Sistema di analisi dell'angiogenesi tridimensionale utilizzando Gli spheroidi co-culturali formati da cellule formanti colonia endoteliale e cellule staminali mesenchiche

Sommario

Il sistema di analisi dell'angiogenesi sferoide di co-cultura tridimensionale è progettato per imitare l'angiogenesi fisiologica. Gli sferoidi della co-coltura sono formati da due precursori di cellule vascolari umane, ECFC e MSC, e incorporati nel gel di collagene. Il nuovo sistema è efficace per valutare i modulatori angiogenici e fornisce informazioni più rilevanti allo studio in vivo.

Abstract

Gli studi nel campo dell'angiogenesi sono stati aggressivamente in crescita negli ultimi decenni con il riconoscimento che l'angiogenesi è un segno distintivo di più di 50 diverse condizioni patologiche, come l'artrite reumatoide, l'oculopatia, le malattie cardiovascolari e la metastasi tumorale. Durante lo sviluppo del farmaco di angiogenesi, è fondamentale utilizzare sistemi di analisi in vitro con tipi di cellule appropriate e condizioni adeguate per riflettere il processo di angiogenesi fisiologica. Per superare i limiti degli attuali sistemi di analisi dell'angiogenesi in vitro utilizzando principalmente cellule endoteliali, abbiamo sviluppato un sistema di analisi speroide a co-coltura tridimensionale (3D). Gli sferoidi della co-coltura sono stati prodotti da due precursori di cellule vascolari umane, la colonia endoteliale che forma cellule (ECFC) e le cellule staminali mesenchimale (MSC) con un rapporto di 5 a 1. Gli sferoidi ECC-MSC sono stati incorporati nella matrice del collagene di tipo I per imitare l'ambiente extracellulare in vivo. È stato utilizzato un registratore cellulare in tempo reale per osservare continuamente la progressione della germogliazione angiogenica dagli sferoidi per la tecnica di etichettatura fluorescente a cellule vive per trarre la localizzazione di ogni tipo di cellula durante la formazione del germoglio. Il potenziale angiogenico è stato quantificato contando il numero di germogli e misurando la lunghezza cumulativa dei germogli generati dai singoli sferoidi. Sono stati analizzati cinque sferoidi selezionati casualmente per gruppo sperimentale. Gli esperimenti di confronto hanno dimostrato che gli sferoidi ECFC-MSC mostravano un maggior numero di germogli e una lunghezza cumulativa del germoglio rispetto agli sferoidi solo ECFC. Bevacizumab, un inibitore dell'angiogenesi approvato dalla FDA, è stato testato con il sistema di analisi sferoide di co-cultura appena sviluppato per verificare il suo potenziale per lo screening di farmaci anti-angiogenici. Il valore IC₅₀ per gli sferoidi ECFC rispetto agli sferoidi ecFC era più vicino all'effettiva concentrazione plasmatica di bevacizumab ottenuta dal modello murino tumorale xenotrapianto. Il presente studio suggerisce che il sistema di analisi dell'angiogenesi sferoide degli ECC-MSC 3D è rilevante per l'angiogenesi fisiologica e può prevedere un'efficace concentrazione di plasma prima degli esperimenti sugli animali.

Introduzione

Si prevede che circa 500 milioni di persone in tutto il mondo beneficeranno della terapia di modulazione angiogenesi per malattie associate alla malformazione vascolare come l'artrite reumatoide, l'oculopatia, le malattie cardiovascolari e la metastasi tumorale¹. Così, lo sviluppo di farmaci che controllano l'angiogenesi è diventato un importante settore di ricerca nell'industria farmaceutica. Durante il processo di sviluppo del farmaco, lo studio sugli animali in vivo è necessario per esplorare gli effetti dei farmaci candidati sulle funzioni fisiologiche e sulle interazioni sistemiche tra gli organi. Tuttavia, le questioni etiche e di costo h....

Protocollo

Gli ECFC umani sono stati isolati dal sangue periferico umano come descritto in un precedente rapporto²⁷. In breve, lo strato di cellule mononucleari è stato separato dall'intero sangue usando il Ficoll-Paque Plus, e coltivato nel mezzo corretto fino a quando non sono apparse le colonie endoteliali. Le colonie sono state raccolte e gli ECFC sono stati isolati utilizzando perline magnetiche rivestite CD31. Le MSC sono state isolate dalla frazione di cellula mononucleare aderente (MNC) del midollo osseo adulto umano. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della Duksung Women's University (IRB n. 2017-002....

Risultati

Sono stati effettuati esperimenti di confronto utilizzando sferoidi monocolturali (solo ECFC) e sferoidi co-culturali (ECCCS-MSC) per esaminare se le MSC svolgono un ruolo considerevole nell'angiogenesi mediata da ECFC. La formazione di germogli da ogni sferoide è stata monitorata per 24 h da un registratore cellulare in tempo reale in grado di catturare la progressione della germogliazione angiogenica dagli sferoidi. Il potenziale angiogenico è stato quantificato contando il numero di germogli e misurando la lunghezza c.......

Discussione

Il presente studio introduce un sistema di analisi dell'angiogenesi in vitro migliorato utilizzando sferoidi di co-coltura formati da due progenitori di cellule vascolari umane, ECFC e MSC. Il sistema sferoide co-cultura può imitare la formazione di germogli vascolari in vivo, l'interazione e l'incorporazione tra cellule endoteliali e periciti. Rispetto ad altri saggi di angiogenesi in vitro che riflettono solo l'angiogenesi mediata dalle EC, questo sistema di analisi co-culturale è più rappresentativo della cascata mult.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,05% Tripsina EDTA (1x)	Gibco	25300-054
Bevacizumab	Roche	NA	Nome commerciale: Avastin
Dulbecco Modified Eagle Medium	Gibco	11885-084	DMEM
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbeco (10x)	Gibco	21600-010	PBS (10x)
salina tamponata con fosfato di Dulbeco (1x)	Corning	21-031-CVR	PBS (1x)
Cellule endoteliali Terreno di crescita MV2 kit	Promocell	C-22121	ECGM-MV2
Siero fetale bovino (FBS)	Atlas	FP-0500A	FBS
Gelatina	BD Sciences	214340
L-Glutammina– Penicillina– Streptomicina	Gibco	10378-016	GPS
Terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali-2	Promocell	C-28009	MSCGM-2
Metilcellulosa	Sigma-Aldrich	M0512
PKH26 Kit di collegamento cellulare fluorescente	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26
PKH67 Kit di collegamento cellulare fluorescente	Sigma-Aldrich	MINI67	PKH67
idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	S5881
	Corning	354236
Fattore di crescita endoteliale vascolare A	& D	293-VE-010	VEGF