Articolo metodologico

Focalizzata la litografia del fascio ionico per esacire di nano-architetture nei microelettrodi

DOI:

10.3791/60004

⸱

19 gennaio 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Michigan, 2Veteran Affairs Ann Arbor Healthcare System, 3Department of Neurology, School of Medicine, University of Michigan, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 5Michigan Center for Materials Characterization, University of Michigan, 6Carl Zeiss SMT, Inc.

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo dimostrato che l'incisione della nano-architettura nei dispositivi intracorticali di microelettrodi può ridurre la risposta infiammatoria e ha il potenziale per migliorare le registrazioni elettrofisiologiche. I metodi descritti qui delineano un approccio per incidere le nano-architetture nella superficie di microelettrodi intracorticali in silicio a stilo non funzionali e funzionali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con i progressi nell'elettronica e nella tecnologia di fabbricazione, i microelettrodi intracorticali hanno subito miglioramenti sostanziali che hanno permesso la produzione di microelettrodi sofisticati con maggiore risoluzione e capacità ampliate. I progressi nella tecnologia di fabbricazione hanno sostenuto lo sviluppo di elettrodi biomimetici, che mirano a integrarsi senza soluzione di continuità nel parenchyma cerebrale, ridurre la risposta neuroinfiammatoria osservata dopo l'inserimento degli elettrodi e migliorare la qualità e longevità delle registrazioni elettrofisiologiche. Qui descriviamo un protocollo per impiegare un approccio biomimetico recentemente classificato come nano-architettura. L'uso della litografia del fascio ionico focalizzato (FIB) è stato utilizzato in questo protocollo per incidere specifiche caratteristiche nano-architettoniche nella superficie di microelettrodi intracorticali a singolo gambo non funzionali e funzionali. L'incisione di nano-architetture nella superficie dell'elettrodo ha indicato possibili miglioramenti della biocompatibilità e della funzionalità del dispositivo impiantato. Uno dei vantaggi dell'utilizzo di FIB è la possibilità di incidere su dispositivi fabbricati, al contrario durante la fabbricazione del dispositivo, facilitando possibilità illimitate di modificare numerosi dispositivi medici dopo la produzione. Il protocollo qui presentato può essere ottimizzato per vari tipi di materiali, funzionalità di nano-architettura e tipi di dispositivi. L'aumento della superficie dei dispositivi medici impiantati può migliorare le prestazioni del dispositivo e l'integrazione nel tessuto.

Introduzione

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I microelettrodi intracorticali (IME) sono elettrodi invasivi che forniscono un mezzo di interfacciamento diretto tra dispositivi esterni e le popolazioni neuronali all'interno della corteccia cerebrale1,2. Questa tecnologia è uno strumento inestimabile per registrare i potenziali di azione neurale per migliorare la capacità degli scienziati di esplorare la funzione neuronale, far progredire la comprensione delle malattie neurologiche e sviluppare potenziali terapie. Il microelettrodo intracorticale, utilizzato come parte dei sistemi HMI (Brain Machine Interface), consente la registrazione dei potenziali d'azione da un singolo o piccolo gruppo di neuroni per rilevare le intenzioni motorie che possono essere utilizzate per produrre uscite funzionali3. Infatti, i sistemi BMI sono stati utilizzati con successo per scopi protesici e terapeutici, come il controllo del ritmo sensomotorio acquisito per azionare un cursore computerin pazienti con sclerosi laterale amiotrofica (SLA)4 e lesioni del midollo spinale5 e ripristinare il movimento in persone che soffrono di tetraplegia cronica6.

Purtroppo, gli IME spesso non riescono a registrare costantemente nel tempo a causa di diverse modalità di guasto che includono fattori meccanici, biologici e materiali7,8. La risposta neuroinfiammatoria che si verifica dopo l'impianto dell'elettrodo è pensata per essere una sfida considerevole contribuendo al fallimento degli elettrodi9,10,11,12,13,14. La risposta neuroinfiammatoria viene avviata durante l'inserimento iniziale dell'IME che recisso la barriera ematoencefalica, danneggia il parenchyma cerebrale locale e interrompe le reti gliali e neuronali15,16. Questa risposta acuta è caratterizzata dall'attivazione di cellule gliali (microglia/macrofati e astrociti), che rilasciano molecole pro-infiammatorie e neurotossiche intorno al sito dell'impianto17,18,19,20. L'attivazione cronica delle cellule gliali si traduce in una reazione del corpo estraneo caratterizzata dalla formazione di una cicatrice gliale isolando l'elettrodo dal tessuto cerebrale sano7,9,12,13,17,21,22. In definitiva, ostacolando la capacità dell'elettrodo di registrare i potenziali di azione neuronale, a causa della barriera fisica tra l'elettrodo e i neuroni e la degenerazione e la morte dei neuroni23,24,25.

Il fallimento precoce dei microelettrodi intracorticali ha portato a notevoli ricerche nello sviluppo di elettrodi di nuova generazione, con particolare attenzione alle strategie biomimetiche26,27,28,29,30. Di particolare interesse per il protocollo qui descritto, è l'uso della nano-architettura come classe di alterazioni di superficie biomimetiche per gli IME31. È stato stabilito che le superfici che imitano l'architettura dell'ambiente naturale in vivo hanno una risposta biocompatibile migliorata32,33,34,35,36. Pertanto, l'ipotesi che implichi questo protocollo è che la discontinuità tra l'architettura ruvida del tessuto cerebrale e l'architettura liscia dei microelettrodi intracorticali può contribuire alla risposta neuroinfiammatoria e cronica del corpo estraneo agli IME impiantati (per una revisione completa si riferisce a Kim et al.31). Abbiamo dimostrato in precedenza che l'utilizzo di caratteristiche nano-architettura simili all'architettura a matrice extracellulare del cervello riduce i marcatori infiammatori degli astrociti dalle cellule coltivate su substrati nano-architetturati, rispetto alle superfici di controllo piatte nei modelli in vitro ed ex vivo della neuroinfiammazione37,38. Inoltre, abbiamo dimostrato l'applicazione della litografia del fascio ionico focalizzato (FIB) per incidere le nano-architetture direttamente sulle sonde in silicio ha portato a una vitalità neuronale significativamente aumentata e a una minore espressione di geni pro-infiammatori da animali impiantati con le sonde nano-architettura rispetto al gruppo di controllo liscio26. Pertanto, lo scopo del protocollo qui presentato è quello di descrivere l'uso della litografia FIB per eguagliare nano-architetture su dispositivi a microelettrodi intracorticali fabbricati. Questo protocollo è stato progettato per incidere caratteristiche di nano-architettura in superfici di silicio di fazzoletti intracorticali di microelettrodi utilizzando sia processi automatizzati che manuali. Questi metodi sono semplici, riproducibili e possono certamente essere ottimizzati per vari materiali del dispositivo e dimensioni di lavorazione desiderate.

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Protocollo

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NOTA: Effettuare le seguenti operazioni indossando l'attrezzatura protettiva personale appropriata, ad esempio un camice da laboratorio e guanti.

1. Sonda di silicone non funzionale per litografia del fascio ionico focalizzato (FIB)

NOTA: Per la procedura completa che descrive la fabbricazione del wafer SOI con le 1.000 sonde, si prega di fare riferimento a Ereifej et al.39.

  1. Isolare una striscia di 2-3 sonde di silicio dal wafer in silicio sull'isolante (SOI) contenente 1.000 sonde. Non fare strisce contenenti più di tre sonde in silicio. Ciò può aumentare le probabilità di montaggio allentato e può causare un disallineamento con conseguente incisivo del FIB in modo non corretto.
    NOTA: Strisce / sonde non saldamente seduti sul mozzicone di alluminio possono causare due complicazioni: 1) quando la fase si muove per lavorare sulla sezione successiva, ci saranno vibrazioni e la fresatura non sarà accurata fino a quando la sonda si deposita e 2) può causare una variazione elevata ed essere fuori dal piano di messa a fuoco.
    1. Mentre si indossano i guanti, utilizzare pinze sottili per mettere pressione intorno alle sonde per rompere una piccola sezione contenente due o tre sonde.
  2. Pulire con cura la sonda di silicio di tutta la polvere e i detriti prima dell'incisione FIB. Preparare una piastra di polistirolo 6 pozzetto con la pipimernatura 3 mL/pozzetto del 95% di etanolo in tre pozzetti.
    1. Raccogliere con attenzione la striscia tagliata delle sonde di silicio utilizzando punte sottili o pinze sottovuoto e posizionarla nel colino cellulare. Posizionare una sola striscia di sonde di silicio per colino per evitare di rompere le sonde. Posizionare il colino contenente la striscia di schesche di silicio nel primo pozzo contenente il 95% di etanolo per la pulizia. Tenere il colino nel primo pozzo per 5 min.
    2. Spostare il colino contenente le sonde di silicio dal primo pozzo e posizionarlo nel secondo pozzo contenente il 95% di etanolo per altri 5 min. Ripetere ancora una volta nel terzo pozzo.
    3. Posizionare il colino contenente le sonde in silicio pulito su una piastra di politetrafluoroetilene per asciugare all'aria. Eseguire questa fase in un cappuccio sterile per evitare la contaminazione da polvere.
  3. Collocare la striscia di sonde di silicio essiccata all'aria in un contenitore sigillato per il trasporto al SEM-FIB. Avvolgere il colino contenente i campioni essiccati all'aria con un involucro di plastica o alluminio per il trasporto e/o lo stoccaggio per mantenere la pulizia.
  4. Utilizzare pinze sottili ribaltate o sottovuoto per raccogliere con cura la striscia pulita di sonde di silicio e metterle su uno stub di alluminio pulito (utilizzato per l'imaging/incisione SEM-FIB) per prepararlo al montaggio.
  5. Utilizzare uno stuzzicadenti (o un altro strumento con punta fine come un sottile filo elettrico), per posizionare una piccola goccia (10 dollari) di vernice d'argento sul bordo del substrato di silicio che circonda le sonde. Fissare la striscia verso il basso diffondendo la vernice d'argento intorno ai lati del substrato di silicio che circonda la sonda. Lasciare asciugare completamente la vernice d'argento prima di posizionare lo stub di alluminio nel SEM-FIB.
    NOTA: Fare attenzione a non ottenere vernice d'argento sul gambo dell'elettrodo perché questa è la parte che verrà incisa. Se la striscia di sonde non è saldamente ancorata allo stub di alluminio, la striscia può muoversi durante la lavorazione o avere un piano focale diverso, risultando così in una fresatura errata da parte del FIB. Diverse strisce di sonde di silicio possono essere montate sullo stesso mozzicone di alluminio, assicurandosi che ci sia ampio spazio tra le strisce per consentire la rimozione dallo stub dopo l'incisione. Ciò consentirà un'incisione più efficiente di più sonde utilizzando la funzione automatizzata descritta di seguito.

2. Allineamento del FIB alle sonde di silicio

  1. Fare clic sul pulsante di sfiato nella scheda di controllo del fascio per sfiatare la camera. Premete Maiusc e F3 per eseguire la fase iniziale. Confermare la selezione selezionando il pulsante Home Stage nella finestra popup.
    NOTA: l'esecuzione del funzionamento dello stadio iniziale è una fase preventiva per garantire che l'asse dello stage venga letto correttamente dal software e che il microscopio sia in buone condizioni.
  2. Una volta completato lo stadio iniziale, spostare lo stage in modo che si disperda su X , 70 mm, Y, 70 mm, 0 mm, T, R e 0. Una volta che la camera è ventilata, mettere su guanti nitrile puliti e aprire la porta della camera.
    NOTA: a seconda dell'applicazione dell'utente precedente, potrebbe essere necessario modificare l'adattatore dello stage. Gli adattatori standard (ad esempio, lo stile FEI) possono essere rimossi svitando il bullone centrale in senso antiorario e installati avvitando in senso orario nella piastra di rotazione del palco.
  3. Inserire lo stub di alluminio tenendo le sonde nella parte superiore dell'adattatore da palco. Fissare lo stub di alluminio stringendo la vite impostata sul lato dell'adattatore da palco. Utilizzare la chiave inglese esadecimale da 1,5 mm per questa attività.
  4. Regolare l'altezza dell'adattatore da stage ruotando l'adattatore in senso orario per abbassarlo o in senso antiorario per sollevarlo. Fissare l'adattatore da palco sulla piastra di rotazione ruotando il dado cono di bloccaggio in senso orario fino a quando il dado non è sicuro contro la piastra di rotazione dello stadio. Tenere l'adattatore con l'altra mano per evitare la rotazione dell'adattatore e i campioni mentre si stringe il dado cono di bloccaggio.
    NOTA: utilizzare il misuratore di altezza fornito per determinare l'altezza appropriata. La parte superiore dello stub di alluminio dovrebbe essere la stessa altezza della linea massima mostrata sul misuratore di altezza. Se si stringe il dado del cono può causare danni allo stadio e all'adattatore. Utilizzare solo una forza sufficiente per fissare i campioni.
  5. Acquisire un'immagine della fotocamera di navigazione. Ruotare con attenzione il braccio della telecamera di navigazione fino a quando non si ferma. Lo stadio del microscopio si sposterà automaticamente in una posizione sotto la fotocamera. Guarda l'immagine dal vivo mostrata nel Quadrante 3 dell'interfaccia utente del microscopio .
    1. Una volta che il livello di luminosità si adatta automaticamente a un livello appropriato, acquisisci l'immagine premendo il pulsante verso il basso sulla staffa della fotocamera. Assicurarsi di attendere il completamento dell'acquisizione dell'intera immagine, indicato da un simbolo di pausa che appare nel Quadrante 3 e l'illuminazione della fotocamera disattivata. Questo richiede circa 10 s. Ruotare il braccio della fotocamera nella posizione chiusa. Lo stage tornerà alla posizione originale.
  6. Chiudere con attenzione la porta della camera del microscopio. Guarda l'immagine della telecamera CCD in Quadrant 4 mentre chiudi la porta. Assicurarsi che i campioni e lo stadio siano distanti per una distanza di sicurezza da qualsiasi componente critico nella camera del microscopio.
  7. Selezionare la freccia verso il basso accanto al pulsante Pompa nella scheda controllo trave. Selezionare Pompa con il pulsante Pulizia campione nel software dell'interfaccia utente per avviare la pompa a vuoto della camera e costruito in detergente al plasma. Assicurarsi che la porta sia sigillata spingendo delicatamente sulla faccia della porta mentre la pompa è in funzione. Attendere circa 8 min per il tempo di pompaggio e il ciclo di pulizia del plasma per completare la camera al microscopio.
    NOTA: Un sigillo sottovuoto può essere confermato tirando delicatamente sulla porta della camera, che dovrebbe rimanere chiusa se il sistema è sottovuoto.
  8. Una volta che l'icona nell'angolo in basso a destra dell'interfaccia utente diventa verde, premi il pulsante Wake-Up nella scheda di controllo del fascio che attiva i fasci di elettroni e ioni. Selezionare il quadrante 1 e impostare il segnale del fascio su fascio di elettroni (se non già impostato), impostare il quadrante 2 sul fascio ionico (se non già impostato).
    1. Impostare la tensione SEM su 5 kV, impostare la corrente del fascio SEM su 0,20 nA, impostare il rilevatore SEM su ETD, impostare la modalità del rilevatore su Elettrone secondario. Impostare la tensione FIB su 30 kV, impostare la corrente del fascio FIB su 24 pA, impostare il rilevatore FIB su rilevatore ICE, impostare la modalità del rilevatore sull'elettrone secondario.
  9. Fare doppio clic sulla sonda di silicio nell'immagine della telecamera di navigazione, quadrante 3 per spostare lo stage nella posizione approssimativa della sonda. Fare clic sul quadrante 1 per selezionarlo come quadrante attivo e premere il pulsante di pausa per avviare la scansione SEM. Impostare il tempo di analisi su 300 ns e disattivare l'interlacciamentodella scansione, l'integrazionedella linea e la media del frame. Impostare la rotazione della scansione su 0 nella scheda di controllo del fascio e fare clic con il pulsante destro del mouse sul regolatore di spostamento del fascio 2d e selezionare zero.
  10. Regolare l'ingrandimento sul valore minimo ruotando la manopola di ingrandimento in senso antiorario sul pannello MUI. Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine utilizzando le manopole del pannello MUI o l'icona della barra degli strumenti Luminosità contrasto automatico.
  11. Spostare lo stage facendo doppio clic con il pulsante sinistro del mouse su una funzione per centrarla o premendo la rotellina del mouse e attivando la modalità mouse joystick. Spostare la sonda di silicio desiderata per essere modellata al centro dell'immagine SEM.
  12. Individuare un bordo o altre caratteristiche, ad esempio una particella di polvere o un graffio. Aumentare l'ingrandimento a 2.000x ruotando la manopola di ingrandimento in senso orario. Regolare la messa a fuoco del SEM ruotando le manopole di messa a fuoco grossolana e fine sul MUI fino a quando l'immagine è a fuoco. Una volta che l'immagine è a fuoco, selezionare il pulsante Collega campione - alla distanza di lavoro nella barra degli strumenti.
  13. Verificare che l'operazione sia stata completata esaminando la coordinata dell'asse z nella scheda di navigazione. Il valore deve essere di circa 11 mm. Digitare 4,0 mm nella posizione dell'asse z e premere il pulsante Vai a con il mouse o premere il tasto Invio sulla tastiera e lo stage si sposterà alla distanza di lavoro di 4 mm.
  14. Spostare la fase in X e Y per individuare la spalla della sonda di silicio. Posizionarlo il più vicino possibile al centro del SEM. Modificare l'inclinazione dello stage a 52 gradi digitando "52" nella coordinata T e premendo Invio. Osservare se la spalla della sonda sembra muoversi verso l'alto o verso il basso nell'immagine. Utilizzare il dispositivo di scorrimento Stage per riportare la spalla della sonda al centro dell'immagine SEM. Regola solo la posizione z, non spostare gli assi X, Y, T o R.
  15. Eseguire il comando incorporato "xT Align Feature" situato nel menu a discesa della fase. Utilizzare il mouse per fare clic su due punti paralleli al bordo della sonda. Assicurarsi che il pulsante di opzione orizzontale sia selezionato nella finestra popup e fare clic su Fine. Lo stage ruoterà per allineare la sonda con l'asse X dello stage. Regolare lo stage in X,Y utilizzando il mouse per mettere di nuovo la spalla inferiore della sonda al centro dell'immagine SEM.
    NOTA: il primo punto dovrebbe essere verso l'aderenza della sonda e il secondo punto verso il punto della sonda.
  16. Selezionare la FIB nel quadrante 2 e assicurarsi che la corrente del fascio sia ancora 24 pA. Impostare l'ingrandimento su 5.000x e il tempo di permane o 100 ns. Digitare Ctrl-F sulla tastiera per impostare lo stato attivo FIB su 13,0 mm. Nella scheda di controllo del fascio, fare clic con il pulsante destro del mouse sul regolatore stigmatizzatore 2d e selezionare zero e, inoltre, fare clic con il pulsante destro del mouse sul regolatore Beam Shift 2d e selezionare zero. Impostare la rotazione della scansione su 0 e premere il pulsante luminosità contrasto automatico nella barra degli strumenti.
  17. Cercare un'immagine della spalla della sonda nel quadrante 2. Utilizzare lo strumento snapshot per acquisire un'immagine con la FIB. Verificare che la spalla della sonda si trova al centro dell'immagine FIB, in caso contrario, fare doppio clic sulla spalla della sonda per spostarla al centro. Spostare lo stage verso sinistra premendo il tasto freccia sinistra sulla tastiera circa 10-15 volte. Scattare un'altra istantanea e osservare se il lato sonda è ancora al centro della FIB.
    NOTA: in caso contrario, la rotazione dello stage deve essere regolata leggermente. Se la sonda si trova sopra il centro dell'immagine, lo stage deve essere ruotato nella direzione negativa. Se la sonda è al di sotto del centro, lo stage deve essere ruotato in senso orario. Immettere una rotazione compucentrica relativa compresa tra 0,01 e 0,2 gradi a seconda del modo in cui è necessario allineare la sonda.
  18. Ripetere i passaggi da 2,16 a 2,17 tutte le volte necessarie fino a quando il bordo della spalla della sonda non è perfettamente allineato con l'asse X dello stage (il bordo rimane al centro della FIB mentre si sposta a sinistra).
  19. Utilizzando la FIB, spostare lo stage di nuovo sulla spalla inferiore della sonda. Salvare la posizione dello stage nell'elenco delle posizioni facendo clic sul pulsante Aggiungi. Modificare la corrente del fascio FIB a 2,5 nA e assicurarsi che l'ingrandimento della FIB sia ancora 5000x. Eseguire la funzione di contrasto della luminosità automatica e impostare il tempo di dimora FIB a 100 ns.
  20. Premere il pulsante di pausa per avviare la scansione. Regolare la messa a fuoco FIB e l'astigmatismo, nel modo più rapido e preciso possibile, utilizzando le manopole di messa a fuoco grossolana e fine e le manopole dello stigmatore X e Y sul pannello MUI. Premere il pulsante di pausa per interrompere la scansione FIB.

3. Scrittura di un processo automatizzato per l'incisione

  1. Avviare il software individuandolo nel menu di avvio di Windows (ad esempio, Start , Programmi , FEI Company , Applicazioni , Nanobuilder ). Posizionare la finestra del software sul monitor laterale in modo che l'interfaccia utente non sia coperta. Aprire il file per la modellazione delle sonde di silicio facendo clic sul file e quindi aprire. Indirizzare il browser di Windows al percorso dello script software (Supplementary File 1 - il nome del file è "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.jbj").
  2. All'interno del software, selezionare il menu a discesa del microscopio e selezionare Imposta origine fase. All'interno del software, selezionare il menu a discesa del microscopio, quindi selezionare Calibrate Detectors.
  3. Nell'interfaccia utente del microscopio, fare clic su Quad 1 una volta con il mouse per selezionare Quad 1. Ignorare le altre istruzioni visualizzate nella finestra popup, non sono necessarie per questo progetto. Fare clic su OK per avviare la calibrazione. Il processo richiederà circa 5 min. Assicurarsi che i rilevatori ETD e ICE si calibrano. E 'ok se qualsiasi altro rilevatore hanno guasti di calibrazione.
  4. All'interno del software, selezionare il menu a discesa del microscopio e scegliere Esegui per avviare la sequenza di patterning. Quando il modello è completo, chiudere il software.
    NOTA: Il software assumerà il quad 3 e 4 per le funzioni di modellazione e allineamento. L'esecuzione dello script richiederà circa 12 h. Durante l'esecuzione dello script, non modificare alcun parametro nel microscopio.
  5. Premere "Vent" nella scheda di controllo del fascio dell'interfaccia utente al microscopio per spegnere i fasci del microscopio e avviare il ciclo di ventilazione. Mentre la camera si sta sfogando, spostare lo stage in modo che si disperda su X , 70 mm, Y, 70 mm, 0 mm, T, R e 0 . Una volta che la camera è ventilata, mettere su guanti nitrile puliti e tirare aprire la porta della camera.
  6. Allentare la vite impostata sull'adattatore stub utilizzando la chiave inglese da 1,5 mm. Rimuovere lo stub di alluminio contenente la sonda modellata dalla camera. Chiudere con attenzione la porta della camera del microscopio. Guarda l'immagine della telecamera CCD in Quadrant 4 mentre chiudi la porta. Assicurarsi che l'adattatore per palco sia a una distanza di sicurezza da qualsiasi componente critico nella camera del microscopio.
  7. Selezionare la freccia verso il basso accanto al pulsante Pompa nella scheda controllo trave. Assicurarsi che la porta sia sigillata spingendo delicatamente sulla faccia della porta mentre la pompa è in funzione.
    NOTA: Un sigillo sottovuoto può essere confermato tirando delicatamente sulla porta della camera, che dovrebbe rimanere chiusa se il sistema è sottovuoto. Il tempo di pompaggio sarà di circa 5 min. Solo un lato della sonda può essere inciso durante una singola corsa.
  8. Se il lato anteriore e posteriore della sonda richiede l'incisione, rimuovere con attenzione la striscia incisa delle sonde di silicio dopo aver controllato l'incisione finale e aver creato l'immagine del lato anteriore (se sono necessarie immagini). Sciogliere la vernice d'argento con acetone, tamponando con cautela / spazzolando l'acetone sulla vernice d'argento. Ruotare con attenzione la striscia sul retro, montare nuovamente, allineare e incidere seguendo i passaggi descritti in precedenza.

4. Controllo dell'incisione finale e dell'imaging

  1. Una volta completata la fresatura, verificare l'uniformità delle diverse sezioni utilizzando l'imaging SEM con un ingrandimento più elevato.
    NOTA: l'imaging con l'angolo inclinato consente una migliore valutazione della variazione della profondità di fresatura. Occorre prestare particolare attenzione alle regioni di transizione tra le posizioni di fresatura.
  2. Riimmaginiare i campioni dopo la fresatura con un microscopio ottico.
    NOTA: Le linee fresate periodiche generano un effetto di rifrazione che dà origine a colori diversi in funzione dell'angolo di imaging. Se il colore non è continuo insieme alla sonda che è una chiara indicazione della rottura nelle linee fresate.

5. Montaggio di una sonda di silicone funzionale per l'incisione FIB

  1. Rimuovere delicatamente l'elettrodo di silicio funzionale dalla sua confezione. Utilizzare pinze per sollevare con attenzione la linguetta protettiva in plastica che copre lo stadio della testa. Iniziare a sollevare un angolo della linguetta verso l'alto dalla colla appiccicosa tenendola in posizione e continuare a sollevare fino a quando l'intero elettrodo viene rimosso.
  2. Bloccare con attenzione l'elettrodo con gli emostati per prepararsi al montaggio nel telaio stereotassico. Tenendo la linguetta coperta con le pinze, posizionare delicatamente gli emostati curvi intorno all'albero verde sopra il gambo di silicio, con la parte curva degli emostat rivolti verso l'alto verso l'alto verso la linguetta. gli emostati.
  3. Rimuovere delicatamente la linguetta protettiva in plastica che copre lo stadio della testa. Mentre si tiene l'elettrodo con gli emostati, tagliare con attenzione l'elettrodo nel telaio stereotassico per la pulizia.
  4. Riempire 3 piatti Petri con 95% di etanolo (10 mL per piatto petri). Posizionare la parabola Petri sotto l'elettrodo che è montato nel telaio stereotassico per la pulizia. Abbassare lentamente l'elettrodo ruotando il micromanipolatore verso il basso (100 m/s) in modo che il gambo sia immerso nel 95% di etanolo.
    NOTA: Fare attenzione a non girare il micromanipolatore troppo veloce o troppo profondo, questo può causare la rottura dell'elettrodo (cioè, l'elettrodo non deve toccare la parabola Petri).
  5. Lasciare il gambo dell'elettrodo nel 95% di etanolo per 5 min, quindi sollevare lentamente l'elettrodo dal 95% di etanolo ruotando il micromanipolo verso l'alto (100 m/s). Ripetere questo passaggio altre due volte, per un totale di tre lavamenti. Lasciare asciugare all'aria l'elettrodo per cinque minuti.
  6. Utilizzare la stessa tecnica per montare l'elettrodo nel telaio stereotassico, per rimuovere l'elettrodo dal telaio stereotassico. Posizionare con attenzione gli emostati intorno all'albero dell'elettrodo. Una volta che gli emostati sono stretti, rilasciare l'elettrodo dal telaio stereotassico, restituire la linguetta protettiva in plastica che copre lo stadio della testa e rimettere l'elettrodo pulito nella sua confezione.

6. Incisione funzionale sonda in silicone utilizzando FIB

  1. Montare l'elettrodo funzionale in silicio pulito su un supporto in alluminio. Sollevare con attenzione l'elettrodo di silicio funzionale pulito con pinze e rimuovere la linguetta protettiva dal headstage. Posizionare il gambo dell'elettrodo sullo stub di alluminio in modo che non penda su alcun bordo, quindi utilizzando un piccolo pezzo di Cu o nastro conduttivo in carbonio, pin il headstage in modo sicuro allo stub di alluminio.
    NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un supporto clip a basso profilo per tenere premuto l'elettrodo. Fare attenzione a non toccare il gambo dell'elettrodo.
  2. Seguendo i passaggi descritti sopra (Sezione 2), posizionare l'elettrodo all'altezza eucentrica e assicurarsi che l'elettrodo si trova nel punto di coincidenza dei fasci SEM e FIB. Allineare il gambo con la direzione "X" dello stage.
  3. Impostare la FIB sulla corrente ottimale per la fresatura della nano-architettura richiesta e assicurarsi che la messa a fuoco e la stigmatizzazione siano corrette correttamente. Preparare una serie di linee con la spaziatura e la lunghezza desiderate per coprire il campo visivo del gambo (500 sezioni m). Regolare le lunghezze delle linee quando l'incisione scende lungo il gambo fino alle sezioni più sottili.
    NOTA: quando si estrae l'elettrodo funzionale, non è possibile aggiungere marchi fiduciari per automatizzare il processo. Di conseguenza, lo spostamento tra le sottosezioni (500 m) viene eseguito manualmente.
  4. Una volta completata la fresatura della prima sezione, assicurarsi di controllare la qualità di fresatura prima di passare alla sezione successiva. Ripetere il passaggio 6.3 per inserire la sezione successiva del gambo. Allineare le linee fresate della sezione precedente alle ripetizioni utilizzate per la sezione successiva per evitare grandi spazi tra le rampe.

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Risultati

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FIB Inciso Nano-architettura sulle superfici di sonde intracorticali singolo Shank
Utilizzando i metodi descritti qui, le sonde intracorticali sono state incise con nano-architetture specifiche seguendo protocolli stabiliti39. Le dimensioni e la forma del progetto nano-architettura descritto in questi metodi sono state implementate dai precedenti risultati in vitro che illustrano una diminuzione della reattività delle cellule gliali quando coltivate con il progetto nano-archite...

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Discussione

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Il protocollo di fabbricazione qui descritto utilizza la litografia focalizzata del fascio ionico per eguagliare in modo efficace e riproducibile nano-architetture nella superficie di microelettrodi in silicio a gambo singolo non funzionale e funzionale. La litografia del fascio ionico focalizzato (FIB) consente l'ablazione selettiva della superficie del substrato utilizzando un fascio ionico a fuoco fine50,51. FIB è una tecnica di scrittura diretta che può produ...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto dal Dipartimento dei Veterani per la Ricerca e lo Sviluppo del Dipartimento degli Affari Veterani: #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) e #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). I contenuti non rappresentano le opinioni del Dipartimento degli Affari Veterani degli Stati Uniti o del Governo degli Stati Uniti. Gli autori desiderano ringraziare FEI Co. (Ora parte di Thermofisher Scientific) per l'assistenza del personale e l'uso della strumentazione, che ha aiutato a sviluppare gli script utilizzati in questa ricerca.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Headstage ZIF-Clip a 16 canaliTucker Davis TechnologiesZC16Potrebbe essere necessario sostituire l'headstage e il supporto dell'headstage, a seconda dell'elettrodo utilizzato. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
1 metro di cavo, TUTTO avvolto a mollaThomas Scientific1213F04Qualsiasi capsula di Petri non trattata sarà sufficiente. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture
32-Channel ZIF-Clip Headstage Holder TuckerDavis TechnologiesZ-ROD32Potrebbe essere necessario sostituire l'headstage e il supporto dell'headstage, a seconda dell'elettrodo utilizzato. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
Acetone, Diluente/Estensore/Detergente, 30mlTed Pella16023https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
Baby-Mixter HemostatFine Science Tools13013-14Qualsiasi emostatico curvo sarà sufficiente. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat
Nastro conduttivo in carbonio, doppio rivestimentoTed Pella16084-7Il protocollo suggeriva tre opzioni per il montaggio dell'elettrodo funzionale sul tronchetto di alluminio (nastro conduttivo in rame o carbonio o una clip a basso profilo). Nel nostro studio abbiamo utilizzato il nastro conduttivo in carbonio. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm
Corning Costar Piastre a Pozzetti Multipli Non Trattate - 6 pozzettiSigma AldrichCLS3736-100EAQualsiasi piastra a 6 pozzetti non trattata sarà sufficiente. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/
Dumont #5 Fine ForcepsFine Science Tools11251-30O questa pinza fine o la pompa a vuoto saranno sufficienti. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/ Dumont-5-Forceps/11251-30
Etanolo, 190 proof (95%), USP, Decon LabsFisher Scientific22-032-600Qualsiasi etanolo al 95% sarà sufficiente. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600
Filtrocellulare FalconFisher Scientific08-771-1https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
FEI, Tescan, Zeiss (anche per Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), alluminio, bordo scanalato, Ø 32mmTed Pella16148A seconda della macchina SEM utilizzata, potrebbe essere necessario un mozzicone di dimensioni diverse. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180
Fisherbrand Foglio di alluminio, rotolo a scartamento standardFisher Scientific01-213-101Qualsiasi foglio di alluminio sarà sufficiente. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250
Fisherbrand Piastre di Evaporazione in PTFE Bassa e AltaScientific02-617-149Qualsiasi piastra in teflon sarà sufficiente, questa viene utilizzata per asciugare le sonde dopo il lavaggio su una superficie su cui non si attaccheranno. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552
Elettrodo funzionale in silicone stile MichiganNeuroNexusA1x16-3mm-100-177http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/
Modello 1772 Supporto universaleKOPFModello 1772Altri telai stereotassici e accessori saranno sufficienti. http://kopfinstruments.com/ prodotto/modello-1772-holder-universale/
Modello 900-U Strumento stereotassico per piccoli animaliKOPFModello 900-UAltri telai stereotassici e accessori saranno sufficienti. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/
Modello 960 Manipolatore di elettrodi con gruppo slitta APKOPFModello 960Altri telai stereotassici e accessori saranno sufficienti. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250')Ted Pella807-5https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm
PELCO Vacuum Pick-Up System, 220VTed Pella520-1-220Sia questa pompa a vuoto che le pinze fini saranno sufficienti. http:// www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520
PELCO Vernice Conduttiva ArgentoTed Pella16062https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
SEM FIB FEI Helios 650 NanolabThermo Fisher ScientificHelios G2 650Questo è il fascio ionico focalizzato specifico e il microscopio elettronico a scansione utilizzati nel protocollo. Il software Nanobuilder è ciò di cui viene fornito. Se viene utilizzato uno strumento FIB diverso, potrebbe non essere completamente compatibile con il protocollo, in particolare con i passaggi che richiedono il software Nanobuilder. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/
Fisher

Riferimenti

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