Test diagnostico immunocromatico rapido sulla rabbia sul campo per impostazioni limitate alle risorse con ulteriori applicazioni molecolari

Sommario

Presentiamo un protocollo completo per la diagnosi post-mortem della rabbia animale in condizioni di campo utilizzando un rapido test diagnostico immunocromatico (RIDT), dal campionamento della biopsia cerebrale all'interpretazione finale. Descriviamo anche ulteriori applicazioni utilizzando il dispositivo per l'analisi molecolare e la genotipizzazione virale.

Abstract

I sistemi funzionali di sorveglianza della rabbia sono fondamentali per fornire dati affidabili e aumentare l'impegno politico necessario per il controllo delle malattie. Ad oggi, gli animali sospettati come rabbia positivi devono essere sottoposti a una conferma post-mortem utilizzando metodi di laboratorio classici o molecolari. Tuttavia, la maggior parte delle aree endemiche si trovano in paesi a basso e medio reddito, dove la diagnosi della rabbia animale è limitata ai laboratori veterinari centrali. La scarsa disponibilità di infrastrutture di sorveglianza porta a una grave sottosegnalazione delle malattie provenienti da aree remote. Recentemente sono stati sviluppati diversi protocolli diagnostici che richiedono una scarsa competenza tecnica, offrendo l'opportunità di stabilire la diagnosi della rabbia nei laboratori decentralizzati. Vi presentiamo qui un protocollo completo per la diagnosi postmortem sul campo della rabbia animale utilizzando un rapido test diagnostico immunocromatico (RIDT), dal campionamento della biopsia cerebrale all'interpretazione finale. Completiamo il protocollo descrivendo un ulteriore uso del dispositivo per l'analisi molecolare e la genotipizzazione virale. RIDT rileva facilmente il virus della rabbia e altri lyssavirus nei campioni di cervello. Il principio di tali test è semplice: il materiale cerebrale viene applicato su una striscia di prova dove gli anticorpi coniugati in oro si legano specificamente agli antigeni della rabbia. I complessi antigene-anticorpo si legano ulteriormente agli anticorpi fissi sulla linea di prova, dando vita a una linea viola chiaramente visibile. Il virus viene inattivato nella striscia di prova, ma l'RNA virale può essere successivamente estratto. Questo permette alla striscia di prova, piuttosto che al campione cerebrale infettivo, di essere inviata in modo sicuro e facile a un laboratorio attrezzato per la conferma e la tipizzazione molecolare. Sulla base di una modifica del protocollo del produttore, abbiamo riscontrato una maggiore sensibilità al test, raggiungendo il 98% rispetto al metodo di riferimento gold standard, il test anticorpale di immunofluorescenza diretta. I vantaggi del test sono numerosi: rapida, facile da usare, a basso costo e nessunrequisi per l'infrastruttura di laboratorio, come la microscopia o la conformità alla catena del freddo. I RID rappresentano un'alternativa utile per le aree in cui i metodi di diagnostica di riferimento non sono disponibili.

Introduzione

La rabbia canina è la principale causa della rabbia umana, globalmente responsabile di circa 59.000 morti umane all'anno, quasi tutte nei paesi a basso e medio reddito (LMIC) in Asia e Africa¹. Il principale agente eziologico è un virus della rabbia classica associato ai canini neurotropici (RABV, famiglia Rhabdoviridae, genere Lyssavirus, specie Rabies lyssavirus). Tuttavia, altri lissavirus legati alla rabbia, per lo più circolanti nelle specie di pipistrelli, causano anche la malattia^2,3. Nelle regioni colpite, la sorveglianza e il controllo delle malattie sono spesso ostacolati da un impegno politico di basso livello probabilmente a causa della mancanza di dati affidabili^4,5,6. Uno dei motivi della sottosegnalazione delle malattie è l'assenza di diagnosi di laboratorio, dovuta in parte al limitato accesso ai laboratori attrezzati e al personale addestrato, nonché alle difficoltà di spedizione degli esemplari. La diagnosi di laboratorio è necessaria per confermare i casi di rabbia e consente inoltre la caratterizzazione genetica dei ceppi coinvolti, fornendo informazioni sulla trasmissione del virus a livello regionale^4,5,7.

Gli attuali standard dell'oro per la diagnosi della rabbia postmortem, approvati sia dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) che dall'Organizzazione Mondiale per la Salute Animale (OIE), sono il test anticorpo fluorescente diretto (DFAT), il test di immunoistochimica rapida diretta (DRIT) e metodi molecolari (ad esempio, la reazione della catena di polimerasi di trascrizione inversa (RT-PCR))^4,8. Tuttavia, una corretta applicazione nei LMIC rimane limitata a causa di strutture di laboratorio inadeguate con alimentazione incoerente, trasporto di campioni non raffreddati e mancanza di un sistema di gestione della qualità. Poiché la diagnosi di rabbia animale viene in genere condotta solo presso i laboratori veterinari centrali dei LMIC, i dati di sorveglianza esistenti riflettono principalmente la situazione della rabbia nelle aree urbane.

Le alternative diagnostiche a bassa tecnologia sviluppate di recente offrono l'opportunità di stabilire la diagnosi della rabbia in aree remote e laboratori di rabbia decentralizzati^4,8,9. Il test diagnostico immunocromatico rapido (RIDT) è un test di flusso laterale basato sull'immunocromatografia che utilizza anticorpi rivelatori coniugati in oro ed è uno strumento diagnostico della rabbia molto promettente^10,11,12,13. Il principio è semplice: dopo la diluizione, il materiale cerebrale viene miscelato nel buffer fornito e alcune gocce vengono applicate sulla striscia di prova dove gli anticorpi monoclonali coniugati in oro si legano specificamente agli antigeni della rabbia, principalmente alle nucleoproteine (Figura 1). I complessi antigene-anticorpo vengono quindi sottoposti a migrazione del flusso laterale, legandosi alla linea di prova (linea T) agli anticorpi fissi contro gli antigeni della rabbia, con conseguente linea viola chiaramente visibile. Gli anticorpi coniugati in oro rimanenti non legati agli antigeni della rabbia continuano a migrare e a fissarsi alla membrana attraverso anticorpi di puntamento aggiuntivi, dando luogo a una linea di controllo viola chiaramente visibile (linea C).

Il metodo a basso costo in un solo passaggio è rapido, estremamente facile e non richiede attrezzature costose o condizioni di stoccaggio speciali. Con la modifica del protocollo del produttore per eliminare la fase di diluizione, quasi tutte le attrezzature e i reagenti necessari per eseguire il test sono inclusi nel kit¹⁴. Il risultato viene letto dopo 5-10 minuti senza un microscopio. Questo è un grande vantaggio rispetto al test DFAT, che richiede un microscopio a fluorescenza e un coniugato di immunofluorescenza, insieme al trasporto refrigerato e all'immagazzinamento dei campioni. Anche il test DRIT, che può essere eseguito al microscopio luminoso, richiede una catena del freddo continua per memorizzare gli anticorpi anti-rabbia, che non sono ancora disponibili in commercio. Rispetto al DRIT, il RIDT non richiede sostanze chimiche tossiche, un particolare vantaggio nei paesi in cui lo smaltimento dei rifiuti è scarsamente regolamentato. Il test rapido è meno dispendioso in termini di tempo con un'interpretazione molto più semplice rispetto ai test gold standard DFAT e DRIT. Ciò consente test in loco da parte di personale con competenze tecniche limitate.

Sulla base di queste proprietà di test, diventa fattibile una diagnosi tempestiva di animali sospetti in aree remote, facilitando l'implementazione della profilassi post-esposizione (PEP) per le persone esposte il più presto possibile. Inoltre, il trasporto a distanza di campioni di rabbia non è necessario, con conseguente migliore qualità del campione al momento del test. Tuttavia, i risultati ottenuti con i test RIDT devono attualmente essere confermati utilizzando un test diagnostico di riferimento, ad esempio DFAT o DRIT.

Sono state valutate le tecniche RIDT per il rilevamento di RABV e altri lyssavirus. Uno dei primi studi è stato condotto da ricercatori coreani nel 2007¹⁰. Rispetto al metodo DFAT, in 51 campioni di animali e 4 isolati RABV, il RIDT ha mostrato una sensibilità e una specificità del 91,7% e 100%, rispettivamente. Questi risultati sono stati successivamente confermati con 110 campioni di cervelli animali provenienti dalla Corea, con sensibilità e specificità, rispetto al DFAT, del 95% e del 98,9%, rispettivamente¹⁵. Più recentemente, altri studi hanno valutato le prestazioni di questo RIDT utilizzando isolati di virus e/o campioni di cervelli infetti da vari animali con diverse origini geografiche. Un pannello di 21 campioni, tra cui RABV africano e altri lyssavirus africani (virus Duvenhage (DUVV), Virus bat Di Lagos (LBV) e virus Mokola (MOKV)), sono stati rilevati con successo, con sensibilità del 100% rispetto al DFAT¹⁶. Sensibilità elevata simile (96,5%) e specificità (100%) valori sono stati ottenuti da un pannello di 115 campioni di cervello da Etiopia¹⁷. Un altro studio ha valutato gli isolati europei del RABV, altri due lissavirus europei (il bat lyssavirus europeo tipo 1 (EBLV-1) e il tipo 2 (EBLV-2)) e il bat lissavirus australiano (ABLV)¹⁸. Sulla base dell'analisi di 172 campioni di cervelli animali, il kit RIDT aveva una sensibilità all'88,3% e al 100% di specificità rispetto al DFAT, e i tre lissavirus correlati alla rabbia sono stati rilevati con successo. In questo studio, alcuni dei falsi risultati negativi provenivano da campioni di cervello conservati nel tampone di glicerolo, suggerendo che la rimozione impropria del glicerolo ha influenzato il flusso capillare o il legame degli anticorpi. Una recente analisi di 43 campioni clinici da pipistrelli australiani ha confermato i risultati dei test precedenti, con completa concordanza a DFAT¹⁹. Due studi sono stati condotti in India utilizzando il RIDT su un numero limitato di campioni clinici (11 e 34 campioni). Rispetto a DFAT, la sensibilità è stata tra l'85,7% e il 91,7% e la specificità del 100%^20,,21. Un'altra valutazione di questo kit utilizzando 80 campioni di cervelli animali provenienti da Africa, Europa e Medio Oriente ha ottenuto una concordanza completa con DFAT per specificità (100%) ma una sensibilità più alta (96,9%) rispetto agli studi precedenti²². In un recente confronto inter-laboratorio di questo RIDT eseguito in 22 diversi laboratori utilizzando un pannello di 10 campioni, la concordanza complessiva era 99.5%²³.

Solo un recente studio multicentrico ha mostrato prestazioni complessive RIDT insoddisfacenti²⁴. Sono stati testati campioni di tre diversi set di dati e sono stati forniti valori di sensibilità e specificità delle variabili rispetto a DFAT. Ad esempio, la sensibilità e la specificità ottenute con il primo pannello (n. 51) e il secondo pannello (n.31) di campioni di animali infetti sperimentali, tutti testati in laboratorio A, hanno dato una sensibilità rispettivamente del 16% e del 43%, mentre la specificità era del 100% per entrambi. Al contrario, i risultati del terzo pannello (n.30) di campioni clinici sul campo analizzati dal laboratorio B hanno fornito una concordanza completa con i risultati di DFAT, che è stata ulteriormente completamente confermata dal laboratorio A (85% di sensibilità e specificità al 100%). La variazione batch-to-batch è stata suggerita come possibile spiegazione per la sensibilità fluttuante relativamente bassa con RIDT²⁴.

Allo stesso tempo, un altro studio ha eseguito un processo di convalida simile del RIDT sopra descritto, con una modifica del protocollo consigliato dal produttore¹⁴. La fase di pre-diluizione (1:10) in PBS è stata omessa durante la preparazione del materiale cerebrale. Sulla base di questo protocollo più semplice modificato, gli autori hanno ottenuto sensibilità e specificità rispettivamente del 95,3% e del 93,3% rispetto al DFAT testando, in condizioni di laboratorio, un set di dati di 73 campioni di cervelli animali, naturalmente o sperimentalmente infettati da vari ceppi RABV. Lo studio ha presentato la prima valutazione di questo RIDT in un ambiente di campo (Chad, Africa). In 48 campioni clinici di cervello, sensibilità e specificità erano 94.4% e 100%, rispettivamente. Le discrepanze tra DFAT e RIDT erano dovute a risultati falsi positivi con DFAT, determinato dopo la conferma con RT-PCR. Quando questi risultati sono stati eliminati, c'era completa concordanza, e ha dimostrato che il RIDT era più affidabile che DFAT in questi condizioni di campo¹⁴. Non è stata osservata alcuna variazione batch-batch utilizzando il protocollo modificato. Quando il protocollo modificato è stato applicato a un piccolo numero di campioni divergenti DFAT/ RIDT (n.8) nello studio di Eggerbauer et al.²⁴, tutti sono stati trovati concordant (100% sensibilità).

Un altro grande vantaggio del RIDT è l'uso secondario per rilevare l'RNA virale fissato sulla striscia utilizzando tecniche molecolari (come RT-PCR) e la successiva genotipizzazione^14,24. Dopo una fase di estrazione, Léchenne et al.¹⁴ ha dimostrato l'RNA virale fissato sulla membrana del dispositivo Anigen usando RT-PCR con sensibilità dell'86,3% in un pannello di 51 campioni (compresi 18 campioni testati e spediti dal Ciad a temperatura ambiente). La genotipizzazione successiva è stata possibile nel 93% dei 14 campioni testati. È stato utilizzato il sequenziamento di amplificatori PCR di almeno 500 nucleotidi di lunghezza. Oltre agli isolati di RABV, il test ha rilevato altre quattro specie di lyssavirus, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 e Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), durante un test inter laboratorio internazionale completamente concordante¹⁴. La sensibilità del rilevamento dell'RNA virale era ancora più elevata (100%) nello studio di Eggerbauer et al., sulla base di esame di campioni di laboratorio²⁴. Quest'ultimo studio ha anche dimostrato che il buffer utilizzato nel kit RIDT inattivato virus. In questo modo, i dispositivi possono essere spediti facilmente, a temperatura ambiente senza specifiche precauzioni di biosicurezza per fare riferimento ai laboratori, per la conferma molecolare e la genotipizzazione.

In base alle valutazioni precedenti, gli strumenti RIDT offrono numerosi vantaggi per l'utilizzo nelle impostazioni dei campi, soprattutto quando le tecniche di diagnostica di riferimento non sono disponibili. Tuttavia, questo test ha anche alcune limitazioni, in particolare, bassa sensibilità del rilevamento dell'antigene^14,24. Il test è applicabile a campioni contenenti elevate quantità di antigeni virali, come campioni cerebrali. Tuttavia, non è appropriato per altri campioni come la saliva o altri fluidi corporei. Un altro inconveniente è il costo del dispositivo (circa 5-10 euro in Europa), che è meno costoso rispetto al costo di esecuzione DFAT, RT-PCR o DRIT, ma che rimane ancora elevato per i LMIC. Tuttavia, lo sviluppo futuro e la convalida di RID simili da altre aziende potrebbero portare a una diminuzione dei prezzi. Uno studio ha segnalato variazioni batch-to-batch. Anche se non segnalati da altri, durante il test di un nuovo batch devono comunque essere eseguiti controlli di qualità rigorosi, come per qualsiasi reagente utilizzato in un ambiente di gestione della qualità. L'utilizzo del protocollo modificato non è stato modificato quando si utilizzano batch diversi¹⁴. Tutti tranne uno studio hanno dimostrato che la sensibilità del RDIT era elevata rispetto al DFAT (circa il 90%-95%). Poiché la rabbia è sempre fatale, si consiglia comunque di confermare eventuali risultati negativi con RDIT utilizzando un test diagnostico di riferimento come DFAT, DRIT o RT-PCR¹⁴.

In questo manoscritto, presentiamo un protocollo completo per la diagnosi postmortem sul campo della rabbia animale basato su un esempio di RIDT commercializzato, dalla raccolta di campioni cerebrali all'applicazione di un protocollo modificato rispetto alle raccomandazioni del produttore (che sono state precedentemente convalidate¹⁴⁾e successive analisi molecolari. Questo protocollo è stato applicato e convalidato molte volte in condizioni di campo in Africa occidentale e centrale, dove il RIDT è stato utilizzato regolarmente per la diagnosi di rabbia insieme al test DFAT. Dimostriamo inoltre una seconda applicazione per il dispositivo, in ambienti di laboratorio, per l'estrazione e il rilevamento utilizzando RT-PCR di RNA virale fissato sul dispositivo.

Protocollo

1. Raccolta di campioni tramite il foramen magnum (percorso occipitale)²⁵

NOTA: questa tecnica può essere implementata in condizioni di laboratorio o in impostazioni di campo. I campioni devono essere trattati il prima possibile dopo la morte del sospetto animale o conservati a temperatura fredda (refrigerati o congelati, se possibile) per evitare la decomposizione che potrebbe influenzare i risultati. Simile ad altre tecniche di riferimento basate sul rilevamento di antigeni lyssavirus come DFAT e DRIT, i campioni decomposti non devono essere testati perché possono influenzare il risultato (rischio di risultato falso negativo).

AVVISO: Tutti i campioni devono essere considerati potenzialmente infettivi. Le norme e le procedure di sicurezza devono essere rigorosamente seguite, anche nelle impostazioni del campo⁴. In particolare, indossare adeguate attrezzature protettive personali tra cui maschera, occhiali, guanti e un camice da laboratorio. Utilizzare un disinfettante appropriato per le decontaminazioni di materiale e campioni (ad esempio, ipoclorito di sodio con diluizioni raccomandate dal produttore, 70% di alcol - etanolo o isopropanolo, 1% soluzione di sapone). Tutti i campioni di trattamento del personale devono essere vaccinati contro la rabbia.

1. Rimuovere la testa animale con un coltello prima della prima vertebra cervicale (vertebra atlante) per accedere al forame magnum.
   NOTA: Per ridurre al minimo l'aerosol infettivo, evitare di utilizzare una sega manuale o uno strumento simile.
2. Raccogliere il campione di tronco encefalico (medulla oblongata) utilizzando una pipetta di plastica usa e getta (Figura 2A), una cannuccia da bere ( Figura2B), un morsetto ( Figura2C) o un contagocce (fornito con il RIDT) ( Figura2D).
   NOTA: Particolare attenzione deve essere prestata quando si raccoglie il campione, perché è un passo più importante per l'affidabilità dei risultati. Oltre al video associato che mostra in modo semplice come raccogliere la parte del tronco encefalico di interesse, è altamente raccomandato un passaggio di formazione per assicurarsi di raccogliere la sezione anatomica corretta.
3. Facoltativamente e in aggiunta al tronco encefalico (medulla oblongata), raccogliere altre parti del tronco encefalico o del cervello (cervelletto, ippocampo, talamo e corteccia) con lo stesso percorso occipitale spingendo e ruotando la pipetta di plastica o paglia verso la presa oculare (Figura 3).
4. Se si utilizza una cannuccia o una pipetta, spremere delicatamente per depositare il campione di cervello (0,5-2 g) in un tubo per analisi successive e/o biobanking.
   NOTA: l'archiviazione di esempio in glicerolo non è consigliata, in quanto sembra influenzare il flusso capillare o il passaggio di rilegatura anticorpale del RIDT¹⁸.

2. Esecuzione del protocollo RIDT modificato¹⁴

NOTA: questa modifica omette una fase di diluizione (1:10) in PBS, come specificato nel protocollo del produttore (tutte le versioni) e può essere implementata nelle impostazioni di laboratorio o di campo.

1. Utilizzare il tampone/contagocce per raccogliere l'equivalente di mezza arachide o piselli (0,1-0,5 g) di materiale cerebrale e posizionarlo nel tubo campione tampone.
   NOTA: per il protocollo modificato, tutti i reagenti/consumabili sono inclusi nel kit (non è necessario alcun PBS o tubo aggiuntivo) (Figura 4). Documentare il numero batch del kit e verificare la validità della data di scadenza.
2. Schiacciare con cura il materiale cerebrale direttamente nel tubo con il tampone o il contagocce per circa 30 s fino a ottenere una sospensione omogenea.
   NOTA: La reazione tampone inattiva l'infettività del virus nelle condizioni del protocollo²⁴del produttore.
3. Utilizzando il contagocce, depositare quattro gocce (circa 100 ) della sospensione nell'inserimento del campione sul dispositivo di prova.
4. Attendere la migrazione completa del campione (1-5 min) prima di leggere il dispositivo di test. La migrazione dovrebbe iniziare rapidamente dopo il deposito del campione (1-5 min).
5. In caso di ritardo (a causa di sospensione ad alta viscosità) o per accelerare l'inizio della migrazione, graffiare delicatamente il fondo del sito di deposito del dispositivo con il contagocce (1-5 volte) e alla fine aggiungere 1-2 più gocce. La migrazione dovrebbe iniziare immediatamente dopo.
6. Leggere il risultato del test nella finestra di rilevamento dopo 5-10 min e non più di 20 min, dopo la fine della migrazione.
7. Interpretare il risultato in base alla presenza o all'assenza della linea di controllo (linea C) e della linea di prova (linea T) (linee viola) nella finestra di rilevamento, secondo la figura 5. Si consideri positivo di esempio quando due righe sono visibili (Figura 5A), negativo se è presente solo la linea C (Figura 5B) e non è valida se è presente solo la linea T o se non sono visibili righe (Figura 5C).
   NOTA: i risultati non validi devono essere ripetuti almeno una volta. Altre tecniche devono essere eseguite se i risultati rimangono non validi. I risultati negativi ottenuti con RIDT devono essere successivamente confermati utilizzando un metodo di riferimento standard d'oro, come DFAT, DRIT e metodi molecolari (reazione a catena polimerasi o PCR). Anche se la sensibilità di questo test è elevata (vedi risultati rappresentativi), non è al 100%.
8. Conservare i dispositivi usati a temperatura ambiente, o refrigerare/congelare quando possibile, per la successiva analisi molecolare (vedi sezione 4). Congelare il resto della sospensione del campione a -20 gradi centigradi nel tubo tampone per ripetere il test se necessario o per una successiva analisi molecolare.

3. Estrazione e rilevamento dell'RNA da parte di RT-qPCR dal dispositivo RIDT

NOTA: Questo passaggio può essere implementato solo in condizioni di laboratorio con ambiente adattato e attrezzature idonee per la diagnosi molecolare. Può essere fatto subito dopo il test RIDT o retrospettivamente su dispositivi RIDT archiviati, conservati a temperatura ambiente (15-30 c), refrigerati o congelati.

1. Estrazione dell'RNA
   NOTA: Per monitorare la fase di estrazione, si consiglia di utilizzare un controllo interno che può essere un mRNA endogeno (ad esempio , atta) o un controllo esogeno (come l'RNA sintetico eGFP) direttamente aspillito nel campione durante i primi passaggi dell'estrazione^26,27.
   1. Aprire con attenzione il dispositivo e rimuovere la carta da filtro.
   2. Tagliare l'area di deposito del campione e metterla in un tubo contenente 1 mL di Tri-Reagent LS. Incubare a RT per 1 ora con delicata agitazione manuale regolare.
   3. Eseguire l'estrazione in conformità con le raccomandazioni del produttore, come descritto in precedenza²⁷. In questa fase, è possibile aggiungere il controllo interno esogeno.
   4. Durante il processo, aggiungere 2 l di glicogeno per facilitare la precipitazione dell'RNA, secondo le raccomandazioni del produttore.
   5. Regolare il volume finale per la sospensione dell'RNA in acqua priva di nucleana, con un volume di 50 -L generalmente utilizzato.
      NOTA: Alla fine della fase di centrifugazione per la separazione di fase acquosa e organica (dopo l'aggiunta di 200 L di cloroformio nel Tri-Reagent LS), il pezzo di membrana del dispositivo sarà nella parte inferiore del tubo e non interferirà con la raccolta della fase acquosa superiore. In alternativa, altri protocolli facili e rapidi possono essere utilizzati, ad esempio, utilizzando reagenti a base di fenolo e membrane di silice²⁸.
2. Rilevamento da PARTE di RT-qPCR²⁶
   NOTA: il rilevamento di potenziali RNA virali presenti nei campioni estratti può essere effettuato utilizzando diverse tecniche molecolari, come la trascrizione inversa PCR, convenzionale (endpoint) o PCR in tempo reale (qPCR). Sono disponibili diversi metodi, come RT-PCR^27,29 o RT-qPCR^26,30 mirano alla nucleoproteina virale o al gene della polimerasi. Un esempio sarà presentato di seguito sulla base di un doppio pan-lyssavirus combinato RT-qPCR che mira a una regione conservata tra la polimerasi virale. Questa tecnica RT-qPCR associa due diversi RT-qPCR: uno basato sulla tecnologia sonda TaqMan (pan-RABV RT-qPCR) e l'altro utilizzando il rilevamento SyBR verde (pan-lyssa RT-qPCR). Inoltre, la rilevazione di un controllo interno esogeno (RNA eGFP) direttamente aspillito durante il processo di estrazione è effettuata da uno specifico RT-qPCR basato su sonda TaqMan (eGFP RT-qPCR). Un'attenta convalida in loco delle tecniche molecolari selezionate per il rilevamento dell'RNA virale è importante, in particolare, per verificare che i primer, e le sonde per RT-PCR in tempo reale, siano adattati per il rilevamento dei ceppi che circolano nella regione di interesse⁴.
   1. Diluire il campione di RNA a 1:10 in acqua priva di nuclesio. Testare ogni campione di RNA in duplicato, utilizzando una piastra di reazione di 96 pozzetto o altri formati. Utilizzare controlli positivi e negativi per ogni saggio e testare almeno in duplicato.
   2. Preparare la soluzione di reazione master mix per i tre diversi saggi RT-qPCR secondo la tabella 1e con i primer/probe indicati nella tabella 2.
   3. Aggiungete 5 -L di campioni di RNA diluito e 15 di mix master a ciascuno dei tre diversi saggi. Il saggio pan-RABV RT-qPCR e l'analisi rt-qPCR eGFP possono scorrere nella stessa piastra.
   4. Eseguire i diversi saggi seguendo le condizioni di ciclo termico indicate nella tabella 3. Se è disponibile un solo ciclore termico PCR, iniziare con il pan-RABV RT-qPCR e mantenere la piastra per il pan-lyssa RT-qPCR a 4 gradi centigradi fino alla fine del pan-RABV RT-qPCR.
   5. Analizzare i risultati ottenuti con i tre saggi secondo la tabella 4.

4. Genotipizzazione dopo l'estrazione dell'RNA dal dispositivo RIDT

1. Trascrizione inversa RT^27,29
   1. Preparare un mix master con 6 gradi di RNA, 2 litri di pd(N)6 primer casuali (200 g/l) e 2 l'acqua senza nuclesiera per un volume finale di 10 .L.
   2. Incubare a 65 gradi centigradi per 10 minuti in un blocco di calore e poi conservare sul ghiaccio.
   3. Preparare un master mix con 6 luna di 5 volte Buffer Primo-Strand, 2 -L di 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 L (200 U) di trascrizione inversa Superscript II, 2 L (80 U) di RNasin, 2 L di mix dNTP (10 M) e completo di acqua senza nucleamento per ottenere un volume finale di 20 gradi per ogni campione.
   4. Aggiungete il master mix (20 o L) al campione (10 o L) (volume finale di 30 gradi centigradi) e incubate a 42 gradi centigradi per 90 minuti in un blocco di calore.
   5. Procedere al passaggio successivo con l'amplificazione PCR o conservare il cDNA a -20 gradi centigradi.
2. PCR convenzionale^27,29,31
   NOTA: sono disponibili diverse tecniche di PCR convenzionali per la genotipizzazione. Due sono presentati, sia PCR emi-annifa, che prendono di mira una parte della nucleoproteina o una parte della proteina virale del lissavirus. Il protocollo è lo stesso per ciascuno di questi saggi, ad eccezione dei primer e delle condizioni di ciclismo. I controlli positivi (RNA positivo) e negativo (cDNA negativo e/o acqua priva di nuclesi) devono essere inclusi in ogni serie e in ogni ciclo di PCR.
   1. Preparare per ogni campione in un microtubo da 0,2 mL una soluzione di reazione master mix per il primo passo PCR. Questo mix contiene 5 di 10 volte NH4 Reaction Buffer, 2,5 -L di mgCl₂ soluzione (50 mM), 1 L di dNTP Mix (10 M), 1 l di ogni primer (10M), 0,2 L (1 U) di Biotaq DNA polymerase e 37,3 l di acqua priva di nuclenon (volume finale di 48L). I primer sono indicati nella tabella 5.
   2. Aggiungere 2 o L di cDNA in ogni tubo e pedalare su un ciclore termico PCR convenzionale separato per ogni analisi, secondo la tabella 6.
   3. Preparare una seconda soluzione di reazione master mix identica a quella precedente con l'utilizzo dei primer appropriati (Tabella 5) per la reazione PCR annidata.
   4. Aggiungere 2 l del primo prodotto PCR rotondo e il ciclo su un riciclatore termico PCR convenzionale utilizzando i parametri ciclici indicati nella tabella 6.
   5. Visualizza i diversi prodotti PCR (PCR al primo e secondo round) dopo averli caricati su un gel di agarose dell'1% (100 mL di buffer EDTA in acetato di Tris 1x - TAE 1x) con bromuro di etidio (concentrazione finale intorno allo 0,01%) e far funzionare il gel per 30 min a 120 V. Un risultato PCR positivo si osserva sotto forma di una banda luminosa delle dimensioni previste (Tabella 5).
3. Sequenziamento di Sanger
   1. Eseguire un sequenziamento Sanger degli amplificatori ottenuti con la PCR con anemi annidati pan-lyssavirus e completare l'analisi di genotipizzazione.

Risultati

Come con qualsiasi metodo di diagnostica, la raccolta di campioni è di fondamentale importanza per l'affidabilità dei risultati, soprattutto se eseguita nelle impostazioni del campo. Il processo di raccolta deve essere il più semplice possibile per garantire la raccolta di campioni di alta qualità. La raccolta di una biopsia cerebrale (tronco cerebrale con medulla oblongata) attraverso la via magnum foramen per la diagnosi postmortem della rabbia animale soddisfa questo requisito, come indicato nella Figura 2A-D²⁵.

Dopo la raccolta, l'esempio di cervello viene inviato al protocollo modificato del RIDT, riepilogato nella Figura 6. Come indicato nella sezione Protocollo, l'adattamento principale del protocollo fornito dal produttore è l'omissione della fase di diluizione in PBS, che semplifica la procedura e i materiali di consumo/reagenti necessari, quindi tutti inclusi nel kit (Figura 4).

Questo protocollo modificato è stato implementato e valutato in cinque diversi laboratori, tra cui un centro collaborativo dell'OMS sulla rabbia (Lab 1, Francia), un centro di riferimento FAO per la rabbia (Lab 5, Italia) e tre laboratori di riferimento situati nei paesi africani enzootici, Ciad (Lab 2), Costa d'Avorio (Lab 3) e Mali (Lab 4). In Ciad, una valutazione del RIDT è stata eseguita sia in laboratorio che in quelli di campo.

Rispetto alla tecnica di riferimento DFAT, la sensibilità e la specificità del RDIT erano alte per tutti i laboratori, con dal 96% al 100% e dal 93,7% al 100%, rispettivamente (tabella 7). La sensibilità e la specificità più basse del RDIT sono state ottenute per il Lab 1 (Francia) durante la fase di convalida del laboratorio. In base al numero cumulativo di campioni testati (n.162) (tabella supplementari 1), la sensibilità e la specificità complessive rispetto al DFAT erano rispettivamente del 98,2% e del 95,8%(tabella 7). Tuttavia, questi risultati preliminari ma promettenti sono stati ottenuti su un set di dati di campione limitato e devono essere ulteriormente confermati su un gran numero di campioni positivi e negativi, in particolare per quelli testati in aree enzootiche, per evitare potenziali sottostima o distorsione a causa degli attuali set di dati eterogeno.

Il test RIDT è adatto per rilevare il virus lyssavirus nelle biopsie cerebrali da animali infetti, dove il livello di antigeni lissavirus è importante. Tuttavia, il limite di prova del rilevamento rimane elevato quando si testa la sospensione dei virus titolati(tabella 8; Figura 7).

La tabella 9 (da Léchenne 2016¹⁴) mostra un esempio di risultati ottenuti dopo il rilevamento dell'RNA dal doppio pan-lyssavirus combinato RT-qPCR che prendono di mira la polimerasi virale del lissavirus. È stato testato un pannello di 51 test RIDT positivi eseguiti in condizioni di laboratorio (Laboratorio 1, n. 32) o in Chad (Laboratorio 2, n.19) e poi spedito a temperatura ambiente al Laboratorio 1. Per 18 (94,7%), 26 (81,2%) si è ottenuta una rilevazione positiva e 44 (86,3%) campioni dal Laboratorio 1, dal Laboratorio 2 e dai due messi insieme, rispettivamente. Inoltre, la genotipizzazione è stata eseguita per 14 di questi campioni (10 del Lab 1 e 4 del Lab 2) utilizzando la PCR annidata e di fatto mira reagere il gene nucleoproteina parziale e ha avuto successo per 13 di essi (93%) (da Léchenne et al. 2016¹⁴).

Figura 1: Rappresentazione schematica della struttura di un RIDT per la diagnosi della rabbia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempi di tecniche semplici e rapide per la raccolta di campioni di cervello (tronco cerebrale con medulla oblongata) negli animali (cane mostrato qui) tramite il forame occipitale in impostazioni di campo (Mali). (A) Collezione con pipetta di plastica usa e getta (B) Collezione con una raccolta di plastica da bere (C) con un morsetto (D) Collezione con il contagocce di smaltimento fornito nel kit RIDT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Sezione anatomica longitudinale della testa di cane, che mostra le diverse parti del cervello (tronco cerebrale, cervelletto, ippocampo, talamo e corteccia) raccolti quando si spinge, in un movimento rotatorio, una pipetta di plastica usa e getta attraverso il percorso dei forame occipitali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Descrizione del contenuto del kit RIDT, incluso il dispositivo, un contagocce di plastica usa e getta, un tampone usa e getta e il diluente di saggio. Il tubo in cui verrà raccolto e conservato il campione non è fornito. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Risultati rappresentativi per l'interpretazione dell'Anigen RIDT. (A) Risultati positivi (presenza visibile di due righe, C-line e T-line) (B) Risultati negativi (presenza visibile solo riga C) (C) Risultati non validi (assenza di linea C visibile). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Rappresentazione schematica del protocollo RIDT, adattata dalle istruzioni del produttore. (A) Versione modificata del protocollo, con la cancellazione della fase di diluizione raccomandata dal produttore (B) Protocollo iniziale raccomandato dal produttore, con una fase di diluizione precedente a 1:10 nella PBS dei campioni cerebrali. I passaggi eliminati nella versione modificata del protocollo (presentato nella Figura 6A) sono indicati con una linea rossa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Esempio di determinazione del limite di rilevamento di RIDT¹⁴. È stata utilizzata una diluizione seriale 10:1 di un virus della rabbia titolato del ceppo 9704ARG. La quantità di virus depositato su ciascun dispositivo è indicata in FFU (unità di messa a fuoco fluorescenti). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Saggio Pan-RABV RT-qPCR
Reagente	L/Reazione
2X Reaction Mix (un buffer contenente 0,4 mM di ogni dNTP e 6 mM MgSO4)	10
Acqua senza nuclea	1.5
Taq3long (Avanti) [10 M]	1
Taq17revlong (Inverti) [10 M]	1
RABV4 [10 m]	0.3
RABV5 [10 m]	0.3
MgSO4 [50 mM] (fornito nel kit)	0.25
Rox Dye di riferimento (25 M) (fornito nel kit)	0.05
RNasin (40U/EL) (Promega)	0.2
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	0.4
Totale per reazione	15
eGFP RT-qPCR saggio
Reagente	L/Reazione
2X Reaction Mix (un buffer contenente 0,4 mM di ogni dNTP e 6 mM MgSO4)	10
Acqua senza nuclea	2.8
EGFP1F (Avanti) [10 M]	0.5
EGFP2R (Inverti) [10 M]	0.5
Sonda eGFP [10 M]	0.3
MgSO4 [50 mM] (fornito nel kit)	0.25
Rox Dye di riferimento (25 M) (fornito nel kit)	0.05
RNasin (40U/EL) (Promega)	0.2
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	0.4
Totale per reazione	15
Saggio Pan-lyssa RT-qPCR
Reagente	L/Reazione
2x SYBR Verde Reaction Mix	10
Acqua senza nuclea	2.1
Taq5long (Avanti) [10 M]	1
Taq16revlong (Inverti) [10 M]	1
MgSO4 [50 mM] (fornito nel kit)	0.25
Rox Dye di riferimento (25 M)	0.05
RNasin (40U/EL) (Promega)	0.2
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	0.4
Totale per reazione	15

Tabella 1: Descrizione della soluzione di reazione del master mix per i tre diversi assays RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR e eGFP RT-qPCR).

Test di valutazione RT-qPCR	Nome	digitare	Lunghezza	Sequenza (5'-3')	Senso	Posizione
pan-RABV RT-qPCR saggio	Taq3long	Primer	22	ATG AGA AGT GGA AYA AYC ATC A	S (in vi	7273-7294a
	Taq17revlong	Primer	25	GAT CTG TCT GAA TAA TAG AYC CAR G	Come	7390-7414a
	RABV4	Sonda (FAM/TAMRA)	29	AAC ACY TGA TCB AGK ACA GAR AAY ACA TC	Come	7314-7342a
	RABV5	Sonda (FAM/TAMRA)	32	AGR GTG TTT TCY AGR ACW CAY GAG TTT TTY CA	S (in vi	7353-7384a
Saggio Pan-lyssa RT-qPCR	Taq5long	Primer	23	TAT GAG AAA TGG AAC AAY CAY CA	S (in vi	7272-7294a
	Taq16revlong	Primer	25	GAT TTT TGA AAG AAC TCA TGK GTY C	Come	7366-7390a
eGFP RT-qPCR saggio	EGFP1F	Primer	20	GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC	S (in vi	637-656b
	EGFP2R	Primer	19	GAA CTC CAG CAG GAC GAG G	Come	768-750b
	EGFP	Sonda (FAM/TAMRA)	22	AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A	S (in vi	703-724b

Tabella 2: Descrizione dei primer/probe per i tre diversi saggi RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR e eGFP RT-qPCR). ^un Secondo la sequenza genomica RABV del virus Pasteur (PV) (numero di adesione della GenBank M13215). ^b Secondo la sequenza pEGFP-1 vettoriale di clonazione (numero di adesione GenBank U55761).

Pan-RABV RT-qPCR e eGFP RT-qPCR assaggi
Passo	Ciclo	Temp	Ore	Raccolta dati
Trascrizione inversa	1	45 gradi centigradi	15 min
inattivazione RT/denaturazione iniziale	1	95 gradi centigradi	3 min
Amplificazione	40	95 gradi centigradi	15 s
		61 gradi centigradi	1 min	Punto finale
Saggio Pan-lyssa RT-qPCR
Passo	Ciclo	Temp	Ore	Raccolta dati
Trascrizione inversa	1	45 gradi centigradi	15 min
inattivazione RT/denaturazione iniziale	1	95 gradi centigradi	3 min
Amplificazione	40	95 gradi centigradi	15 s
		55 gradi centigradi	1 min	Punto finale
Curva di dissociazione	1	95 gradi centigradi	15 s	Aumentare 0,1 gradi centigradi, 55-95 gradi centigradi
		55 gradi centigradi	1 min
		95 gradi centigradi	15 s
		55 gradi centigradi	15 s

Tabella 3: Descrizione delle condizioni di ciclo termico per i tre diversi saggi RT-qPCR (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR e eGFP RT-qPCR).

Analisi	Analisi	Risultati	Interpretazione
RT-qPCR eGFP	Cq nell'intervallo di accettazione	Estrazione convalidata	L'analisi di altri saggi può essere fatta
	Cq fuori dall'intervallo di accettazione	Estrazione non convalidata	Riprovare il campione (ripetere la corsa o/e l'estrazione), richiedere un altro campione se necessario
pan-RABV RT-qPCR	Cq <38	Positivo	Rilevamento positivo dell'RNA virale
	Cq 38 dollari	Negativo	Analisi dell'analisi pan-lyssa RT-qPCR
pan-lyssa RT-qPCR	Curva di fusione considerata positiva	Positivo	Rilevamento positivo dell'RNA virale
	Curva di fusione considerata negativa	Negativo	Assenza di rilevamento dell'RNA virale

Tabella 4: Interpretazione complessiva del doppio saggio combinato pan-lyssavirus RT-qPCR.

Emi-nested di saggio PCR convenzionale	Tondo PCR	Nome	Lunghezza	Sequenza (5'-3')	Senso	Posizionareun	Dimensione dell'amplificatore (bp)
PCR emi-annidato che prende di mira il gene della polimerasi	1o turno	PVO5m	20	ATG ACA GAC AAY YTG AAC AA	S (in vi	7170-7189	320
		PVO9	19	TGA CCA TTC CAR CAR GTN G	Come	7471-7489
	2o turno	PVO5m	20	ATGA CAG ACA AYY TGA ACA A	S (in vi	7170-7189	250
		PVO8 (in oalfa)	22	GGT CTG ATC TRT CWG ARY AAT A	Come	7398-7419
PCR emi-annidato mirato al gene nucleoproteina	1o turno	N127 (in n:	20	ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG	S (in vi	55-74	1532
		N8m	19	CAG TCT CNG CCA TCT CCT C	Come	1568-1586
	2o turno	N127 (in n:	20	ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG	S (in vi	55-74	845
		N829 (in n. di	19	GCC CTG GTT CGA ACA TTC T	Come	881-899

Tabella 5: Descrizione dei primer utilizzati per la PCR convenzionale emi-annidata.

	PCR emi-annidato che prende di mira il gene della polimerasi
	Passo	Ciclo	Temperatura	Ore
Primo e secondo turno	Denaturazione iniziale	1	94 gradi centigradi	3 min
	Denaturazione	35	94 gradi centigradi	30 s
	Ibridazione		56 gradi centigradi	45 s
	Allungamento		72 gradi centigradi	40 s
	Allungamento finale	1	72 gradi centigradi	3 min
	PCR emi-annidato mirato al gene nucleoproteina
	Passo	Ciclo	Temperatura	Ore
Primo turno	Denaturazione iniziale	1	94 gradi centigradi	3 min
	Denaturazione	35	94 gradi centigradi	30 s
	Ibridazione		56 gradi centigradi	30 s
	Allungamento		72 gradi centigradi	45 s
	Allungamento finale	1	72 gradi centigradi	3 min
Secondo turno	Denaturazione iniziale	1	94 gradi centigradi	3 min
	Denaturazione	35	94 gradi centigradi	30 s
	Ibridazione		58 gradi centigradi	30 s
	Allungamento		72 gradi centigradi	30 s
	Allungamento finale	1	72 gradi centigradi	3 min

Tabella 6: Descrizione delle condizioni di ciclo termico per la PCR convenzionale annidata emi-annidata.

Laboratorio	Paese	Periodo di valutazione	Nb di campioni	Risultati DFAT		Risultati RIDT		Sensibilità	Specificità
				Pos	Neg	Pos	Neg
Laboratorio 1	Francia	2015	82	50	32	50	32	96%	93.7%
Laboratorio 2	Ciad	2012-2015	44	33	11	33	11	100%	100%
Laboratorio 3	D' avorio	2017	10	8	2	8	2	100%	100%
Laboratorio 4	Mali	2017	18	15	3	15	3	100%	100%
Laboratorio 6	Italia	2016	8	8	0	8	0	100%	-
Tutti		2015-2017	162	114	48	114	48	98.2%	95.8%

Tabella 7: Determinazione dei parametri intrinseci (sensibilità, specificità) del test RIDT rispetto al metodo DFAT di riferimento, basata sull'analisi di un totale di 162 campioni e con la partecipazione di 5 diversi laboratori.

Ceppo di virusun	Host originale	Posizione	Concentrazione iniziale (FFU/mL)b	Limite di rilevamento (FFU/mL)c
9147FRA	Volpe rossa	Francia	3,1 x 107	10 6 del sistemadi inade'
Cvs	Isolamento del laboratorio	-	1,6 x 107	10 6 del sistemadi inade'
8743THA	Umano	Thailandia	8,1 x 107	> 8,1 x 106
9508C-K (SAD)	Isolamento del laboratorio	-	5,4 x 108	107 del sistema
Pv	Isolamento del laboratorio	-	4,3 x 107	10 6 del sistemadi inade'
9001FRA	Cane	Guyana francese	2,4 x 106	> 2,4 x 105
9704ARG (ARG)	Bat	Argentina	9,5 x 107	10 5 del sistemadi
04030PHI	Umano	Filippine	2,5 x 107	10 5 del sistemadi

Tabella 8: Limite di rilevamento del RIDT utilizzando 8 diverse sospensioni del virus della rabbia titolato (da Léchenne et al. 2016¹⁴). ^un CVS: Sfida ceppo di virus, SAD: Street Alabama Dufferin, PV: Pasteur virus. ^b Numero di unità di formazione di messa a fuoco fluorescente (FFU) per mL. ^c Numero di unità di formazione di messa a fuoco fluorescente (FFU) depositate sulla striscia.

		RIDT eseguita in
		Laboratorio 1			Laboratorio 2			Combinato
		Positivo	Negativo	Totale	Positivo	Negativo	Totale	Positivo	Negativo	Totale
Rilevamento virale dell'RNA	Positivo	18	1	19	26	0	32	44	7	51
	Negativo	0	0	0	0	0	3	0	3	3
	Totale	18	1	19	26	0	35	44	10	54

Tabella 9: Rilevamento dell'RNA virale con RT-qPCR sulla striscia di prova Anigen utilizzata in condizioni di laboratorio (Laboratorio 1), in condizioni di campo e spedita a temperatura ambiente (laboratorio 2) o combinata (da Léchenne et al. 2016¹⁴).

Tabella supplementare 1: Descrizione dei 162 campioni testati con il test RIDT per la determinazione dei parametri intrinseci presentati nella tabella 7. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Discussione

Il RIDT è un metodo semplice, rapido e a basso costo per la diagnosi della rabbia post-mortem e un'alternativa promettente sul campo ai test di laboratorio. L'applicazione di tale test, in particolare per le aree decentralizzate dei paesi a basso e medio reddito, migliorerebbe la comprensione della prevalenza e della trasmissione del virus della rabbia su scala locale e potenzialmente nazionale. In combinazione con il metodo di raccolta rapida dei campioni cerebrali (senza necroscopia completa), un grande vantaggio è che il test può essere interamente eseguito nell'ambiente di campo, lontano dalle strutture di laboratorio. I campioni di cervelli raccolti tramite il foramen magnum possono essere utilizzati per il test, quindi non è necessario aprire completamente il cranio animale. Il test è semplice da eseguire e interpretare ed è particolarmente adatto per le attività di sorveglianza sul campo¹⁴. Altri vantaggi del RIDT rispetto al DFAT o DRIT non sono necessari controlli positivi e negativi e l'archiviazione del kit a temperatura ambiente. Inoltre, il protocollo modificato, in cui la fase di diluizione (1:10) in PBS viene omessa, non richiede reagenti aggiuntivi per eseguire il test e semplifica ulteriormente la procedura in condizioni di campo.

Un punto chiave è la qualità dei campioni cerebrali. I campioni devono essere raccolti e testati il prima possibile dopo la morte dell'animale sospetto, o mantenuti a temperatura fredda prima della prova, per evitare la degradazione. I campioni decomposti non devono essere testati perché possono influenzare il risultato (rischio di risultato falso negativo). Anche se non sono ancora disponibili dati per quanto riguarda la perdita di sensibilità di RIDT nel tempo per i campioni di cervello, ipotizziamo che sia simile rispetto al test DFAT³². Tuttavia, il tempo tra la morte dell'animale e l'esecuzione del test può essere ridotto, in quanto il test può essere fatto rapidamente e direttamente sul campo. Pertanto, vi è in generale un minor rischio di campioni decomposti.

Un altro passaggio critico all'interno del protocollo è la migrazione di sospensione di esempio. La migrazione dovrebbe iniziare subito dopo il deposito del campione (1-5 min). L'elevata viscosità della sospensione potrebbe quindi influenzare negativamente la migrazione. Grattando delicatamente la parte inferiore del sito di deposito del dispositivo con il contagocce e aggiungendo 1-2 gocce in più spesso risolve questo problema, e la migrazione inizia subito dopo.

La maggior parte dei test RIDT eseguiti nei laboratori africani (Chad, Costa d'Avorio e Mali) sono stati eseguiti a temperatura ambiente che può superare i 30 gradi centigradi, mentre l'intervallo di temperatura per lo stoccaggio e l'uso raccomandato dal produttore è di 15 gradi centigradi . Anche se non abbiamo identificato alcun impatto di alta temperatura sulle prestazioni del test RIDT, è necessario valutarlo con maggiore attenzione. Allo stesso modo, l'impatto dell'alta temperatura durante lo stoccaggio e il trasporto del dispositivo dopo l'uso per il rilevamento dell'RNA virale e la genotipizzazione richiede un'ulteriore valutazione. La sensibilità del rilevamento dell'RNA virale da parte di RT-qPCR dalla striscia RIDT può essere influenzata dalla qualità del campione cerebrale inizialmente utilizzato nel test, ma anche dalla condizione di archiviazione dei test RIDT dopo l'uso. Ad esempio, la sensibilità del rilevamento dell'RNA era maggiore quando i test RIDT usati venivano memorizzati in condizioni di laboratorio controllate (94,7%) rispetto alle condizioni di campo (ad esempio, Ciad) (81,2%)¹⁴. Queste condizioni potrebbero anche influenzare l'integrità (soprattutto la lunghezza) dell'RNA fissato sulla striscia, eventualmente spiegando la moderata sensibilità per la genotipizzazione basata su amplificatori PCR più lunghi (ad esempio, >500 nucleotidi)¹⁴. La sensibilità di RT-qPCR eseguita sulla striscia di prova è stata inferiore a quella ottenuta utilizzando le schede FTA Whatman (80,6%)¹⁴. Simile ad altre tecniche molecolari, il carico virale può anche influenzare il successo della genotipizzazione basata su strisce RDIT, con potenziali risultati negativi per campioni con basso carico virale¹⁴.

Il test non è attualmente raccomandato dall'OMS e dall'OIE per la diagnosi di routine e la sorveglianza della malattia, e un risultato non può essere utilizzato da solo per guidare il processo decisionale della PEP. È ancora necessaria un'ulteriore convalida dei test. Tuttavia, un'accurata diagnosi rapida della rabbia è un elemento cruciale dei sistemi di sorveglianza continua della rabbia ben funzionanti ed è strumentale per aumentare l'impegno politico, che è eminentemente importante per il successo del controllo sostenibile della rabbia³³. I test RIDT offrono nuove opportunità diagnostiche per la rabbia in questo contesto e sono uno strumento utile per espandere la sorveglianza della rabbia animale sul campo nelle aree enzootiche a basso o medio reddito.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Antirabbica Nucleocapside coniugato (liofilizzato, adsorbito)	Bio-Rad, Francia	3572112	Fluoresceina-5-isotiocianato (FITC) anticorpo policlonale coniugato contro il nucleocapside del virus della rabbia. Utilizzare per la tecnica di riferimento DFAT.
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, Francia	4351104	Amplificazione dell'RNA virale mediante RT-qPCR dopo l'estrazione dal dispositivo RIDT.
Pipetta di plastica monouso, cannuccia, pinza, contagocce	-		Attrezzatura utilizzata per la raccolta del tronco encefalico (midollo allungato) attraverso il forame magno (via occipitale).
Evans Blue Solution 1%	Bio-Rad, Francia	3574911	Controcolorazione utilizzata per il DFAT per facilitare la lettura al microscopio UV.
Primer eGFPF1	Eurofins Genomics,	Germany-Forward	primer per l'amplificazione dell'eGFP di controllo interno mediante RT-qPCR dopo l'estrazione dell'RNA dal dispositivo RIDT, sequenza: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'.
Primer eGFPR2	Eurofins Genomics,	Germania-Primer	inverso per l'amplificazione dell'eGFP di controllo interno mediante RT-qPCR dopo l'estrazione dal dispositivo RIDT, sequenza: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'.
Primer Taq17 revlong	Eurofins Genomics,	Germania-Primer	inverso per l'amplificazione dell'RNA virale mediante RT-qPCR dopo l'estrazione dell'RNA dal dispositivo RIDT, sequenza: 5'-ATGAGAAGTGG AAYAAYCATCA-3'.
Primer Taq3 long	Eurofins Genomics,	Germany-Forward	primer per l'amplificazione dell'RNA virale mediante RT-qPCR dopo l'estrazione dell'RNA dal dispositivo RIDT, sequenza: 5'-GATCTGTCTGAA TAATAGAYCCARG-3'.
Sonda eGFP FAM/TAMRA	Eurofins Genomics,	Germania-Primer	forward per l'amplificazione del controllo interno mediante RT-qPCR dopo l'estrazione dal dispositivo RIDT, sequenza: 5'-AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCA-3'.
Sonda RABV4 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics,	Germania-Sonda	per l'amplificazione dell'RNA virale mediante RT-qPCR dopo l'estrazione dell'RNA dal dispositivo RIDT, sequenza: 5'-AACACYTGATCBA GKACAGARAAYACATC-3'.
Sonda RABV5 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics,	Germania-Sonda	per l'amplificazione dell'RNA virale mediante RT-qPCR dopo l'estrazione dell'RNA dal dispositivo RIDT, sequenza: 5'-AGRGTTTTCYAG RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'.
Kit per il test rapido della rabbia Ag	BioNote Inc., Repubblica di Corea	RG18-01DD	Test diagnostico immunocromatografico rapido (RIDT, chiamato anche dispositivo a flusso laterale o LFD) per la diagnosi post-mortem della rabbia.
Inibitore ricombinante della RNasina ribonucleasi	Promega, USA	Enzima N2515	utilizzato con il kit per l'amplificazione dell'RNA virale mediante RT-qPCR dopo l'estrazione dal dispositivo RIDT.
Kit qRT-PCR SuperScript III Platinum One-Step	Invitrogen, Francia	11732-020	Kit per l'amplificazione dell'RNA virale mediante RT-qPCR dopo l'estrazione dal dispositivo RIDT.
Reagente TRIzol	Invitrogen, Francia	15596026	Estrazione di RNA totale a base di fenolo/cloroformio utilizzando la membrana di cellulosa del RIDT.