Quantificazione delle dinamiche della rete di interazione proteica mediante co-immunoprecipitazioni multiplexate

Summary

L'immunoprecipitazioni quantitativa multiplex (QMI) utilizza la citometria di flusso per rilevare sensitivemente le differenze nell'abbondanza di interazioni mirate proteina-proteina tra due campioni. QMI può essere eseguita utilizzando una piccola quantità di biomateriale, non richiede tag geneticamente ingegnerizzati e può essere adattato per qualsiasi rete di interazione proteica definita in precedenza.

Abstract

Le interazioni dinamiche proteina-proteina controllano il comportamento cellulare, dalla motilità alla replicazione del DNA alla trasduzione del segnale. Tuttavia, il monitoraggio delle interazioni dinamiche tra più proteine in una rete di interazione proteica è tecnicamente difficile. Qui presentiamo un protocollo per l'immunoprecipitazioni Quantitative Multiplex (QMI), che consente la valutazione quantitativa dei cambiamenti di piegatura nelle interazioni proteiche sulla base delle misurazioni relative a fluorescenza delle proteine nei complessi condivisi rilevate da Exposed Epitopi di superficie (PiSCES). Nel QMI, i complessi proteici da lismi cellulari sono immunoprecipitati sulle microsfere, e quindi sondati con un anticorpo etichettato per una proteina diversa al fine di quantificare l'abbondanza di PiSCES. Gli anticorpi dell'immunoprecipitazioni sono coniugati a diverse regioni spettrali MagBead, il che consente a un citometro di flusso di differenziare più immunoprecipitazioni parallele e quantificare simultaneamente la quantità di anticorpi sonda associati a ciascuna di esse. QMI non richiede l'etichettatura genetica e può essere eseguita utilizzando un biomateriale minimo rispetto ad altri metodi di immunoprecipitazioni. QMI può essere adattato per qualsiasi gruppo definito di proteine interagenti, ed è stato finora utilizzato per caratterizzare le reti di segnalazione nelle cellule T e sinapsi glutammato neuronale. I risultati hanno portato alla generazione di nuove ipotesi con potenziali applicazioni diagnostiche e terapeutiche. Questo protocollo include istruzioni per eseguire QMI, dalla selezione iniziale del pannello anticorpale fino all'esecuzione di saggi e all'analisi dei dati. L'assemblaggio iniziale di un saggio QMI prevede lo screening di anticorpi per generare un pannello e la determinazione empirica di un buffer di lisi appropriato. La successiva preparazione del reagente comprende anticorpi di immunoprecipitazioni covalentmente di accoppiamento a MagBeads, e anticorpi della sonda biotinylante in modo che possano essere etichettati da un fluoroforo coniugato di streptavidin. Per eseguire il saggio, il lisato viene mescolato con MagBeads durante la notte, e poi le perle sono divise e incubate con diversi anticorpi della sonda, quindi un'etichetta di fluoroforo, e lette per citometria di flusso. Vengono eseguiti due test statistici per identificare i PiSCES che differiscono in modo significativo tra le condizioni sperimentali e i risultati vengono visualizzati utilizzando mappe di calore o diagrammi node-edge.

Introduction

Le interazioni dinamiche proteina-proteina costituiscono le cascate di segnalazione molecolare e le strutture motili che sono la base funzionale della maggior parte della fisiologia cellulare¹. Questi processi sono spesso raffigurati come percorsi di segnalazione lineare che passano tra stati costanti basati su singoli input, ma i dati sperimentali e di modellazione mostrano chiaramente che funzionano come reti integrate^{2,3, 4.}Nel caso delle proteine G, recettori diversi hanno spesso la capacità di attivare la stessa proteina G, e un singolo recettore....

Protocol

1. Progettazione del saggio

1. Preparazione anticorpale candidato
   1. Per ogni proteina di interesse, scegliere da 3 a 5 anticorpi da vagliare. Quando possibile, utilizzare anticorpi monoclonali che riconoscono epitopi diversi. Includere anche un anticorpo di controllo non specifico.
   2. Per rimuovere Tris, eseguire lo scambio di buffer aggiungendo l'anticorpo a un filtro di spin da 30 kDa, girando fino al suo volume minimo, aggiungendo 500 L di salina con buffer fosfato (PBS) e ripetendo 3 volte. Per rimuovere le proteine portatrici, eseguire la purificazione degli anticorpi in base al protocollo del produttore (vedere Tabella dei materiali<....

Results

Screening anticorpale
Figura 2 B mostra i risultati di uno schermo per la proteina Connexin36. La maggior parte delle combinazioni IP_probe non produce alcun segnale sui controlli IgG. IP con l'anticorpo monoclonale 1E5 e sonda con 1E5 o l'anticorpo policlonale 6200 produce uno spostamento verso destra nella distribuzione del tallone rispetto ai controlli IgG. Qui sono stati selezionati IP 1E5 e la sonda 6200poly per evitare l'uso dello stesso anticorpo d.......

Discussion

Il test QMI richiede notevoli investimenti nello sviluppo, nelle attrezzature e nei reagenti dei pannelli anticorpi, ma una volta stabilito il test, si possono raccogliere dati ad alta dimensione osservando le reti di interazione delle proteine mentre rispondono ai controlli sperimentali Stimoli. Tecnicamente, QMI richiede un'attenta pipettatura e tracciamento delle posizioni dei pozzi di campioni e anticorpi. È utile etichettare con attenzione le lastre di analisi, così come un modello dettagliato di posizioni dei pozzi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastre a fondo piatto a 96 pozzetti	Bio Rad	171025001
Piastre PCR a 96 pozzetti	VWR	82006-704
Sistema Bioplex 200 con HTF	Bio Rad	171000205	modificato per essere conservato parzialmente in frigorifero, vedere la Figura S1 per i dettagli
Stazione di lavaggio Bio-Plex Pro	Bio Rad	30034376
BSA	Sigma
Perle CML	Invitrogen	C37481
EDTA	Sigma	E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotina	Thermo Scientific	A39256
MagPlex Microsfere	Luminex	MC12xxx-01	xxx è il
kit di purificazione Spin IgG IgG della	Thermo Scientific	45206	utilizzato per la purificazione
MES	Sigma	M3671
Film per micropiastre, non sterile	USA Scientific	2920-0000
Cocktail di inibitori della fosfotasi #2	Sigma	P5726
Cocktail di inibitori della proteasi	Sigma	P8340
Sandwich Prep Frigorifero	Norlake	SMP 36 15	per la refrigerazione personalizzata di Bioplex 200
Sodium fluoruro	Sigma	201154
Sodio ortovanadato	Sigma	450243
Streptavidina-PE	BioLegend	405204
Sulfo NHS	Thermo Scientific	A39269
Tris	Fisher Scientific	BP152