Articolo metodologico

Valutazione emodinamica invasiva per il sistema ventricolare destro e l'ipertensione arteriosa polmonare indotta dall'ipossia nei topi

DOI:

10.3791/60090

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24 ottobre 2019

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1Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluation for Cardiovascular Implant Materials, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Centre for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Laboratory Animal Center, Peking University, 3Center of Cardiac Surgery for Adults, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Centre for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per eseguire una valutazione emodinamica invasiva del ventricolo destro e dell'arteria polmonare nei topi utilizzando un approccio chirurgico a torace aperto.

Abstract

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L'ipertensione arteriosa polmonare (PAH) è un disturbo cardiopolmonare cronico e grave. I topi sono un modello animale popolare utilizzato per imitare questa malattia. Tuttavia, la valutazione della pressione ventricolare destra (RVP) e della pressione dell'arteria polmonare (PAP) rimane tecnicamente impegnativa nei topi. RVP e PAP sono più difficili da misurare rispetto alla pressione ventricolare sinistra a causa delle differenze anatomiche tra il sistema del cuore sinistro e quello destro. In questo articolo, descriviamo un metodo stabile di misurazione emodinamica del cuore destro e la sua convalida utilizzando topi sani e PAH. Questo metodo si basa sulla chirurgia toracica aperta e supporto di ventilazione meccanica. È una procedura complicata rispetto alle procedure del torace chiuso. Mentre un chirurgo ben addestrato è richiesto per questo intervento chirurgico, il vantaggio di questa procedura è che può generare entrambi i parametri RVP e PAP allo stesso tempo, quindi è una procedura preferibile per la valutazione dei modelli Di PAH.

Introduzione

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L'ipertensione arteriosa polmonare (PAH) è un disturbo cardiopolmonare cronico e grave con elevazione della pressione dell'arteria polmonare (PAP) e pressione ventricolare destra (RVP) causata dalla proliferazione cellulare e dalla fibrosi di piccole arterie polmonari 1. Cateteri dell'arteria polmonare, chiamati anche cateteri Swan-Ganz2, sono comunemente utilizzati nel monitoraggio clinico di RVP e PAP. Inoltre, un sistema di monitoraggio PAP wireless è stato utilizzato clinicamente3,4,5. Per imitare la malattia per lo studio nei topi, viene utilizzato un ambiente ipossico per simulare le manifestazioni cliniche umane della PAH6. Nella valutazione del PAP negli animali, gli animali di grandi dimensioni sono relativamente facili da monitorare attraverso cateteri dell'arteria polmonare utilizzando la stessa tecnica dei soggetti umani, ma piccoli animali come ratti e topi sono difficili da valutare a causa delle loro piccole dimensioni corporee. La misurazione emodinamica del sistema ventricolare destro nei topi è possibile con una dimensione ultrapiccola 1 Catetere Fr7. Un metodo per misurare RVP e PAP nei topi è stato riportato nella letteratura8,9, ma la metodologia manca di una descrizione dettagliata. RVP e PAP sono più difficili da misurare rispetto alla pressione ventricolare sinistra a causa delle differenze anatomiche tra il sistema cardiaco sinistro e destro.

Per ottenere entrambi i parametri PAP e RVP nello stesso mouse, descriviamo un approccio basato su chirurgia a torace aperto per le misurazioni emodinamiche del cuore destro, la sua convalida con topi sani e PAH, e come evitare di generare dati artificiali durante il complicato open-chest chirurgia. Anche se questa tecnica è meglio eseguita da un chirurgo ben addestrato, ha il vantaggio di essere in grado di valutare PAP e RVP nello stesso mouse.

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Protocollo

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Il protocollo sugli animali è stato rivisto e approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso il Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College (NO.0000287). Gli animali sperimentali sono stati alloggiati e nutriti secondo le linee guida del benessere degli animali in Cina.

NOTA: i topi C57BL di età di otto-12 settimane erano alloggiati in un ambiente con un ciclo di luce scuro/12 h da 12 h. I topi PAH sono stati alloggiati per 4 settimane sotto una concentrazione di ossigeno del 10%, mantenuti da una camera ipossia controllata dall'ossigeno per indurre ipertensione polmonare, e topi di controllo sono stati alloggiati nell'aria ambiente (21% di ossigeno) in condizioni identiche. Le misurazioni RVP e PAP sono state eseguite alla fine delle 4 settimane di sfida di ipossia.

1. Preparazione preoperatoria

  1. Immergere il catetere del trasduttore di pressione (dimensioni: 1 Fr) in 0,9% salina a temperatura ambiente per almeno 30 min prima dell'esperimento emodinamico.
  2. Filtrare la soluzione 2,2,2-Tribromoethanolo con filtro 0,22 m e conservarlo in frigorifero a 4 gradi.
  3. Preparare strumenti di chirurgia pulita e forniture come guanti per la chirurgia.
  4. Preparare 10 mL di 1,0% soluzione enzimatica digestiva per la pulizia del catetere.
  5. Collegare il catetere del trasduttore di pressione a un sistema di volume di pressione.
  6. Calibrare il trasduttore di pressione prima di ottenere misurazioni della pressione per ogni topo.
    1. Ruotare la manopola di calibrazione su 0 mmHg e 25 mmHg per inviare un segnale di pressione di verifica al software di acquisizione dati e configurare l'impostazione di calibrazione nel software.
    2. Ruotare la manopola su Trasduttore e regolare la manopola Saldo su linea di base a zero.
  7. Impostare uno stereoscopio standard e una tabella chirurgica di piccoli animali controllata a temperatura per il mantenimento della temperatura corporea durante l'intervento chirurgico.
  8. Impostare un sistema di illuminazione della luce per la microchirurgia per fornire abbastanza luce sull'area chirurgica.

2. Chirurgia open-chest e misurazione emodinamica

  1. Anestesia topi con 250 mg/kg di 2,2,2 Tribromoetanolo tramite iniezione intraperitoneale (i.p.). Se necessario, ripetere dosi supplementari a 1/3 a 1/2 della dose originale durante la procedura.
  2. Rimuovere la pelliccia del torace e del collo con un rasoio e una lozione per la rimozione dei peli (Figura 1A, 2A).
  3. Fissare ogni topo in posizione supina su una tavola chirurgica animale piccolo controllato a temperatura per aiutare a mantenere la temperatura corporea (37 gradi centigradi) durante l'intervento chirurgico.
  4. Pulire il sito chirurgico con il 70% di etano.
  5. Una volta che l'anestesia è in vigore, confermare un'adeguata induzione dell'anestesia utilizzando un pizzico di dita dei dei idi.
  6. Fare un'incisione mediana sulla pelle del collo (Figura 1A).
  7. Dissezionare il muscolo scheletrico utilizzando pinze curve ed esporre la trachea (Figura 1B, 1C).
  8. Eseguire l'intubazione attraverso la bocca utilizzando un catetere di guaina per via endovenosa modificato da 22 G. Verificare che il tubo è nella trachea utilizzando pinze (Figura 1D).
  9. Collegare il tubo a un piccolo ventilatore animale. Calcolare e impostare la frequenza respiratoria e il volume delle maree in base al peso corporeo in base al manuale dell'utente del ventilatore10. Ad esempio, impostare la frequenza respiratoria su 133/min e il volume delle maree su 180 per un topo da 30 g in base al calcolo descritto.
  10. Fissare il tubo per la ventilazione con nastro adesivo.
  11. Confermare un'adeguata induzione dell'anestesia utilizzando un pizzico di dita dei dei idi.
  12. Fare un'incisione mediana sulla pelle del torace e sezionare attentamente i muscoli del torace con uno strumento di cauteria (Figura 2B, 2C).
  13. Tagliare lo sterno utilizzando le forbici al centro ed esporre la cavità toracica (Figura 2D).
  14. Prevenire qualsiasi sanguinamento utilizzando lo strumento cautery durante la procedura di chirurgia toracica aperta.
  15. Esporre il ventricolo destro con i retrattili (Figura 2E).
  16. Inserire il catetere del trasduttore a pressione imbevuto di saline attraverso un piccolo tunnel creato con un ago da 25 G nel ventricolo destro per misurare RVP (Figura 2F e Figura 3A, 3C).
  17. Tenere il cavo del catetere e attraversare la valvola polmonare in modo coassiale con l'arteria polmonare. Osservare la forma d'onda di pressione e ottenere un segnale PAP stabile (Figura 3B, 3D).
  18. Registrare i dati emodinamici utilizzando il sistema di acquisizione dei dati e il software.
  19. Dopo le misurazioni finali, l'eutanasia i topi umanamente attraverso l'iniezione i.p. di una dose in eccesso di 2,2,2-Tribromoethanol soluzione.
  20. Rimuovere con attenzione il catetere dal sistema cardiaco destro e metterlo in una siringa da 1 mL contenente 1% soluzione enzimatica digestiva.
  21. Utilizzare acqua distillata per lavare continuamente il catetere e conservarlo nella scatola originale.

3. Analisi dei dati per l'emodinamica

NOTA: i dati emodinamici sono stati registrati e analizzati utilizzando il software di analisi11 (Tabella dei materiali).

  1. Per ogni mouse, selezionare almeno 10 cicli di heartbeat continui e stabili senza rumore per ottenere i dati medi dei dati RVP o PAP per ogni parametro.
  2. Utilizzare il test tdi Student per confrontare i normali gruppi di controllo dell'aria e ipossia. NOTA: p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. I dati sono presentati come la media : SD.

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Risultati

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Il catetere del trasduttore di pressione è stato inserito nel ventricolo destro (Figura 3A) attraverso un tunnel espanso da un ago da 25 G ed è stata ottenuta una tipica forma d'onda RVP (Figura 3C). Il catetere è stato continuamente regolato e lentamente avanzato e mantenuto nello stesso asse dell'arteria polmonare mentre passa attraverso la valvola polmonare (Figura 3B). Quando il...

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Discussione

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L'intubazione tracheale è il primo passo importante per interventi chirurgici a torso aperto. Il metodo classico di intubazione tracheale per piccoli animali, come ratti o topi, prevede di fare un'incisione a forma di T sulla trachea e di inserire direttamente tubi tracheali di tipo Y nella trachea. In pratica, troviamo che questo metodo non è facile durante il funzionamento. Il tubo tracheale di tipo Y è troppo grande per i piccoli animali e forma un angolo con la trachea. Così, è difficile fissare il tubo in atto. Inol...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è sostenuta dal Postgraduate Education and Teaching Reform Project del Peking Union Medical College (10023-2016-002-03), dal Fuwai Hospital Youth Fund (2018-F09) e dal Director Fund of Beijing Key Laboratory of Pre-Clinical Research and Valutazione dei materiali impiantati cardiovascolari (2018-PT2-

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,2,2-tribromoetanoloSigma-AldrichT48402-5Gper anestesia
Regolatore di temperatura per animaliPhysitemp Instruments, Inc.TCAT-2LVPer il controllo della temperatura
Pinze di dissezioneFine Science Tools, Inc.11274-20Per chirurgia
Sistema di cauterizzazione GeminiGEM 5917Per chirurgia
Catetere endovenoso (22G)BD angiocath381123Per intubazione
LabChart 7.3ADInstrumentsPer l'analisi dei dati
Sistema di illuminazione della luceOlympusPer chirurgia
Catetere Mikro-TipMillar Instruments, Houston, TXSPR-1000Per la misurazione della pressione
Sistemi di pressione-volume Millar MillarInstruments, Houston, TXMVPS-300Per la misurazione della pressione
Controller O2 e camera per ipossiaBiospherixProOx 110Per l'ipossia cronica
Sistema di acquisizione dati PowerLabStrumenti avanzatiPowerLab 16/30Per la registrazione dei dati
ForbiciStrumenti di scienza fine, Inc.14084-08Per chirurgia
Ventilatore per piccoli animaliApparecchio HarvardMini-Vent 845Per chirurgia
StereomicroscopioOlympusSZ61Per chirurgia
Nastro chirurgico3MPer chirurgia
Terg-a-zyme enzimaSigma-AldrichZ273287-1EAPer la pulizia del catetere

Riferimenti

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  1. Humbert, M., et al. Advances in therapeutic interventions for patients with pulmonary arterial hypertension. Circulation. 130 (24), 2189-2208 (2014).
  2. Chatterjee, K. The Swan-Ganz catheters: past, present, and future: a viewpoint. Circulation. 119 (1), 147-152 (2009).
  3. Adamson, P. B., et al. CHAMPION trial rationale and design: the long-term safety and clinical efficacy of a wireless pulmonary artery pressure monitoring system. Journal of Cardiac Failure. 17 (1), 3-10 (2011).
  4. Abraham, W. T., et al. Wireless pulmonary artery haemodynamic monitoring in chronic heart failure: a randomised controlled trial. The Lancet. 377 (9766), 658-666 (2011).
  5. Adamson, P. B., et al. Wireless pulmonary artery pressure monitoring guides management to reduce decompensation in heart failure with preserved ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 7 (6), 935-944 (2014).
  6. Shatat, M. A., et al. Endothelial Kruppel-like Factor 4 modulates pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (3), 647-653 (2014).
  7. SPR-1000 Mouse Pressure Catheter. , Available from: https://millar.com/products/research/pressure/single-pressure-no-lumen/spr-1000 (2019).
  8. Tabima, D. M., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Measuring right ventricular function in the normal and hypertensive mouse hearts using admittance-derived pressure-volume loops. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (6), 2069-2075 (2010).
  9. Skuli, N., et al. Endothelial deletion of hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) alters vascular function and tumor angiogenesis. Blood. 114 (2), 469-477 (2009).
  10. Harvard Inspira Advanced Safety Ventilator User's Manual. , Available from: http://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Inspira_557058_9.pdf. (2019).
  11. LabChart. , Available from: https://www.adinstruments.com/products/labchart?creative=290739105773_keyword=labchart_matchtype=e_network=g_device=_gclid=CjwKCAjwxrzoBRBBEiwAbtX1n42I2S06KmccVncUHkmExU8KKOXXREyzx8bvTrxYMSze-ooE0atcbRoCliwQAvD_BwE (2019).
  12. Marius, M. H., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 62 (25), 42-50 (2013).
  13. Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
  14. Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
  15. Chen, W. C., et al. Right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice. Journal of Visualized Experiments. (71), 50023(2013).
  16. Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic characterization of rodent models of pulmonary arterial hypertension. Journal of Visualized Experiments. (110), 53335(2016).
  17. Chen, M. Berberine attenuates hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension via bone morphogenetic protein and transforming growth factor-β signaling. Journal of Cellular Physiology. , (2019).
  18. Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. Methods in Molecular Biology. vol 1816. Ishikawa, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).

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