Presentato qui è un protocollo per isolare vari sottoinsiemi di macrofagi e altre cellule non immuni dal miocardio umano e topidano preparando una sospensione a singola cellula attraverso la digestione enzimatica. Vengono inoltre presentati schemi di Gating per l'identificazione e la caratterizzazione basata sulla citometria del flusso di macrofagi.
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Articolo metodologico
Isolamento di sottoinsiemi di macrofaschi e cellule stromali da esemplari di miocardio umano e topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
I macrofagi rappresentano le popolazioni di cellule immunitarie più eterogenee e abbondanti nel cuore e sono centrali nel guidare l'infiammazione e le risposte riparative dopo lesioni cardiache. Come vari sottoinsiemi di macrofagi orchestrano le risposte immunitarie dopo lesioni cardiache è un'area attiva di ricerca. Presentato qui è un semplice protocollo che il nostro laboratorio esegue regolarmente, per l'estrazione di macrofagi da campioni di topo e miocardio umano ottenuti da individui sani e malati. In breve, questo protocollo comporta la digestione enzimatica del tessuto cardiaco per generare una singola sospensione cellulare, seguita da colorazione anticorpale, e citometria di flusso. Questa tecnica è adatta per i saggi funzionali eseguiti su cellule ordinate e per il sequenziamento di RNA sfuso e a singola cellula. Uno dei principali vantaggi di questo protocollo è la sua semplicità, la variazione minima giorno per giorno e l'ampia applicabilità che consente lo studio dell'eterogeneità dei macrofaci tra vari modelli murini ed entità di malattie umane.
Introduzione
I macrofagi rappresentano il tipo di cellule immunitarie più abbondanti nel cuore, e svolgono un ruolo significativo nel generare robuste risposte infiammatorie e riparative dopo lesioni cardiache1,2,3,4. In precedenza, il nostro gruppo identificava due sottoinsiemi principali di macrofagi nel cuore murino derivati da origini dello sviluppo distinte5,6. In generale, è possibile identificare popolazioni distinte di sottoinsiemi di macrofagi cardiaci residenti in tessuto in base all'es....
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Protocollo
Il protocollo presentato è stato approvato dalla Washington University nel St. Louis Institutional Review Board (#201305086). Tutti i soggetti forniscono il consenso informato prima della raccolta dei campioni e gli esperimenti vengono eseguiti in conformità con il protocollo di studio approvato. Il protocollo presentato viene eseguito con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Washington University School of Medicine e segue le linee guida descritte nella Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Preparazione di campioni di tessuto cardiaco umano
- Sciacquare i cuori e....
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Risultati
Il protocollo descritto consente l'isolamento dei macrofagi dal topo e dal miocardio umano. Utilizzando lo stesso protocollo, ma con una diversa strategia di colorazione e gating, le cellule stromali possono anche essere raccolte dal miocardio umano. I risultati FACS qui presentati sono stati acquisiti sulla piattaforma BD LSRII o BD FACS ARIA III. I controlli di compensazione sono stati generati da campioni di controllo del colore singolo provenienti da splenociti macchiati.
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Discussione
Il protocollo consente l'estrazione di vari sottoinsiemi di macrofafi dal miocardio umano. Il protocollo è semplice e richiede da 3 a 4 ore per preparare le sospensioni a cella singola pronte per l'analisi FACS. Anche se il protocollo è relativamente semplice da eseguire, ci sono alcuni aspetti tecnici che devono essere considerati che ridurrà al minimo la variabilità. In primo luogo, lavorare in modo tempestivo con il tessuto umano è necessario per una vitalità cellulare ottimale. È importante mantenere il tessuto in sa.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato reso possibile dai finanziamenti forniti dal Children's Discovery Institute della Washington University e dal St. Louis Children's Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), dalla Fondazione del Barnes-Jewish Hospital (8038-88) e dal NHLBI (R01) HL138466, R01 HL139714). K.J.L. è supportato da NIH K08 HL123519 e Burroughs Welcome Fund (1014782).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette Conocal da 15 mL | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µ m Filtri cellulari | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| Provette coniche da 50 mL | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Tampone di lisi | Gibco | A10492-01 | |
| Siero bovino Albumina | Sigma | A2058 | |
| Collagenasi 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAsi 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0,5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Tampone | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Tampone | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0,5 M) | ||
| Fetale Siero Bovino | Gibco | A3840201 | |
| Pinze | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Emostatici | VWR | 63042-052 | |
| Ialuronidasi tipo 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Piastre di Petri | Thermo Fisher | ||
| Lama di rasoio | VWR | 55411-050 | |
| Forbici | VWR | 82027-578 |
Riferimenti
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814(2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electr....
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Ristampe e permessi
