Elaborazione della coltura embrionale, del guscio d'uovo e fungina per la microscopia elettronica a scansione

Sommario

Qui presentiamo protocolli di elaborazione dettagliati per l'imaging di campioni di tessuti delicati utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). Per la preparazione di gusci d'uovo rigidi, embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo, l'essiccazione dell'aria semplice e l'essiccazione a punti critici, sono descritti per la preparazione di gusci d'uovo rigidi, embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo e colture fungine.

Abstract

Sebbene la microscopia elettronica a scansione (SEM) sia ampiamente utilizzata per l'analisi ultrastrutturale di vari campioni biologici e non biologici, i metodi coinvolti nell'elaborazione di diversi campioni biologici coinvolgono pratiche uniche. Tutte le pratiche convenzionali descritte nella letteratura per l'elaborazione dei campioni trovano ancora applicazioni utili, ma sottili cambiamenti nella preparazione dei campioni possono alterare la qualità dell'immagine, così come, introdurre artefatti. Pertanto, l'utilizzo di una tecnica di preparazione campione unica specifica per il tipo di tessuto analizzato è necessario per ottenere un'immagine di buona qualità con risoluzione ultrastrutturale. L'obiettivo di questo studio è fornire i protocolli ottimali di preparazione del campione per l'imaging di embrioni, gusci d'uovo rigidi e colture fungine utilizzando SEM. Le seguenti ottimizzazioni sono state raccomandate per produrre buoni risultati per i tre diversi delicati campioni biologici studiati. L'uso di fissativi più lievi come 4% paraformaldeide o 3% glutaraldeide seguita da disidratazione con serie di etanolo è obbligatorio. Il micelio fungino sui blocchi di agar ottenuti dalle colture di scorrimento produce una migliore integrità ultrastrutturale rispetto alle colture prese direttamente dalle piastre di agar. L'essiccazione chimica degli embrioni con HMDS fornisce l'essiccazione senza introdurre artefatti di tensione superficiale rispetto all'essiccazione a punti critici. HMDS previene la fessurazione causata dal restringimento poiché i campioni sono meno fragili durante l'essiccazione. Tuttavia, per la coltura fungina, l'essiccazione a punti critici fornisce una qualità dell'immagine accettabile rispetto all'essiccazione chimica. I gusci d'uovo possono essere immagini senza particolari passaggi di preparazione, ad eccezione del lavaggio completo e dell'essiccazione dell'aria prima del montaggio. Le metodologie di preparazione sono state standardizzate in base alla qualità accettabile dell'immagine ottenuta con ogni prova.

Introduzione

L'analisi ultrastrutturale del microscopio elettronico a scansione (SEM) e l'imaging intracellulare completano la microscopia luminosa per la profilazione tridimensionale di procadioti, piante e animali. L'elevata risoluzione spaziale di un SEM lo rende una delle tecniche più versatili e potenti disponibili per l'esame delle caratteristiche microstrutturali dei campioni su scala nanometrica a micrometro. Gli esemplari desicizzati sono deferiti a strutture compositive e topografiche con intensi dettagli, che forniscono le basi per lo sviluppo di valide conclusioni sulle relazioni funzionali^{1,2,3 , 4 DEL psu' , 5} Del numero 3( ^{, 6} È possibile: ^{, 7} (in questo stato ^{, 8} (IN vio ^{, 9}. Quando si interpretano immagini SEM di campioni biologici, è una grande sfida distinguere tra le strutture native e gli artefatti creati durante la lavorazione. SeM è generalmente azionato a vuoto molto elevato per evitare interferenze da molecole di gas che interessano i fasci di elettroni primari, secondari o backscattered emessi dal campione^10,11. Inoltre, i materiali biologici sono soggetti a danni da radiazioni a causa delle loro proprietà scarse o non conduttrici. È essenziale che gli esemplari caricati nel SEM siano completamente asciutti e privi di contaminanti organici per eliminare ogni possibile outgassing in un ambiente ad alto vuoto^10,11. Poiché gli esemplari biologici sono per lo più composti da acqua, sono necessarie tecniche di preparativa aggiuntive per garantire che le strutture native siano mantenute.

La risoluzione ottenuta si basa sull'ottimizzazione dei metodi di preparazione specifici per i tipi di campioni e i parametri strumentali utilizzati. Pertanto, è necessario evitare l'utilizzo di passaggi di elaborazione generalizzati per tutti i tipi di tessuto. Alcuni campioni biologici richiederanno una lavorazione meno rigorosa per preservare la loro struttura, mentre potrebbero essere necessari più tempo e cura per i tipi delicati di campioni per evitare l'introduzione di manufatti di essiccazione, come il restringimento e il collasso. La preparazione del campione è un passaggio critico nell'imaging SEM; i risultati degli studi morfometrici sono notevolmente influenzati dalle procedure di preparazione dei campioni^12,13. Le misure di preparazione comuni per molti campioni biologici sono fissazione, disidratazione e rivestimento con un metallo come oro, platino o palladio per convertire le loro superfici in conduttivo per l'analisi SEM. La natura e la combinazione dei passi utilizzati variano a seconda del tipo di tessuto e degli obiettivi specifici dello studio. L'accumulo di carica, la sensibilità al danno del vuoto e del fascio di elettroni pongono problemi durante l'elaborazione di campioni biologici delicati morbidi, che richiedono ulteriori fasi di lavorazione per mantenere la struttura nativa dell'oggetto. L'utilizzo di metodi convenzionali come il fissaggio del tetrossido di osmio e la disidratazione causano restringimento e il collasso di tessuti delicati^14,15,16,17. Lo scopo dello studio è quello di stabilire metodologie eleganti derivate combinando idee da studi precedenti con modifiche per preparare e immagini tessuti delicati morbidi (ad esempio, embrioni di rettili, guscio d'uovo di tartarughe dipinte e colture fungine).

La scelta di un metodo di fissaggio adatto è il primo passo più importante per l'analisi microscopica di campioni biologici. Fissare i tessuti immediatamente dopo l'isolamento da un organismo è essenziale per prevenire l'alterazione nella loro morfologia a causa della decomposizione. Un efficace fissativo dovrebbe terminare i processi cellulari permeando rapidamente le cellule e mantenendo l'effetto in modo irreversibile per stabilizzare la struttura del campione per resistere a entrambe le fasi di elaborazione successive e l'esame ai sensi del SEM^{17 , 18.}Sebbene siano noti diversi metodi di fissaggio chimici e fisici, la fissazione chimica è più comunemente utilizzata per i campioni biologici per evitare qualsiasi cambiamento cellulare dovuto all'autolisi, alla putrefazione e agli effetti di essiccazione. Ci sono numerose formulazioni chimiche fissative discusse nella letteratura^{17,19,20,21,22,23}, fissativi che funzionano denatura e coagulando macromolecole biologiche, e quelle che si fissano covalentmente incrociando macromolecole. Gli alcoli sono utilizzati come fissativi didenazione che conservano l'ultrastruttura molto scarsa e sono utilizzati principalmente per la microscopia leggera e non raccomandati per l'analisi microscopica elettronica. I fissativi come la formaldeide, la glutaraldeide e il tetrossido di osmio creano un incrocio intermolecolare e intramolecolare tra macromolecole all'interno dei tessuti, fornendo un'eccellente conservazione delle ultrastrutture^{11 ,24,25,26}. I campioni biologici sono sensibili alla temperatura. La temperatura all'inizio della fissazione è raccomandata per essere di 4 gradi centigradi per ridurre la mobilità laterale delle proteine della membrana, per rallentare la diffusione delle molecole intercellulari e rallentare il tasso di fissazione¹¹. Il tempo necessario per fissare i tessuti dipende in gran parte dalle dimensioni del campione e dalla velocità con cui il fissativo diffonde e reagisce con i componenti del campione. Una fissazione notturna in paraformaldeide del 4% o 3% di glutaraldeide in PBS a 4 gradi centigradi è il metodo preferito per l'analisi SEM dei campioni utilizzati in questo studio per le loro proprietà penetranti sequenziali, che consentono l'elaborazione di campioni delicati più piccoli^{17 , 18} mi lato ^{, 19} del 12 ^{, 20 anni , 27}. Una fase post-fissazione con tetrossido di osmio viene eliminata non solo a causa della sua natura tossica, ma anche per non implementare alcun vantaggio aggiuntivo per migliorare la qualità dell'immagine per i campioni analizzati in questo studio.

I campioni biologici contengono fluidi che interferiscono con l'operazione SEM; quindi, i campioni devono essere essiccati prima di inserirlo nella camera campione SEM. Una volta garantita la disidratazione, il solvente deve essere rimosso dal tessuto senza creare artefatti nei campioni a causa della tensione/essiccazione superficiale. Sono stati comunemente utilizzati tre diversi metodi di essiccazione durante la lavorazione dei tessuti per l'imaging SEM: essiccazione dell'aria, essiccazione a punti critici e congelamento dei campioni di essiccazione^28,29,30,31. Pochi studi riportano tutti e tre i metodi di essiccazione producendo risultati identici con campioni di tessuto animale^28,29,30,31. Una pratica generale utilizzata per i campioni più piccoli è la disidratazione chimica mediante la concentrazione crescente di serie di alcol e hexamethyldisilazane (HMDS), ma i campioni più grandi vengono essiccati utilizzando uno strumento di essiccazione a punti critici (CPD)³². Durante il processo di essiccazione, notevoli forze formate in piccole cavità che vengono passate attraverso il campione da un'interfaccia liquido/gas; questo può anche portare ad un crollo completo delle strutture cave³³. Qualsiasi deformazione dovuta al trattamento potrebbe quindi essere scambiata come caratteristica strutturale nativa del campione. Pertanto, il fenomeno generalizzato per la lavorazione dovrebbe essere eliminato e un processo di essiccazione unico dovrebbe essere standardizzato per ogni tipo di tessuto, soprattutto quando vengono analizzati campioni di tessuto delicati.

In diversi studi condotti utilizzando varie combinazioni di tutti i processi di cui sopra, abbiamo standardizzato i metodi che possono essere utilizzati per l'analisi SEM di tre tessuti delicati: embrioni di rettili, gusci d'uovo di tartarughe dipinte e colture fungine. I biologi e i morfologi dello sviluppo descrivono la morfogenesi normale e anormale durante lo sviluppo dell'embrione in animali vertebrati rappresentativi. Le indagini sulle vie di segnalazione genica dipendono dalla descrizione morfologica di nuove strutture. Per evitare bruschi cambiamenti nella struttura dell'embrione dei vertebrati durante l'analisi SEM, si consiglia l'essiccazione chimica dopo la disidratazione. L'essiccazione chimica con HMDS è il metodo di essiccazione relativamente più recente e i vantaggi includono la relativa rapidità, la facilità d'uso, la perdita dei costi e la limitata competenza e le attrezzature necessarie⁹. Il CPD è una tecnica di essiccazione comunemente utilizzata che utilizza il passaggio di CO₂ attraverso i campioni a una temperatura e pressione specifiche. Abbiamo identificato che hmDS è adatto per l'essiccazione di tessuti delicati molli e consente di elaborare campioni più grandi rispetto all'essiccazione a punti critici, che ha causato un'estesa deformazione ai tessuti embrionali. Sono stati utilizzati diversi metodi per preparare campioni per l'imaging SEM per studiare le caratteristiche morfologiche dei funghi^{34 .} Gli esemplari fungini sono comunemente fissati nel tetrossido di osmio seguito da disidratazione dell'etanolo e essiccazione a punti critici, che può fornire risultati soddisfacenti, anche se gli effetti tossici del tetrossido di osmio^6,7,35 e perdere materiali fungini mentre si cambiano le soluzioni durante la lavorazione sono svantaggi pronunciati. Anche la tecnica di preparazione dei campioni che utilizza l'essiccazione ad aria senza fissazione è stata praticata^36, ma si traduce in strutture rimpicciolite e collassate, e l'osservazione di tali campioni può essere facilmente interpretata erroneamente mentre caratterizza la specie. L'hypha fungina perde la sua integrità a contatto con i liquidi e un'essiccazione uniforme potrebbe non essere raggiunta per ripristinare la struttura. A causa di questo effetto, l'essiccazione automatica è comunemente usata per asciugare tessuti molli come il micelio fungino. L'essiccazione congelante funziona bene per i materiali puliti, ma la presenza di sali o secrezioni oscurerà i dettagli superficiali che saranno identificati solo nella fase di visualizzazione SEM. Abbiamo accoppiato il metodo di coltura slide con il fissaggio della glutaraldeide e l'essiccazione dei punti critici per produrre dettagli strutturali di hyphae e spore fungine intatte. Anche se l'essiccazione da CPD ha causato restringimento negli embrioni, ha portato a strutture miceliali ben conservate quando accoppiato con fissazione della glutaraldeide. Il guscio d'uovo è di primaria importanza per l'embrione di animali ovipari non solo agendo come copertura protettiva, ma fornendo anche stabilità meccanica, permeabilità al gas e all'acqua e una riserva di calcio per l'embrione in via di sviluppo. I gusci delle uova di tartaruga d'acqua dolce sono classificati come "rigidi" in base alla loro struttura, e grazie alla loro disponibilità hanno ricevuto un'attenzione significativa dai biologi^{1,2,3,4 , 5} Del numero 3( ^{, 6} È possibile: ^{, 7} (in questo stato ^{, 37 Mi} lasa' di ^{, 38}.

Dettagliamo metodi semplici per un facile esame delle membrane di guscio e guscio di tartaruga dipinta che può essere applicato a qualsiasi specie rigida di guscio d'uovo. Le metodologie di preparazione sono state valutate in base alla qualità dell'immagine risultante e alla riduzione dei potenziali artefatti.

Protocollo

NOTA: le uova di tartaruga dipinta (Chrysemys picta) utilizzate in questo studio sono state raccolte durante la stagione di nidificazione da maggio a giugno 2015-16 dalla Rice Creek Field Station, Oswego New York con il permesso ottenuto dal Dipartimento ambientale dello Stato di New York Conservazione (DEC).

1. Metodo di essiccazione chimica per la lavorazione degli embrioni per SEM

1. Raccogli le uova di tartaruga dai campi durante la stagione della nidificazione. Preparare in anticipo le camere di incubazione, fatte di scatole di plastica con coperchi (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm riempite con mezzo da letto preparato con una miscela umida di vermiculite e muschio di torba (rapporto 1:1). Fare 4-6 fori di circa 0,25 cm lungo i lati delle scatole e sul coperchio per consentire l'aerazione.
2. Rimuovere delicatamente il terreno dal nido per scoprire le uova. Pulire la superficie delle uova di tartaruga con tintura di iodio diluita (1:25.000) per controllare la contaminazione microbica durante l'incubazione. Posizionare le frizioni separate l'una dall'altra, la dimensione della covata della tartaruga dipinta può variare da 5-9 uova e posizionare un massimo di 8-9 uova per scatola.
   NOTA: Maneggiare con cura le uova durante la raccolta, la pulizia, l'etichettatura e il posizionamento all'interno delle scatole. La posizione e l'allineamento delle uova devono essere le stesse della deposizione, qualsiasi movimento inibirà lo sviluppo dell'embrione.
3. Seppellire manualmente le uova metà nella biancheria da letto, coprire e posizionare la scatola all'interno dell'incubatrice impostata a 30 gradi centigradi. Incubare le uova per 10-17 giorni per ottenere gli stadi embrionali 12, 13 e 18 rispettivamente utilizzati in questo studio. Aggiungere acqua distillata per bagnare parzialmente il mezzo da letto ogni due giorni per evitare la disidratazione e mantenere il livello di umidità per il normale sviluppo degli embrioni.
   NOTA: L'incubazione e la messa in scena di embrioni sono secondo una tabella completa dello sviluppo pubblicata all'inizio^{del 39}.
4. Fissare gli embrioni facendo il primo taglio su un lato del guscio d'uovo dorsale e la membrana del tuorlo insieme, verticale verso l'asse lungo utilizzando forbici appuntite. Inserire accuratamente le forbici nel tuorlo per evitare di tagliare il disco embrionale. Ora tagliare il lato laterale dell'uovo lungo l'asse lungo e poi tagliare l'altro lato dell'uovo lungo l'asse corto.
5. Sbucciare il pezzo espulso con il lato embrionale verso l'alto con le cime. Tagliare l'altro lato laterale del guscio d'uovo e mettere il pezzo assocciato in salina tamponata da fosfato (PBS a un pH di 7.4).
   NOTA: L'uovo di tartaruga è riempito con tuorlo d'uovo altamente viscoso e il lato dorsale dell'embrione aderisce alla membrana del guscio d'uovo. La membrana a guscio d'uovo vicino all'embrione cambia con l'incubazione dal bianco traslucido a un bianco opaco e gessoso. Questo permette di individuare l'embrione al centro del lungo asse ed essere visto come un punto tematico scuro dall'esterno^40,41.
6. Utilizzare uno stereoscopio per isolare gli embrioni insieme alla membrana del tuorlo sbucciandoli dal guscio d'uovo usando pinze. Rimuovere le membrane extraembrionali utilizzando pinze e microforsa. Trasferire l'embrione con un cucchiaio embrionale in PBS fresco in una teglia Petri per lavare qualsiasi sangue o tuorlo.
7. Utilizzare lastre chiare di 12 pozze per fissare gli embrioni durante la notte nel 4% di paraformaldeide in PBS a 4 gradi centigradi o in 2-3% di glutaraldeide in PBS. Mettere da uno a tre embrioni in ogni pozzo a seconda delle dimensioni degli embrioni. Assicurarsi che l'infiltrazione completa (i campioni appaiano bianchi) per gli embrioni più vecchi estendendo il tempo di fissazione per 2-3 giorni. Risciacquare gli embrioni 3x con PBS fresco per 5 min ogni risciacquo.
   NOTA: Evitare di danneggiare la superficie dell'embrione utilizzando inserti in polistirolo con fondi a rete in poliestere per piastre 12 pozzetto per trasferire campioni da un solvente all'altro.
8. Campioni didisidrati utilizzando una serie di concentrazione di etanolo nell'acqua distillata: 30%, 50%, 70%, 80%, 95% e 100% e trattare i campioni per 1 h in ogni soluzione di disidratazione. Ripetere il passaggio con il 100% di etanolo due volte per garantire la completa disidratazione. Se non utilizzati immediatamente, conservare i campioni nel 70% di etanolo a -20 gradi centigradi per un periodo più lungo.
9. Embrioni secchi con una serie di hexamethyldisizana (HMDS) al 100% di concentrazione di etanolo: 1:2, 2:1 e 100%. Lasciare i campioni in ogni soluzione per 20 min e tenere il piatto Petri parzialmente coperto durante il processo.
   NOTA: Eseguire tutte le fasi che coinvolgono HMDS in cofano fumi con l'attrezzatura di protezione personale necessaria come HMDS è altamente tossico.
10. Lasciare gli embrioni nell'ultima soluzione HMDS al 100% coperti completamente o parzialmente in una cappa di fumi durante la notte con conseguente evaporazione dell'HMDS, lasciando i campioni pronti per il montaggio e il rivestimento sputter. Coprire il piatto per eliminare la polvere che si deposita sui campioni.
    NOTA: Il tessuto apparirà bianco dopo l'essiccazione completa e campioni parzialmente essiccati sembrerà di colore giallo, lasciare questi tessuti nella cappa fuma per un tempo più lungo.
11. Scegli la dimensione di mozziconi di alluminio e nastro adesivo in carbonio per dimensione del campione analizzato. Montare i campioni secchi con attenzione su uno stub standard per spillo in alluminio (12,7 mm x 8 mm) utilizzando nastro conduttivo in carbonio a doppio bastone (12 mm).
12. Introdurre i campioni montati nella camera del rivestimento sputter per rivestire il campione con una sottile pellicola d'oro per eliminare l'effetto di carica. Gli esemplari d'oro per 60-120 s a uno sputter 35 mA.
13. Montare gli stub su piastre di pori corrispondenti fissando saldamente i settivi. Trasferire il supporto del campione all'esterno o all'esterno della camera campione di SEM utilizzando lo strumento di scambio del campione. Immagini dei campioni in modalità ad alto vuoto con una tensione del fascio di accelerazione di 10 kV e corrente di emissione di 10 A.
    NOTA: Indossare sempre i guanti durante la movimentazione di campioni, supporti, supporti di montaggio e strumenti di trasferimento per evitare la contaminazione da grasso dalle mani al sistema SEM.
14. Testare tecniche alternative elencate di seguito per confrontare la risoluzione dei campioni ottenuti dalla procedura precedente.
    1. Includere un post-fissaggio con 1% di tetrossido di osmio per 1 h a temperatura ambiente dopo il passaggio 1.7.
    2. Rimuovere parzialmente o completamente l'HMDS al punto 1.10 per una rapida evaporazione rapida dell'HMDS.
    3. Elaborare gli embrioni dopo il passaggio 1.8 utilizzando la essiccazione a punti critico (CPD) seguendo i passaggi 3.3-3.4.

2. Preparazione del guscio d'uovo per SEM utilizzando un metodo di essiccazione dell'aria

1. Raccogliere e incubare le uova della tartaruga dipinta (Chrysemys picta) per fissare gli embrioni come specificato nei passaggi 1.1-1.7.
2. Salvare i gusci d'uovo nell'acqua distillata dopo la fissazione dell'embrione al punto 2.1. Pulire accuratamente i gusci d'uovo immergendosi in acqua distillata per almeno 1 h per eliminare la contaminazione da tuorlo e albumina.
3. Gusci d'uovo asciutti dopo il lavaggio su delicate salviette antistatiche nella cappa fumi durante la notte. Conservare i gusci d'uovo secchi in bottiglie di provino pulite etichettate per numero e stadio.
4. Montare, sputter cappotto e immaginare i campioni seguendo i passaggi specificati nei passaggi 1.11-1.13.

3. Metodo di essiccazione dei punti critici per la preparazione delle colture fungine per SEM

1. Stabilire le impostazioni cultura delle diapositive
   1. Preparare i supporti di agar (PDA) di patate per le colture fungine: aggiungere 39 g di potenza PDA in 1 L di acqua distillata in una fiaschetta di Erlenmeyer. Mescolare bene ruotando il flacone e autoclamare il supporto a 121 gradi centigradi per 30 min.
      NOTA: Dopo la sterilizzazione, la soluzione agar dovrebbe essere calda e non si solidificherà presto. Raffreddare abbastanza in modo che non inattivi gli antibiotici.
   2. Mescolare vorticoso e versare piastre (circa 10-12 mL di supporti per ogni piatto Petri 10 cm), impilare con cura e lasciare solidificare.
   3. Utilizzare una lama del bisturi sterile per tagliare piccoli blocchi di agar circa 1/2 a 3/4 di pollice. Rimuovere e posizionare un blocco di agar su un vetrino in vetro pulito.
   4. Mettere il vetrino in una piastra Petri pulita per evitare la contaminazione e preservare l'umidità durante l'incubazione.
   5. Sollevare il vetrino dal fondo della piastra Petri utilizzando uno stuzzicadenti sterile per creare tensione superficiale tra la piastra e lo scivolo per rimuovere il vetrino di vetro senza interrompere la delicata crescita dopo l'incubazione.
   6. Utilizzare un anello sterile o un ago per trasferire alcuni dei funghi dall'inoculum del campione a ciascuno dei quattro lati del blocco di agar sul vetrino.
   7. Posizionare un coperchio pulito sulla superficie del blocco di agar dopo l'inoculazione. Aggiungere qualche goccia di acqua distillata sterile al piatto Petri intorno al vetrino per garantire l'umidità per i funghi in crescita.
   8. Sigillare parzialmente la piastra utilizzando la pellicola di paraffina e incubare la piastra a 30 gradi centigradi per un periodo di tempo adeguato (per le specie di Fusarium incubare per 36 a 48 h).
   9. Togliere il vetrino dalla parabola Petri e separare lo coverslip strettamente aderente dal blocco di agar utilizzando pinze sterili. Fissare i blocchi di agar in 3% glutaraldeide in PBS durante la notte a 4 gradi centigradi.
2. Disidratare i campioni passando attraverso una serie di etanolo: 10%, 25%, 50%, 75% e 90% con 15 min per variazione. Elaborare i campioni per la disidratazione finale con due modifiche nel 100% di etanolo della durata di 30 minuti ciascuno per garantire la completa saturazione.
3. Essiccazione a punti critici: posizionare campioni disidratati nella camera dell'apparecchio CPD. Sigillare e raffreddare la camera aprendo le valvole per consentire il CO₂ liquido e l'etanolo di sfiato fuori, fino a quando il CO₂ liquido non riempie completamente la camera.
   1. Sigillare e riscaldare lentamente la camera per raggiungere un punto critico quando la pressione della camera supera i 1000 psi e la temperatura supera i 31 gradi centigradi, la fase liquida e gas di CO₂ è in equilibrio. Scolare lentamente il CO₂ dalla camera e il campione come gas per evitare effetti di tensione superficiale.
4. Eseguite il montaggio, la placcatura dorata e l'imaging dei campioni seguendo i seguenti passaggi specificati nei passaggi 1.11-1.13.
5. Eseguire l'analisi comparativa asciugandoi chimicamente i campioni dal passaggio 3.2 utilizzando HMDS seguendo i passaggi 1.9-1.13.

Risultati

La figura 1 mostra l'analisi micrografica elettronica a scansione degli embrioni della tartaruga dipinta (Chrysemys picta). Per l'imaging SEM sono state utilizzate uova di tartaruga verniciate raccolte e incubate su un supporto da letto, montate su mozziconi di alluminio a seguito di essiccazione chimica (Figura 1A-E). Una vista laterale di un embrione di fase 12 mostra le strutture craniofacciali; la prominenza mascellare si estende o...

Discussione

Nel nostro studio, diversi agenti di fissazione, metodi di disidratazione e essiccazione sono stati testati per preparare tre diversi campioni biologici delicati per l'imaging SEM: embrioni, gusci di uova e colture fungine. SeM è comunemente usato per l'analisi della superficie, quindi la penetrazione fissativa è meno preoccupante, ma bisogna capire che strutture interne scarsamente fissate causeranno restringimento verso l'interno o/e strutture superficiali collassate. Il tempo di fissazione prolungato deve essere consi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	Fischer Scientific	S25127A	per colture di vetrini
Tronchetto in alluminio	Tedpella	16111	12,7 mm x 8 mm
BD Difco Terreni di coltura disidratati: Destrosio di patate Agar	BD 213400	DF0013-17-6	Terreni per l'isolamento e la coltivazione di funghi, lieviti e muffe
Cloramfenicolo	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibiotico per terreni
Serra in vermiculite grossolana	Megastore	SO-VER-12	lettiera media
Piastra trasparente a 12 pozzetti	Corning	07-201-589	per il fissaggio dell'embrione
Vetrini coprioggetti	Fischer Scientific	S17525B	per la coltura di vetrini
Essiccatore per punti critici Quorum	CPD	EMS850	essiccazione per punti critici
Piatti di coltura	Fischer Scientific	08 747B	PIATTO PETRI 100X10MM 12/PK
Etanolo	Fischer Scientific	A406P 4	agente di disidratazione
Pincipe - Aquarius Pinzetta	Tedpella	5804	stile 4, lunghezza 108mm, larghezza x spessore 0,017 x 0,17 mm
Glutaraldeide	Fischer Scientific	G151-1	fissativo
Bersaglio d'oro per sputter coater	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Obiettivo dell'oro, 2,375″ D X .002″
Esametildisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	agente essiccante chimico
Salviette Kim Kimtech		S-8115	pulizia
Vetrini per microscopio	Thermo Scientific	67-762-16	per la coltura di vetrini
Forbici per microscopia	Tedpella	1327	Doppia punta, acciaio inossidabile, 100 mm L (3-5/8").
Micro-forbici	Tedpella	1346	Tipo Vannas, dritto, 80mm
L Moria Cucchiaio per embrioni perforato	Fine Science Tools	10370-17	Lunghezza 14,5 cm, diametro punta 20 mm, profondità cucchiaio 5 mm
Inserti Netwell Corning		0330B09	Inserti da 15 mm con 74 &; m La membrana in poliestere funge da pratici vettori durante la lavorazione dei campioni in diversi solventi
Paraformaldeide	Fischer Scientific	T353 500	fissativo
Muschio di torba	Walmart- Miracle Gro	551705263	lettiera media
linguette PELCO nastro conduttivo in carbonio a doppia asta	Tedpella	5000	12 mm
OD Sputter coater	DENTON VACUUM	DESK V	rivestimento metallico sottile
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV	microscopia elettronica