Qui presentiamo protocolli di elaborazione dettagliati per l'imaging di campioni di tessuti delicati utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). Per la preparazione di gusci d'uovo rigidi, embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo, l'essiccazione dell'aria semplice e l'essiccazione a punti critici, sono descritti per la preparazione di gusci d'uovo rigidi, embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo e colture fungine.
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Articolo metodologico
Elaborazione della coltura embrionale, del guscio d'uovo e fungina per la microscopia elettronica a scansione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sebbene la microscopia elettronica a scansione (SEM) sia ampiamente utilizzata per l'analisi ultrastrutturale di vari campioni biologici e non biologici, i metodi coinvolti nell'elaborazione di diversi campioni biologici coinvolgono pratiche uniche. Tutte le pratiche convenzionali descritte nella letteratura per l'elaborazione dei campioni trovano ancora applicazioni utili, ma sottili cambiamenti nella preparazione dei campioni possono alterare la qualità dell'immagine, così come, introdurre artefatti. Pertanto, l'utilizzo di una tecnica di preparazione campione unica specifica per il tipo di tessuto analizzato è necessario per ottenere un'immagine di buona qualità con risoluzione ultrastrutturale. L'obiettivo di questo studio è fornire i protocolli ottimali di preparazione del campione per l'imaging di embrioni, gusci d'uovo rigidi e colture fungine utilizzando SEM. Le seguenti ottimizzazioni sono state raccomandate per produrre buoni risultati per i tre diversi delicati campioni biologici studiati. L'uso di fissativi più lievi come 4% paraformaldeide o 3% glutaraldeide seguita da disidratazione con serie di etanolo è obbligatorio. Il micelio fungino sui blocchi di agar ottenuti dalle colture di scorrimento produce una migliore integrità ultrastrutturale rispetto alle colture prese direttamente dalle piastre di agar. L'essiccazione chimica degli embrioni con HMDS fornisce l'essiccazione senza introdurre artefatti di tensione superficiale rispetto all'essiccazione a punti critici. HMDS previene la fessurazione causata dal restringimento poiché i campioni sono meno fragili durante l'essiccazione. Tuttavia, per la coltura fungina, l'essiccazione a punti critici fornisce una qualità dell'immagine accettabile rispetto all'essiccazione chimica. I gusci d'uovo possono essere immagini senza particolari passaggi di preparazione, ad eccezione del lavaggio completo e dell'essiccazione dell'aria prima del montaggio. Le metodologie di preparazione sono state standardizzate in base alla qualità accettabile dell'immagine ottenuta con ogni prova.
Introduzione
L'analisi ultrastrutturale del microscopio elettronico a scansione (SEM) e l'imaging intracellulare completano la microscopia luminosa per la profilazione tridimensionale di procadioti, piante e animali. L'elevata risoluzione spaziale di un SEM lo rende una delle tecniche più versatili e potenti disponibili per l'esame delle caratteristiche microstrutturali dei campioni su scala nanometrica a micrometro. Gli esemplari desicizzati sono deferiti a strutture compositive e topografiche con intensi dettagli, che forniscono le basi per lo sviluppo di valide conclusioni sulle relazioni funzionali1,2,
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Protocollo
NOTA: le uova di tartaruga dipinta (Chrysemys picta) utilizzate in questo studio sono state raccolte durante la stagione di nidificazione da maggio a giugno 2015-16 dalla Rice Creek Field Station, Oswego New York con il permesso ottenuto dal Dipartimento ambientale dello Stato di New York Conservazione (DEC).
1. Metodo di essiccazione chimica per la lavorazione degli embrioni per SEM
- Raccogli le uova di tartaruga dai campi durante la stagione della nidificazione. Preparare in anticipo le camere di incubazione, fatte di scatole di plastica con coperchi (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm riempite con mezzo da letto prep....
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Risultati
La figura 1 mostra l'analisi micrografica elettronica a scansione degli embrioni della tartaruga dipinta (Chrysemys picta). Per l'imaging SEM sono state utilizzate uova di tartaruga verniciate raccolte e incubate su un supporto da letto, montate su mozziconi di alluminio a seguito di essiccazione chimica (Figura 1A-E). Una vista laterale di un embrione di fase 12 mostra le strutture craniofacciali; la prominenza mascellare si estende o.......
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Discussione
Nel nostro studio, diversi agenti di fissazione, metodi di disidratazione e essiccazione sono stati testati per preparare tre diversi campioni biologici delicati per l'imaging SEM: embrioni, gusci di uova e colture fungine. SeM è comunemente usato per l'analisi della superficie, quindi la penetrazione fissativa è meno preoccupante, ma bisogna capire che strutture interne scarsamente fissate causeranno restringimento verso l'interno o/e strutture superficiali collassate. Il tempo di fissazione prolungato deve essere consi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego per le discussioni e i commenti utili sul manoscritto. Questo studio è stato sostenuto da Rice Creek Associate Grants, Oswego; Sfida concede SUNY Oswego e National Science Foundation (NSF) Small Grants a PGL e JG.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | per colture di vetrini |
| Tronchetto in alluminio | Tedpella | 16111 | 12,7 mm x 8 mm |
| BD Difco Terreni di coltura disidratati: Destrosio di patate Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Terreni per l'isolamento e la coltivazione di funghi, lieviti e muffe |
| Cloramfenicolo | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotico per terreni |
| Serra in vermiculite grossolana | Megastore | SO-VER-12 | lettiera media |
| Piastra trasparente a 12 pozzetti | Corning | 07-201-589 | per il fissaggio dell'embrione |
| Vetrini coprioggetti | Fischer Scientific | S17525B | per la coltura di vetrini |
| Essiccatore per punti critici Quorum | CPD | EMS850 | essiccazione per punti critici |
| Piatti di coltura | Fischer Scientific | 08 747B | PIATTO PETRI 100X10MM 12/PK |
| Etanolo | Fischer Scientific | A406P 4 | agente di disidratazione |
| Pincipe - Aquarius Pinzetta | Tedpella | 5804 | stile 4, lunghezza 108mm, larghezza x spessore 0,017 x 0,17 mm |
| Glutaraldeide | Fischer Scientific | G151-1 | fissativo |
| Bersaglio d'oro per sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Obiettivo dell'oro, 2,375″ D X .002″ |
| Esametildisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | agente essiccante chimico |
| Salviette Kim Kimtech | S-8115 | pulizia | |
| Vetrini per microscopio | Thermo Scientific | 67-762-16 | per la coltura di vetrini |
| Forbici per microscopia | Tedpella | 1327 | Doppia punta, acciaio inossidabile, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-forbici | Tedpella | 1346 | Tipo Vannas, dritto, 80mm |
| L Moria Cucchiaio per embrioni perforato | Fine Science Tools | 10370-17 | Lunghezza 14,5 cm, diametro punta 20 mm, profondità cucchiaio 5 mm |
| Inserti Netwell Corning | 0330B09 | Inserti da 15 mm con 74 &; m La membrana in poliestere funge da pratici vettori durante la lavorazione dei campioni in diversi solventi | |
| Paraformaldeide | Fischer Scientific | T353 500 | fissativo |
| Muschio di torba | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | lettiera media |
| linguette PELCO nastro conduttivo in carbonio a doppia asta | Tedpella | 5000 | 12 mm |
| OD Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | rivestimento metallico sottile |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV | microscopia elettronica |
Riferimenti
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M.
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Ristampe e permessi
