Valutazione della migrazione dei linfociti in un sistema di trasmigrazione Ex Vivo

Sommario

In questo protocollo, i linfociti sono collocati nella camera superiore di un sistema di trasmigrazione, separato dalla camera inferiore da una membrana porosa. La chemiochina viene aggiunta alla camera inferiore, che induce una migrazione attiva lungo un gradiente di chemiochina. Dopo 48 h, i linfociti vengono contati in entrambe le camere per quantificare la trasmigrazione.

Abstract

Qui, presentiamo un metodo efficiente che può essere eseguito con competenze di laboratorio di base e materiali per valutare il movimento chemiocitico linfocitico in un sistema di trasmigrazione ex vivo. Le cellule linfoidi innate di gruppo 2 (ILC2) e le cellule helper T CD4^- Le cellule helper T sono state isolate dalla milza e dai polmoni di topi BALB/c sfidati da uovo di gallina . Abbiamo confermato l'espressione di CCR4 su entrambe le cellule CD4^- T e ILC2, comparativamente. CCL17 e CCL22 sono i ligandi noti per CCR4; quindi, utilizzando questo metodo di trasmigrazione ex vivo abbiamo esaminato il movimento clatuano 17^- e il movimento indotto da CCL22 dei linfociti. Per stabilire i gradienti di chemiochina, CCL17 e CCL22 sono stati collocati nella camera inferiore del sistema di trasmigrazione. I linfociti isolati sono stati poi aggiunti alle camere superiori e in un periodo di 48 ore i linfociti sono migrati attivamente attraverso 3 pori di m verso la chemiochina nella camera inferiore. Si tratta di un sistema efficace per determinare la chemiocineticidei dei linfociti, ma, comprensibilmente, non imita le complessità che si trovano nei microambienti di organi in vivo. Questa è una limitazione del metodo che può essere superata con l'aggiunta di imaging in situ dell'organo e dei linfociti in fase di studio. Al contrario, il vantaggio di questo metodo è che può essere eseguito da un tecnico entry-level ad un tasso molto più conveniente rispetto all'imaging dal vivo. Man mano che i composti terapeutici diventano disponibili per migliorare la migrazione, come nel caso dell'infiltrazione del tumore delle cellule immunitarie citotossiche, o per inibire la migrazione, forse nel caso di malattie autoimmuni in cui l'immunopatologia è preoccupante, questo metodo può essere utilizzato come strumento di screening. In generale, il metodo è efficace se la chemiochina di interesse genera costantemente chemiocinetici ad un livello statisticamente superiore rispetto al controllo multimediale. In questi casi, il grado di inibizione/miglioramento da un dato composto può essere determinato pure.

Introduzione

Questo metodo di trasmigrazione originale è stato presentato da Stephen Boyden nel 1962 nel Journal of Experimental Medicine¹. Gran parte di ciò che sappiamo sulla chemiotassia e sulla chemiocinetia non sarebbe possibile senza lo sviluppo della camera di Boyden. Prima della scoperta della prima chemiochina nel 1977, i sistemi di trasmigrazione ex vivo sono stati utilizzati per conoscere i fattori del siero che potrebbero arrestare il movimento cellulare nei macrofagi amplificando la motilità cellulare nei neutrofili^1,2. Una massiccia ricchezza di conoscenze è stata sviluppata p....

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati esaminati e approvati dai Comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali presso l'University of Nebraska Medical Center (UNMC) e l'Università dello Utah.

1. Configurazione e preparazione dei reagenti

1. Preparare i media RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
   1. Aggiungere 10 mL di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) a 90 mL di RPMI.
   2. Aggiungere 1 mL di 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine a 100 mL di 10% FBS RPMI.
2. Preparare il supporto di espansione ILC2.
   1. Aggiungere IL-2 e IL-33 (20 n....

Risultati

Espressione CCR4 sulle celle T CD4 e ILC2.

Per il successo dell'esperimento di trasmigrazione ex vivo, è imperativo determinare se i linfociti sono reattivi a CCL17 e CCL22 attraverso CCR4; pertanto, abbiamo determinato l'espressione CCR4 su^entrambe le cellule CD4 - T e ILC2 per citometria di flusso. Mentre è ben noto che il CD4 specifico dell'OVA^- le cellule T helper esprimono CCR4, meno è noto dell'espressione di CCR4 su ILC2. La fi.......

Discussione

Qui, presentiamo un metodo ben consolidato per valutare la migrazione indotta dalla chemiocinetta dei linfociti in un sistema di trasmigrazione ex vivo. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo, il primo dei quali è verificare l'espressione del corretto recettore della chemiochina sulle cellule immunitarie nell'esperimento. Nelle nostre mani, abbiamo scelto CCR4 a causa del corpo della letteratura che sottolinea l'importanza di CCR4 sulle cellule T helper Th2 nell'infiammazione allergica. L'infiammazione indotta d.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	15250061
siringa da 1 mL	BD Bioscience	329424	Siringhe U-100 Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillina-Streptomicina, L-Glutammina	Gibco	10378-016	Diluire a 1x in terreno RPMI
15 mL provette coniche	Olympus Plastics	28-101	provette in polipropilene
3 μ m inserti transwell	Genesee Scientific	25-288	piastra a 24 pozzetti contenente 12 inserti transwell
3x fissativo stabilizzante	BD Pharmigen	338036	Preparare 1x soluzione secondo il protocollo del produttore
mL di provette in polistirene	STEM Cell Technologies	38007
provette coniche da 50 mL	Provette
Olympus Plastics 28-106 in polipropilenemagnete a 8 camere di facile separazione	STEM Cell Technologies	18103
ACK Lysing Buffer Life	Technologies Corporation	A1049201
Filtro cellulare avanzato, 40 μ m	Rete di nylon Genesee Scientific	25-375	, 40 μ m filtri
Idrossido di alluminio, grado reattivo	Sigma-Aldrich	239186-25G	20 mg/mL
anti-topo CCR4; Biolegend coniugato con APC		131211	0,5 μ g/test
anti-topo CD11b	BD Pharmigen	557396	0,5 μ g/test
anti-topo CD11c; PE eFluor 610	Thermo-Fischer Scientific	61-0114-82	0,25 μ g/test
anti-topo CD16/32, blocco Fc	BD Pharmigen	553141	0,5 μ g/test
anti-topo CD19; APC-eFluor 780 coniugato	Thermo-Fischer Scientific	47-0193-82	0,5 μ g/test
anti-topo CD3; PE Cy 7-coniugato	BD Pharmigen	552774	0,25 μ g/test
anti-topo CD45; PE coniugato	BD Pharmigen	56087	0,5 μ g/test
anti-topo ICOS (CD278)	BD Pharmigen	564070	0.5 μ g/test
anti-topo NK1.1 (CD161);	BD Pharmigen	553164	0,25 μ g/test
anti-topo ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 coniugato	Biolegend	145311	0,5 μ g/test
Contatore di cellule automatizzato	BIORAD	1450102
Dissociatore automatico	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
Albumina sierica bovina, polvere liofilizzata	Sigma-Aldrich	A2153-10G	0,5% in
clidi contacellule	BIORAD 1450015
Uovo di gallina Ovoalbumina, grado V	Sigma-Aldrich	A5503-10G	500 μ g/mL
di collagenasi, tipo 1, filtrato	Worthington Biochemical Corporation	CLSS-1, acquistare in 5 fiale da 50 mg (LS004216)25	U/mL in
perle di compensazione	Affymetrix	01-1111-41	1 goccia per provetta di controllo
Provette di dissociazione	MACS Miltenyi Biotec	130-096-335
FACS Buffer	BD Pharmigen	554657	1x PBS + 2% FBS, con sodio azide; immagazzinato a 4 ° C
Calore Inattivato-FBS	Genesee Scientific	25-525H	10% in RPMI completo & Mouse per mezzi di espansione ILC2
CCL17	GenScript	Z02954-20	da 50 ng/mL
CCL22	GenScript	Z02856-20	da 50 ng/mL
Kit per l'arricchimento delle cellule T CD4+	STEM Cell Technologies	19852
Mouse IL-2	GenScript	Z02764-20	da 20 ng/mL
	Tecnologie per le cellule staminali	19842
staminali	IL-33 ricombinanti di topo	Tecnologie 78044	20 ng/mL
RPMI	Life Technologies Corporation	22400071
Tampone di separazione	Tecnologie delle cellule staminali	20144	1x PBS + 2% FBS; conservato a 4 gradi C
Nebulizzatore e camera per piccoli animali	Data Sciences International
Soluzione salina sterile	Baxter	2F7124; NDC 0338-0048-04	Cloruro di sodio allo 0,9%

5 coniugato con FITC RPMI senza siero RPMI Mouse Mouse Kit di arricchimento ILC2 per mouse Cellule