetti con forbici vannas. Inserire lentamente l'ago della farfalla nell'incisione e fare attenzione a non strappare l'aorta addominale aperta.
  9. Ligate l'arteria renale giusta con una sutura di seta 5-0 e rimuovete il rene destro per altre analisi se è necessario un solo rene per la perfusione e la fissazione.
  10. Rimuovere il micro serrefine, transetto la vena del portale con le forbici vannas, e profumare immediatamente con 50 mL di PBS contenente eparina, quindi passare e perfondere con 50 mL di 3% PFA.
    NOT: L'alta pressione perfusione attraverso l'aorta addominale è necessaria per aprire tubuli renali per una migliore diffusione degli anticorpi attraverso il tessuto. La perfusione nel cuore non può aprire tubuli renali.
  11. Raccogliere il rene perfuso con attenzione ed evitare di forare o spremere il tessuto.
  12. Rimuovere la capsula e tagliare il rene in fette coronali spesse 1 mm. Utilizzare una matricedifiltro dei dati ( Tabella dei materiali ) per standardizzare lo spessore della sezione.
    NOT: In alternativa, prendere in considerazione l'utilizzo di un vibratome.
  13. Immergere le fette renali con il PFA preparato nel tubo conico da 15 mL etichettato.
  14. Distribuisci 10 mL di PFA a un altro tubo conico da 15 mL etichettato. Sciacquare l'ago a tre vie e l'ago delle farfalle con PBS prima di passare al mouse successivo.
  15. Effettuare post-fissaggio durante la notte presso RT protetti dalla luce.

2. Preparazione dei tessuti e immunostaining

  1. Dopo la post-fissazione, lavare la fetta renale due volte con 1x tampone di lavaggio (Tabella dei materiali) per 1 h su un rocker orizzontale a RT.
  2. Eseguire il recupero dell'antigene. Riscaldare 300 mL di 1x soluzione di smascheramento antigene (Tin grado dimateriali) in un becher da 500 mL a 92-98 gradi centigradi. Racchiudere la fetta in cassetta di incorporamento permeabile al cuscinetto riscaldato con agitazione per 1 h a 92-98 gradi centigradi. Togliere il becher dal fuoco e lasciarlo raffreddare a RT.
    NOT: Alcuni fornitori testano i loro anticorpi per l'applicazione dell'immunoistochimica e includeranno un metodo di recupero dell'antigene suggerito nella scheda tecnica. Pertanto, alcuni epitopi potrebbero richiedere un buffer più semplice (ad esempio, pH 9).
  3. Trasferire la fetta in 10 mL di 1x buffer di lavaggio con 0.1% Triton X-100 e rock durante la notte a RT. Lavare le fette 2x con 10 mL di tampone di lavaggio 1x fresco per 1 h il giorno successivo.
  4. Diluire l'anticorpo primario in 500 -L di normale diluente anticorpo (Tabella dei materiali). Iniziare con una concentrazione di 1:50-1:100. Afmasse delicatamente la fetta renale in anticorpi primari diluiti per 4 d a 37 gradi centigradi.
    NOT: Poiché ogni anticorpo ha proprietà uniche, la temperatura durante l'incubazione degli anticorpi e le diluizioni degli anticorpi devono essere ottimizzate per le singole sonde. Per i controlli secondari solo anticorpi, incubare il tessuto renale in diluente senza anticorpo primario. Invece di diluente anticorpo commerciale, 1x PBS con 0.1% Triton X-100 e 0.01% azide di sodio può essere utilizzato.
  5. Lavare la fetta renale in 10 mL di 1x lavaggio durante la notte a RT con un cambio di tampone di lavaggio dopo 8 h.
  6. Diluire gli anticorpi secondari (ad esempio, 1:100 per gli anticorpi secondari coniugati ad Alexa Fluor) in 500 - L di normale diluente anticorpo. Incubare le fette di rene in anticorpi secondari diluiti per 4 giorni a 37 gradi centigradi. Da questo passo in poi, proteggere le fette di rene dalla luce.
  7. Lavare le fette di rene in 10 mL di 1x lavare il buffer durante la notte a RT con un cambio di buffer di lavaggio dopo 8 h.

3. Cancellazione dei tessuti

  1. Trasferire la fetta renale a 5 mL di alto grado 100% etanolo (Tabella dei materiali) per 2 h a RT con dondolo delicato (con un passaggio all'etanolo fresco dopo 1 h). Questo passo è per la disidratazione dei tessuti.
    NOT: L'etanolo di alto grado è necessario per ottenere un'elevata traslucenza tissutale nella fase successiva. Metanolo o tetraidrofuran sono reagenti di disidratazione alternativi con alto potenziale di delipidazione.
  2. Immergere la fetta renale in 2 mL di ECi (Tabella dei Materiali) con dondolo delicato a RT (con un cambio di ECi fresco dopo 2 h) durante la notte.
    NOT: Il punto di congelamento/fusione dell'ECi è di 6-8 gradi centigradi. Pertanto, non conservare i campioni in frigorifero. Condurre l'immersione in una cappa di fumi correttamente ventilata ed evitare il contatto diretto con i vestiti e la pelle (ECi è un composto non tossico approvato dalla Food and Drug Administration ma ha un forte odore). Utilizzare tubi Eppendorf regolari o recipienti di vetro (nessun recipiente in polistirolo).
  3. La traslucenza dei tessuti può essere raggiunta dopo l'immersione ECi e quando le fette di rene sono pronte per l'imaging.

4. ConfocalImaging e analisi delle immagini

NOT: Per l'imaging, altre tecniche di microscopia possono essere utilizzate finché la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione è compatibile con l'obiettivo. Questo protocollo utilizza un microscopio confocale invertito.

  1. Aggiungete 600-1.000 l di ECi nella teglia di fondo in vetro (Tabella dei materiali).
    NOT: Evitare l'uso di piatti di coltura cellulare regolari, perché ECi è un solvente organico che dissolverà i piatti di plastica. Allo stesso modo, ECi potrebbe attaccare parti in plastica / anelli di isolamento su lenti obiettive. Fare riferimento alle relazioni appropriate per una panoramica dei piatti di imaging compatibili30 e delle camere stampate 3D 3D28.
  2. Trasferire la fetta renale traslucida nel piatto. Posizionare un coperchio rotondo sulla fetta renale per applicare una leggera pressione verso il fondo di vetro. Sigillare il piatto con pellicola di paraffina (Tabella dei materiali) per evitare perdite di ECi.
    NOT: Organi interi o fette di tessuto spesse più millimetri possono richiedere un bordo (cemento dentale o elastomero in silicone; vedi Tabella dei materiali) intorno al tessuto per creare un eCi-pool per il campione.
  3. Posizionare il piatto sulla piattaforma di imaging al microscopio.
  4. Prendere diversi z-stack ed eseguire cuciture. Iniziare con una dimensione z-step di 5 m.
    NOT: Considerare l'utilizzo di obiettivi a lunga distanza di lavoro (>5 mm) e ad alta apertura numerica (>0,9) per l'imaging di fette o organi di tessuto molto spessi. Dopo l'imaging, trasferire il tessuto nell'etanolo e conservarlo in tampone o PBS con azide di sodio dello 0,02%.
  5. Analizzare l'immagine utilizzando il rendering 3D con il software (Table of Materials).

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Risultati

I reni sono organi complessi composti da 43 diversi tipi di cellule31. La maggior parte di queste cellule formano grandi strutture multicellulari come glomeruli e tubuli, e la loro funzione è fortemente dipendente dalle interazioni tra loro. Le tecniche istologiche classiche 2D catturano parzialmente queste grandi strutture e possono perdere cambiamenti focali all'interno di strutture intatte31. Pertanto, l'analisi 3D con tecniche di compensazione ottica aiuta a capire come...

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Discussione

Le tecniche di compensazione ottica hanno ricevuto un'ampia attenzione per la visualizzazione 3D e la quantificazione della microanatomia in vari organi. In questo caso, il metodo di compensazione basato su solventi (ECi) è stato combinato con l'immunolabeling per l'imaging 3D di tubuli interi in fette di rene. Questo metodo è semplice, economico e veloce. Tuttavia, altre domande di ricerca possono essere meglio risolte con altri protocolli di compensazione5. È anche importante tenere a mente che ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

T. S. è sostenuto da sovvenzioni della DFG German Research Foundation (332853055), else Kraner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) e della Facoltà di Medicina del RWTH Aachen (RWTH Returner Program). V. G. P. è supportato da borse di ricerca da Deutsche Gesellschaft pellicco Nephrologie, la Alexander von Humboldt Foundation, e il National Health and Medical Research Council dell'Australia. D. H. E è supportato da Fondation LeDucq. R. K. è supportato da sovvenzioni del DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), dello Stato di Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) e del Centro interdisciplinare di ricerca clinica presso la RWTH Aachen University (O3-11).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ m filterFisher Scientific09-761-112
15 mL tubo conicoFisher Scientific339650
21 G ago a farfallaBraunVenofix
Rubinetto a 3 vieFisher ScientificK420163-4503
Software di analisi 3DBitplane AGIMARIS
Software di analisi 3DCellprofilersoftware open source gratuito
5-0 sutura di setaFine Science Tools18020-50
siringhe di plastica da 50 ml FisherScientific14-817-57
Anticorpo monoclonale anti-BrdURoche11296736001
Diluente per anticorpiDakoS0809
CD31-647BioLegend 102516
Soluzione per il recupero dell'antigene a base di citratoVector LaboratoriesH-3300
Emostatico curvoFisher Scientific13-812-14
Dako Wash BufferAgilentS3006
Microscopio da dissezioneMoticDSK-500
Cassette per inclusione CarlRothE478.1
EtanoloMerck
EtilcinnamatoSigma-Aldrich112372
Film flessibile/Parafilm MSigma-AldrichP7793
Capra anti-AQP2Santa Cruz Biotechnologysc-9882
Porcellino d'India anti-NKCC2N/AN/A DOI: 10.1681/ASN.2012040404
HClCarl RothP074.1
EparinaSagent Pharmaceuticals401-02
EmostaticoAgnthos312-471-140
Bilanciere orizzontaleLabnetS2035-E
Piatto di imagingIbidi81218
KetaminaMWI Salute animale501090
Micro serrefineStrumenti di scienze fini18052-03
NaOHFisher ScientificS318-500
Forbici operatorieMerit97-272
ParaformaldeideThermo Fischer ScientificO4042-500
Coniglio anti-fosforoThr53-NCCPhosphoSolutionsp1311-53
Elastomero siliconicoWorld Precision Instruments World Precision Instruments Kwik-Sil
Sodio azideAffettatrice per tessuti Sigma-AldrichS2002
Zivic InstrumentsHSRA001-1
Triton X-100Acros OrganicsAC215682500
forbici VannasFine Science Tools15000-00
VibratomeLancerSeries 1000
XilazinaMWI Salute animaleAnaSed Inj SA (Xilazina)
100983

Riferimenti

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