Adsordimento molecolare indotto dalla luce delle proteine utilizzando il sistema PRIMO per micro-patterning per studiare le risposte cellulari alle proteine a matrice extracellulare

Sommario

Il nostro obiettivo generale è quello di capire come le cellule percepiscono segnali extracellulari che portano alla crescita assonale diretta. Qui, descriviamo la metodologia dell'adsordimento molecolare delle proteine indotta dalla luce, utilizzata per produrre micromodelli definiti di componenti della matrice extracellulare al fine di studiare eventi specifici che regolano la crescita degli assoni e la ricerca del percorso.

Abstract

Le cellule percepiscono una varietà di segnali extracellulari, tra cui la composizione e la geometria della matrice extracellulare, che viene sintetizzata e rimodellata dalle cellule stesse. Qui, presentiamo il metodo di adsortioni molecolari indotti dalla luce delle proteine (LIMAP) utilizzando il sistema PRIMO come tecnica di modellazione per produrre substrati esmatici a matrice extracellulare (ECM) micromodellati utilizzando una singola o combinazione di proteine. Il metodo consente la stampa di modelli ECM in risoluzione micron con eccellente riproducibilità. Forniamo un protocollo passo-passo e dimostriamo come questo può essere applicato per studiare i processi di ricerca del percorso neuronale. LIMAP presenta vantaggi significativi rispetto ai metodi di microstampa esistenti in termini di facilità di modellazione di più componenti e la possibilità di generare un modello con qualsiasi geometria o gradiente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare il contributo di quasi tutte le componenti chimiche verso il destino cellulare e il comportamento cellulare. Infine, discutiamo di questioni comuni che possono sorgere e di come queste possano essere evitate.

Introduzione

Negli ultimi anni, le scienze biologiche hanno sempre più fatto uso dei progressi forniti dalle scienze dei materiali. Un esempio importante è il micropatterning dei substrati, che può essere utilizzato per studiare le risposte cellulari come la proliferazione cellulare^1,2Differenziazione^3,4,5,6, migrazione cellulare^7,8,9e la ricerca del percorso^10,11. Ci sono una serie di tecniche disponibili che consentono il micro-patterning dei substrati, come la fotochimica eccitata multifotone¹², nanolitografia a2-penna AFM¹³, stampa diretta per pin e getto d'inchiostro¹⁴, litografia a fascio di elettroni¹⁵o microfluidica¹⁶. Tuttavia, due tecniche ampiamente utilizzate in campo biologico sono la stampa di microcontatti^17,18,19o patterning assistiti da laser³(Figura 1). La modellazione assistita da laser è considerata per fornire risultati più affidabili in termini di stabilità di proteine e PEG e confinamento cellulare sui modelli, rispetto alla stampa a microcontatto²⁰. Un approccio più nuovo per il micro-modello descritto qui è l'uso di adsorbimento molecolare indotta dalla luce delle proteine²¹(LIMAP,Figura 1 d) utilizzando un sistema disponibile in commercio (PRIMO,Tabella dei materiali). Ognuno dei metodi presenta vantaggi e limitazioni descritti brevemente di seguito. La stampa microcontact utilizza stampi PDMS (timbri) con le microcaratteristiche desiderate generate da master litografati. I francobolli vengono incubati con una proteina prescelta che viene poi trasferita (stampata) sul substrato di coltura cellulare¹⁸(Figura 1 un). La patterning assistita da laser utilizza la luce UV per fendere una pellicola anti-fouling^22,23,24,25, esponendo regioni che possono essere successivamente rivestite con la proteina di interesse (Figura 1 B). Mentre la risoluzione ottenuta con approcci foto-patterning è nella gamma micron^25,26, la maggior parte di queste tecniche richiede una fotomaschera, sia a contatto con il campione, sia situata nel piano oggetto dell'obiettivo del microscopio^23,27,28. I requisiti per le maschere sia nella stampa microcontatto che nella foto-patterning possono essere una limitazione; sono necessarie maschere specifiche per ogni motivo geometrico e dimensione, che può essere costoso e richiedere molto tempo per generare. A differenza di queste tecniche, LIMAP non richiede una maschera (Figura 1 d). L'utilizzo del sistema PRIMO per LIMAP può richiedere costi all'inizio perché richiede l'acquisto di attrezzature. Tuttavia, il software open-source viene utilizzato per progettare modelli di qualsiasi geometria desiderata, dando molta più libertà e consentendo esperimenti più complessi, tra cui l'uso di gradienti di concentrazione proteica. Il laser PRIMO è controllato e diretto da un dispositivo a microspecchio a controllo digitale (DMD) per creare modelli in un numero qualsiasi di geometrie definite dall'utente. LIMAP richiede che la superficie di coltura sia rivestita con molecole che impediscono l'attaccamento cellulare. Il glicole in polietilene (PEG) è più comunemente usato come tale reagente "antifouling"; forma una densa pellicola anti-adesiva sulla superficie di vetro o plastica²⁹. Successivamente, viene aggiunto un foto-intatore che consente di rimuovere la pellicola PEG con alta precisione attraverso un meccanismo di fotocissione³⁰dall'esposizione locale alla luce UV sotto il controllo del DMD. Queste regioni prive di PEG possono essere rivestite con proteine che assorbenano alla superficie incisa al laser, generando un micro-modello. Variando la potenza laser, diverse quantità di PEG possono essere rimosse dalla superficie consentendo all'utente di generare gradienti proteici. La rimozione del PEG e la procedura di rivestimento possono essere ripetute per creare modelli con due o più proteine distinte nello stesso micro-pozzo²¹. I micromodelli generati forniscono superfici adesive per le cellule, consentendo lo studio del comportamento cellulare. Nei nostri studi, utilizziamo micro-patterning per studiare il percorso neurite o assone di una linea cellulare neuronale (CAD (Cathecholaminergic-a differenziato) cellule³¹) o i neuroni primari del ganglio della radice dorsale-rata (DRG), rispettivamente. In questo articolo viene descritto un protocollo passo-passo per LIMAP (Figura 2) utilizzando il sistema PRIMO disponibile in commercio e il relativo software Leonardo. Dimostriamo come può essere utilizzato per la generazione di modelli con geometrie definite e proteine multiple, che usiamo per studiare la ricerca del percorso assonale. Discutiamo di questioni comuni che possono sorgere e di come queste possano essere evitate.

Protocollo

1. Progettazione di modelli di pattern

NOTA: i modelli per la modellazione vengono generati con il software di disegno digitale (Tabella dei materiali). Disegnare in diversi livelli di grigio determinerà l'intensità del laser. L'utilizzo di software per progettare modelli di pattern consente una rapida generazione di modelli con qualsiasi geometria e gradienti desiderati (Figura 3).

1. Disegnare digitalmente il modello di pattern desiderato utilizzando il software di disegno. Selezionare una dimensione dell'immagine di 1824 pixel di lunghezza e 1140 pixel di larghezza (che in questo studio corrisponde a 415 lunghezza m e 260 m di larghezza). Salvare il modello di modello come file Tiff a 8 bit.
   NOTA: un protocollo passo-passo per generare modelli è disponibile su richiesta al marchio che commercializza l'apparecchiatura di micro-patterning (Tabella dei materiali).

2. Pulizia al plasma

NOTA: I risultati ottimali richiedono la pulizia al plasma delle superfici prima della ripetizione, che rimuoverà tutta la materia organica e attiverà la superficie. Nel caso di specie, l'aria ambiente è sufficiente per l'attivazione della superficie. Un detergente al plasma (Tabella dei materiali) è stato utilizzato con una pressione di processo di 1000-1300 mTorr e una potenza di 29,6 W per 1-5 min.

1. Utilizzare il piatto/es fondo di vetro con una dimensione del pozzo interno di 20 mm e uno spessore del vetro di 0,16-0,19 mm. Per testare più condizioni, utilizzare un piatto di fondo in vetro a 6 pozzetti. In caso contrario, utilizzare un singolo piatto di fondo di vetro (Tabella dei materiali).
   NOTA: un protocollo passo-passo per la pulizia del plasma è disponibile su richiesta al marchio che commercializza le apparecchiature di pulizia del plasma (Tabella dei materiali).

3. Passività

NOTA: Questo passaggio genera una pellicola antifouling che impedisce l'adsorbimento delle proteine sulla superficie del vetro. PEG offre un'elevata resistenza all'adsorbimento delle proteine²⁹ come agente antifouling. LIMAP utilizza un foto-initiator per rimuovere localmente PEG attraverso la fotocissione UV. Le proteine/s di interesse saranno poi adsorbire a queste superfici prive di PEG²¹, generando micro-modelli.

1. Passivazione con PLL-PEG
   1. In condizioni sterili, tagliare gli stencil PDMS (vedere Figura 4A, B e Tavolo dei Materiali) per assicurarsi che si inseriscano nel pozzo inferiore inferiore inferiore di vetro interno, e rimuovere i micro-pozzi interni con pinze sterili. Attaccare gli stencil sul pozzo di vetro utilizzando pinze.
   2. Assicurarsi che gli stencil si attacchino saldamente sul pozzo del vetro, impedendo la formazione di bolle d'aria che possono causare perdite durante il processo di passività.
      NOTA: gli stencil PDMS possono anche essere fabbricati internamente utilizzando i protocolli pubblicati^18,32.
   3. Preparare la soluzione PLL-PEG(Tabella dei materiali, 0,1 mg/mL) in salina con buffer fosfato (PBS). Aggiungete 20 l di PLL-PEG ad ogni micro-bene e incubate a temperatura ambiente, per 1 ora.
   4. Togliere 15 l di PLL-PEG dai micropozzi e lavarli cinque volte con 20 -L di PBS (Tabella dei Materiali) senza lasciarli asciugare.
      NOTA: Lasciare sempre circa 5 l di PBS tra i lavatori. Dato il loro piccolo volume, i micro-pozzi sono particolarmente sensibili all'essiccazione. L'essiccazione si tradurrà in micromodelli di scarsa qualità.
   5. Conservare il piatto di coltura in PBS (3 mL per pozzo) a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 giorni o continuare con il passaggio successivo (passaggio 3.1.5).
   6. Togliere 18 l di PBS da un singolo micro-pozzetto (ad esempio, il micro-bene in alto a sinistra, vedere Figura 4D), aggiungere 5 :L di foto-initiator (PLPP, Table of Materials) e lasciare 20 L di PBS nei restanti micro-pozzi. Questo micro-bene con PLPP verrà utilizzato per creare un modello di riferimento (vedere Figura 4D,E) durante la fase di calibrazione del sistema (passaggio 4). Mantenere PLPP protetto dalla luce.
2. Passivazione con PEG-SVA di lunga durata
   NOTA: Per generare la superficie antiadesiva si può utilizzare: 1) un PEG collegato a Poly-L-Lysine (PLL-PEG, passo 3.1) o 2) un N-idxisuccinimide PEG-succinate (PEG-SVA). La decisione di scegliere una o l'altra opzione di passività dipende dalle opzioni di archiviazione (vedere il passaggio 10). I piatti di coltura incubati con PEG-SVA richiedono una doppia quantità di passività e tempo di fotopatterning.
   1. Preparare gli stencil come descritto nel passaggio 3.1.1.
   2. Aggiungete ad ogni micro-bene 20 - L di 0,01% Poly-L-Lysine (PLL, Table of Materials) e incubate a temperatura ambiente per 30 min al precoat con PLL.
   3. Togliere 15 l di PLL dai micro-pozzi e lavarli tre volte con 20 -L di 1 M di tampone HEPES (Tabella dei materiali) senza lasciare asciugare i pozzi.
      NOTA: Lasciare sempre circa 5 unità di HEPES o PBS tra i fumi. Dato il loro piccolo volume, i micro-pozzi sono particolarmente sensibili all'essiccazione. L'essiccazione si tradurrà in micromodelli di scarsa qualità.
   4. Preparare la soluzione PEG-SVA. La soluzione PEG-SVA (50 mg/mL nel buffer HEPES 1M) deve essere preparata fresca ogni volta immediatamente prima dell'uso. Preparare 20 litri di PEG-SVA per micro-bene.
   5. Il buffer HEPES deve avere un pH compreso tra 8-8,5. Testare il pH HEPES prima di preparare la soluzione PEG-SVA con carta pH. Pesare PEG-SVA in un tubo centrifuga utilizzando una bilancia di precisione. Aggiungere il buffer HEPES e il vortice 30 s fino a sciogliere. PEG-SVA è completamente dissolto quando la soluzione è trasparente.
      NOTA: SVA è l'ester che consente il legame del PEG al PLL rivestito in precedenza. Una volta che il buffer HEPES viene aggiunto al PEG-SVA, l'SVA ha un'emivita di 15 min e deve essere utilizzato immediatamente.
   6. Aggiungete 20 gradi di soluzione PEG-SVA ad ogni micro-bene e incubate a temperatura ambiente, per 1 h. Rimuovete 15 - L di PEG-SVA dai micropozzi e lavatevi cinque volte con 20 gradi di PBS (Table of Materials)senza lasciare asciugare i pozzi.
   7. Preparare il piatto di coltura per lo stoccaggio a lungo termine (fino a 1 mese, vedere il passaggio 10.2) o procedere al passaggio successivo (passaggio 3.2.8).
   8. Togliere 18 l di PBS da un singolo micro-po'(ad esempio, il micro-bene in alto a sinistra, vedere Figura 4D),aggiungere 5 -L di PLPP (Tabella dei materiali) e lasciare 20 gradi di PBS nei restanti micro-pozzi. Questo micro-pozzo sarà utilizzato per creare un modello di riferimento (vedi Fi gure 4D, E). Assicurarsi che il PLPP sia omogeneo su tutta la superficie del micro-pozzo. Mantenere PLPP protetto dalla luce.

4. Calibrazione del sistema

NOTA: In questi passaggi, la messa a fuoco del laser verrà regolata in base al particolare tipo di piatto di coltura (passaggio 4.1). Un modello di riferimento sarà generato in un solo micro-bene (passaggio 4.2) seguito da incubazione con una soluzione proteica (passaggio 4.3) per garantire le condizioni ottimali di messa a fuoco del laser (passaggio 4.4), necessarie per ottenere modelli taglienti e definiti.

1. Calibrazione laser
   NOTA: Durante il processo di calibrazione, un'immagine laser di calibrazione verrà proiettata su una superficie di vetro fluorescente evidenziata (calibrazione ben, contrassegnata da un evidenziatore fluorescente, Figura 4C),che deve essere messa a fuoco microscopio.
   1. Utilizzare un evidenziatore fluorescente (Table of Materials) per contrassegnare un pozzo di vetro interno vuoto.
      NOTA: Il pozzo di calibrazione deve avere lo stesso spessore del vetro (0,16-0,19 mm) del piatto di coltura su cui verranno generati i micromodelli. Se viene utilizzato un piatto di fondo in vetro a 6 pozzetti, un pozzo vuoto può essere utilizzato per la calibrazione e deve essere contrassegnato con evidenziatore fluorescente in condizioni sterili.
   2. Accendere il microscopio, lo stadio e il computer. Accendere l'apparecchiatura di micro-modellazione PRIMO, aprire Micro-manager e il software Leonardo. Il software Leonardo è gestito tramite Micro-manager in Plugins. Controllare i numeri di marche/catalogo di attrezzature e software in Table of Materials.
   3. Nel menu iniziale di Leonardo, selezionare Calibra. Verificare che il cubo del filtro PRIMO dedicato si trova nella posizione corretta (percorso ottico) nella torretta del filtro; selezionare l'obiettivo 20X (0,75 DIC S Plan Fluor, nessun anello di fase) sia sul microscopio che sul software Leonardo.
      NOTA: questo protocollo è regolato alla versione 4.4 di Leonardo. Il protocollo potrebbe essere necessario regolare per altre versioni.
   4. Posizionare bene la calibrazione evidenziata in precedenza (Figura 4C) sopra l'obiettivo. Selezionare il percorso della fotocamera. Regolare la messa a fuoco obiettiva fino a quando la proiezione laser sia del logo PRIMO che della linea di tag Prendersi cura delle celle a fuoco.
   5. Lasciare il tempo di esposizione della fotocamera predefinito a 25 ms. Regolare l'intensità del laser per vedere la lettera I dalla proiezione del logo PRIMO in colore grigio e il resto delle lettere in bianco.
   6. Registrare la posizione z del piano focale (altezza dell'obiettivo al campione) in un secondo momento indicato come posizione z di calibrazione. Questa sarà un'approssimazione alla messa a fuoco ottimale ottenuta dopo la generazione del modello di riferimento (vedere il passaggio 4.2-4.4).
2. Modello di riferimento
   1. Posizionare il piatto di coltura con il micro-bene contenente il foto-initiator (modello di riferimento micro-bene, Figura 4D) sopra l'obiettivo e selezionare Modello ora nel software Leonardo.
   2. Visualizza il bordo del micro-pozzo con la luce trasmessa attraverso la fotocamera e scegli il simbolo del ROI dal menu a destra. Impostare il diametro del cerchio ROI a 4000 m e allineare il bordo del ROI digitale con il bordo del micro-pozzetto corrente.
   3. Assicurarsi che vi sia una precisa sovrapposizione tra il ROI digitale e il micro-pozzo corrente spostando lo stage intorno ai bordi del micro-bene. La posizione del ROI sarà accoppiata ai movimenti dello stage.
   4. Selezionare Blocca nel software Leonardo per bloccare il ROI nella posizione desiderata. Spegnere la luce trasmessa.
   5. Selezionare PRIMO per caricare il modello di modello desiderato, che verrà proiettato sul ROI come unità di progettazione (vedere La Figura 5). I pattern appariranno in un elenco a discesa denominato Actions e mostrato nel menu Actions (Azioni) del software.
      NOTA: i modelli di pattern devono essere progettati in precedenza (vedere il passaggio 1) e salvati come file Tiff a 8 bit prima di caricare il modello nel software.
   6. Solo un piccolo modello è necessario per il modello di riferimento; ad esempio, 3 righe, 1 colonna (vedere Figura 4E e Figura 5B). Nel menu Replica, impostare il numero desiderato di colonne e righe(Righe nel software Leonardo). Fare clic su Aggiorna per osservare un'anteprima digitale del progetto del motivo.
   7. Impostare la dose laser nel menu Replica. La dose ottimale del laser in questa impostazione e utilizzando PLL-PEG è 1390 mJ/mm².
      NOTA: La potenza del laser può variare da 5 a 7,5 mW/mm². In questo caso, è 7,5 mW/mm², che impiega circa 30 s per progettare ogni unità di progettazione, utilizzando una dose laser di 1390 mJ/mm². Possono essere necessarie dosi laser più elevate se la superficie del piatto di coltura è passiva con PEG-SVA (dose laser circa doppia rispetto a PLL-PEG). Questo deve essere testato in anticipo.
   8. Passare a una regione periferica del micro-bene, (ad esempio, parte superiore) lontano dalla regione principale di interesse per la generazione di pattern (regione centrale) del micro-bene (vedere Figura 4E) e selezionare Blocca. Attendere che venga visualizzato il motivo.
   9. Regolare la messa a fuoco in base alla posizione di calibrazione a z (vedere il passaggio 4.1.6).
      NOTA: Si consiglia di eseguire un'ulteriore fase di calibrazione del sistema se un altro utente sta utilizzando lo stesso microscopio tra i cicli di fotomodellazione.
   10. Selezionare il simbolo Riproduci per iniziare la ripetizione. Assicurarsi che il laser sia acceso nel software. Attendere che il processo di patterning sia terminato. La durata della ripetizione verrà visualizzata nel pannello Tempo stimato. Nella versione software Leonardo 4.4 la patterning viene completata quando tutte le azioni appaiono in blu nel menu Visualizzazione.
3. Incubazione proteica sul modello di riferimento
   1. In condizioni sterili, lavare il micro-bene del modello di riferimento tre volte con 20 -L di PBS per rimuovere il PLPP.
   2. Aggiungere 20 l di proteine ECM con etichetta fluorescente (10 g/mL di laminina, fibronectina o fibrinogeno in PBS, vedere Tabella dei materiali e passo 6) al micro-bene del modello di riferimento. Incubare a temperatura ambiente per 10-20 min (a seconda della proteina) protetto dalla luce (avvolgere il piatto in foglio di alluminio).
   3. Dopo l'incubazione, rimuovere 18 l di soluzione proteica e lavare tre volte con 20 -L di PBS; mantenere i micro-pozzi che non vengono utilizzati per creare un modello di riferimento (vedere Figura 4D,E) in 20 - L di PBS.
4. Visualizzazione e impostazione della messa a fuoco laser ottimale
   1. Visualizzare il modello di riferimento utilizzando un microscopio a epifluorescenza, un obiettivo 20X e un software adatto (controllare il software utilizzato in questo studio in Table of Materials). Il modello di riferimento deve essere visibile nell'area periferica (ad esempio, area del pozzo superiore), in cui è stato generato il modello di riferimento (vedere Figura 4E).
   2. Regolare la messa a fuoco sui bordi del motivo attraverso il tracciato della fotocamera. Registrare la posizione z in base alla migliore messa a fuoco sul modello di riferimento. Questa posizione a z regolata sarà la messa a fuoco laser ottimale utilizzata per la modellazione successiva.

5. Configurazione e fotomodellazione del software

NOTA: Una volta ottenuta la calibrazione del sistema (passaggio 4), l'utente caricherà i modelli di pattern desiderati (configurazione del modello, Figura 5) per il fotopatterning, con la possibilità di generare modelli per una o più proteine in ogni micro-bene. Il processo di micro-patterning prevede la fotomodellazione e le fasi di incubazione delle proteine (vedere la figura 2).

1. In condizioni sterili, rimuovere 18 gradi l di PBS da tutti i micropozzi e aggiungere 5 L di PLPP ad ogni micro-bene. Assicurarsi che il PLPP sia omogeneo su tutta la superficie dei micropozzi.
2. Posizionare il piatto di coltura con il modello di riferimento micro-bene (Figura 4D,E) sopra l'obiettivo e selezionare Modello ora nel software Leonardo.
3. Visualizza il micro-pozzo con la luce trasmessa attraverso il percorso della fotocamera e scegli il simbolo del ROI. Impostare il diametro del ROI a 4.000 m e sovrapporsi al bordo del ROI digitale fino al bordo del micro-pozzetto corrente. Selezionare Blocca.
   NOTA: la forma e il diametro del ROI dipendono dal design e dalle dimensioni dello stencil PDMS utilizzato. Ad esempio, se si utilizzano 5.000 stencil quadrati PDMS da 5.000 m, utilizzare un ROI quadrato di 5.000 m.
4. Ripetere il passo sovrapposto (passaggio 5.3) per ogni micro-pozzetto del piatto. Al termine, spegnere la luce trasmessa.
5. Navigare al centro del micro-bene del modello di riferimento, lontano dall'area del modello di riferimento e selezionare PRIMO per caricare il modello di modello desiderato, che verrà proiettato sul ROI come unità di progettazione (vedere Figura 5). I pattern appariranno in un elenco a discesa denominato Actions e mostrato nel menu Actions (Azioni) del software.
   NOTA: i modelli di pattern devono essere progettati prima dell'esperimento e salvati come file Tiff a 8 bit prima di caricare il modello nel software.
6. Per creare un modello attraverso l'intero micro-bene, l'unità di progettazione deve essere replicata. Un'unità di progettazione copre circa 0,1 mm² dell'area del micro-pozzo. Nel menu Replica, impostare il numero desiderato di colonne e righe (Righe nel software) (vedere la Figura 5).
7. Per generare un motivo continuo, regolare la spaziatura tra colonne e linee; in questo studio, i modelli di strisce continue sono ottenuti utilizzando una spaziatura compresa tra i -20 e i -35 m (spaziatura negativa) tra le colonne. Questa spaziatura negativa crea una sovrapposizione tra le unità di progettazione (Figura 5B,C).
8. Impostare la dose laser nel menu Replica. La dose ottimale del laser in questa impostazione e utilizzando PLL-PEG è 1390 mJ/mm². La durata della ripetizione verrà visualizzata nel pannello Tempo stimato.
   NOTA: In questo caso la potenza del laser è di 7,5 mW/mm^2,impiegando circa 30 s per disegnare ogni unità di progettazione, utilizzando una dose di 1390 mJ/mm². Ad esempio, un'unità di progettazione (0,1 mm²) replicata in 4 colonne e 4 linee (circa 1,6 mm²), richiederebbe 8 min per essere modellata. Possono essere necessarie dosi laser più elevate se la superficie del piatto di coltura è passiva con PEG-SVA (dose laser circa doppia rispetto a PLL-PEG).
9. Selezionare Blocca e attendere che il motivo venga visualizzato virtualmente.
10. Per aggiornare i parametri di un modello, fare clic sull'azionecorrelata , quindi sbloccare e aggiornare i parametri. Selezionare di nuovo Blocca al termine dell'aggiornamento del motivo.
11. La codifica di più proteine nello stesso micro-pozzo (cicli di micro-patterning sequenziali) richiede un allineamento accurato dei modelli. Per ottenere tale allineamento, caricare contemporaneamente tutti i set di modelli di pattern desiderati (modelli di primo e secondo ciclo di fotopattern).
12. Impostare i parametri di replica e dose dei modelli. Dopo aver impostato i parametri, i modelli verranno visualizzati come Azioni nell'elenco Azioni. Salvare questa configurazione di modello come file nel software (vedere Figura 5D).
13. Nell'elenco Azioni selezionare solo le azioni specifiche da ripetere durante il primo ciclo di ripetizione e deselezionare le azioni che verranno modellate durante il secondo ciclo di ripetizione (vedere la figura 5D).
14. Passare all'area in cui è stato prodotto il modello di riferimento nel passaggio 4.2 (ad esempio, area superiore del modello di riferimento micro-bene, vedere Figura 4E). Regolare la messa a fuoco in base alla posizione ottimale a z (ottenuta al punto 4.4).
    NOTA: Si consiglia vivamente di selezionare un sistema di messa a fuoco perfetto sul microscopio utilizzato (se disponibile), che assicura che la posizione ottimale per la modellazione venga mantenuta durante l'intero processo di fotopatterning.
15. Selezionare il simbolo Riproduci per iniziare la ripetizione. La durata della ripetizione verrà visualizzata nel pannello Tempo stimato. Nella versione software Leonardo 4.4 la patterning viene completata quando tutte le azioni vengono visualizzate in blu nel menu Visualizzazione.

6. Incubazione proteica

NOTA: I micropozzi sono incubati con proteine ECM (preferibilmente con etichetta fluorescente). Questi si legheranno solo alle aree in cui PEG è stato scisso attraverso il processo di fotomodellazione descritto nel passaggio 5. Ogni pozzo contiene uno stencil PDMS con 4 micro-pozzi, che permetterà di testare 4 diverse condizioni contemporaneamente, ad esempio, l'incubazione di una proteina diversa in ogni micro-bene (vedere Figura 4D).

1. Utilizzare proteine con etichetta fluorescente (ad esempio, laminina, fibronectina o fibrinogeno coniugata a fluorofori rossi o verdi) per visualizzare i micromodelli (vedere i passaggi 6.7 e 9.4). In alternativa, le proteine senza etichetta adsorbite possono essere visualizzate in fasi successive utilizzando l'immunofluorescenza.
   NOTA: le proteine ECM (ad esempio, la fibronectina) possono essere etichettate utilizzando protocolli esistenti³³ e kit di etichettatura a fluorescenza disponibili in commercio (ad esempio, kit di etichettatura Alexa 488) o acquistati con etichette rhodamina fluorescente laminin-red, vedere Tabella dei materiali).
2. In condizioni sterili, preparare la concentrazione desiderata di proteine ECM (10 g/mL di laminin, fibronectina o fibrinogeno in PBS, vedere Tabella dei materiali e passo 4.3).
   NOTA: Le proteine ECM con etichetta fluorescente sono sensibili alla luce e devono essere protette dalla luce (piatto avvolgente in foglio di alluminio) e devono essere tenute sempre sul ghiaccio.
3. In condizioni sterili, lavare i micropozzi tre volte con 20 gradi di PBS per rimuovere il PLPP.
4. Togliere 18 l di PBS da tutti i micropozzi e aggiungere 20 -L di soluzione proteica ECM ad ogni micro-pozzetto. Incubare a temperatura ambiente, per 20-30 min e proteggere dalla luce.
   NOTA: I tempi ottimali di incubazione del rivestimento possono variare a seconda del tipo e della concentrazione delle proteine.
5. Dopo l'incubazione, rimuovere 15 l di soluzione proteica ECM e lavare i micropozzi tre volte con 20 gradi di PBS.
   NOTA: Lasciare sempre circa 5 l di PBS tra i lavatori.
6. Se la modellazione con una sola proteina (un ciclo di micropatterning), procedere all'immagazzinamento della parabola di coltura (passaggio 10) o alla placcatura cellulare (passaggio 11 e vedere figura 2). Se si esegue un secondo ciclo di micro-patterning con una proteina diversa nello stesso micro-bene, procedere allo stoccaggio del piatto di coltura (passaggio 10) o al blocco di siti di legame non specifici (passaggio 7 e vedere Figura 2).
7. Passaggio di controllo qualità opzionale: visualizzare e immagini modelli stampati utilizzando un microscopio a epifluorescenza prima della placcatura delle cellule. Selezionare i canali fluorescenti appropriati e regolare di conseguenza i tempi di esposizione.
   NOTA: Per confrontare l'intensità di fluorescenza dei modelli tra gli esperimenti, è essenziale utilizzare gli stessi tempi di esposizione per le stesse proteine.

7. Blocco di siti di legame non specifici (solo per più modelli proteici)

NOTA: Micro-patterning con più proteine nello stesso micro-pozzo comporta passaggi di patterning sequenziali (vedere Figura 2). Un agente di blocco (PLL-PEG o BSA) viene aggiunto ai micro-pozzi per prevenire il cross-legare, che si verifica quando la seconda proteina incubata (fase 9) si lega alla prima proteina incubata (passaggio 6), evitando così una miscela di proteine all'interno dei modelli.

1. In condizioni sterili, aggiungere 20 l di PLL-PEG (0,1 mg/mL in PBS) o BSA (1% BSA in PBS) come passaggio di blocco per evitare l'associazione incrociata.
   NOTA: L'efficienza di blocco può variare a seconda della natura delle proteine utilizzate e dell'affinità tra di esse. Si consiglia di testare in anticipo sia PLL-PEG che BSA come agenti di blocco(Figura 10D-I).
2. Incubare l'agente di bloccante a temperatura ambiente per 1 h e proteggere dalla luce. Rimuovere 15 - L di agente di blocco e lavare tutti i micro-pozzi tre volte con 20 -L di PBS. Lasciare sempre circa 5 l di PBS tra i fuormi.
3. Togliere 18 l di PBS da tutti i micropozzi e aggiungere 5 -L di PLPP ad ogni micro-bene, assicurando che il PLPP sia omogeneo su tutta la superficie dei micro-pozzi.

8. Secondo ciclo di fotopattern (solo per più modelli proteici)

NOTA: Dopo il primo ciclo di fotopattern e incubazione delle proteine, viene generato un micro-modello. Durante il secondo ciclo di fotopatterning, il modello per la seconda proteina verrà generato nello stesso micro-bene (vedere Figura 2C e Figura 5D). Nel software, selezionare i modelli di modello corretti (azioni), che verranno modellati durante questo round (vedere Figura 5D).

1. Passare al primo micro-bene (Figura 4D). Garantire un'adeguata sovrapposizione tra il ROI digitale e il micro-pozzo.
2. Caricare la configurazione del modello salvata in precedenza (passaggio 5.12) e selezionare le azioni da ripetere durante il secondo ciclo di fotopattern (deselezionare le azioni dal primo round, vedere Figura 5D).
3. Selezionare il simbolo Riproduci per iniziare la ripetizione. Assicurarsi che il laser sia acceso nel software.

9. Secondo ciclo di incubazione proteica (solo per più modelli proteici)

NOTA: In questa parte del protocollo, proteine/s con etichettafluere in modo fluorescente saranno incubate sul piatto di coltura dopo il secondo ciclo di fotomodellazione.

1. In condizioni sterili, lavare il micro-pozzo tre volte con 20 gradi di PBS per rimuovere il PLPP. Rimuovere 18 - L di PBS e aggiungere 20 -L di soluzione proteica ECM ad ogni micro-bene. Incubare a temperatura ambiente per 20-30 min e proteggere dalla luce.
   NOTA: I tempi ottimali di incubazione del rivestimento possono variare a seconda del tipo e della concentrazione delle proteine.
2. Dopo l'incubazione, rimuovere 15 l di soluzione proteica ECM e lavare i micropozzi tre volte con 20 gradi di PBS. Lasciare sempre circa 5 l di PBS tra i fuormi.
3. Procedere all'immagazzinamento della parabola di coltura (passaggio 10) o alla placcatura cellulare (passaggio 11 e vedere la figura 2).
4. Passaggio opzionale del controllo qualità: utilizzando un microscopio a epifluorescenza, visualizzare e immagini dei motivi stampati prima della placcatura delle cellule. Selezionare i canali fluorescenti appropriati e regolare il tempo di esposizione.
   NOTA: Per confrontare l'intensità di fluorescenza dei modelli tra gli esperimenti, è essenziale utilizzare gli stessi tempi di esposizione per le stesse proteine.

10. Stoccaggio di micromodelli

NOTA: Micro-modelli con proteine adsorbiti possono essere memorizzati durante le diverse fasi del protocollo (vedere Figura 2). Se micro-patterning con più proteine, micro-modelli possono essere memorizzati dopo il primo ciclo di micro-patterning o dopo che sono stati completati i due cicli sequenziali di micro-patterning (vedere Figura 2B).

1. Quando è passivo con PLL-PEG, conservare i micromodelli in PBS (3 mL per pozzo) a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 giorni.
2. Se il piatto di coltura è stato passivato con PEG-SVA, micro-modelli possono essere conservati fino a 1 mese. Per farlo, risciacquare i micro-modelli intensamente con acqua dionionizzata doppia distillata e asciugare con una pistola ad aria sterile di argon o azoto, anche se può essere utilizzata anche l'aria normale. Dopo l'essiccazione, i micromodelli possono essere conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese (team di supporto del sistema PRIMO, comunicazione personale).

11. Cellule di placcatura

NOTA: Durante i prossimi passi, le cellule saranno placcate sul piatto/e di coltura micro-modellato preparato. In questi studi, una linea cellulare neuronale (cellule CAD) viene utilizzata³¹. Tuttavia questo protocollo può essere regolato per studiare altri tipi di interesse cellulare (regolare il protocollo di placcatura cellulare in base alle esigenze).

1. Differenziare le cellule CAD per 48 h utilizzando un mezzo di differenziazione (DMEM integrato con 1% Glutamine, senza siero, e con 1% Penna / Strep, vedere Tabella dei Materiali).
2. Piatto 1 mL di mezzo con cellule nel pozzo di vetro interno, coprendo tutti i micro-pozzi e collocando il piatto di coltura in un incubatore di 37 gradi centigradi, 5% di CO_2.

Risultati

Seguendo il protocollo di cui sopra si ottiene superfici micro-modellate, rivestite con proteine ECM di interesse. Stiamo usando questi modelli per tracciare la ricerca del percorso neuronale.

I modelli generati devono essere una rappresentazione precisa del modello. Un esempio è illustrato nella Figura 6 in cui un modello digitale(Figura 6A) che rappresenta un'unità di progettazione (Figura 5B), ha come risultato micro-modelli definiti, che vanno da 20 a 2 m di larghezza, rivestiti con etichetta Fibrinogeno (Figura 6B). Utilizzando ImageJ, le misurazioni dell'intensità della fluorescenza sono state ottenute sia verticalmente (Figura 6C) che orizzontalmente (Figura 6E) lungo la striscia e da una regione di sfondo corrispondente di 15 m sopra ogni striscia. Le misure di sfondo sono state sottratte dalle misure del modello per ogni larghezza della striscia.

Una limitazione del sistema è che un effetto bordo può essere osservato (Figura 6B, striscia superiore) durante la stampa caratteristiche di 20 m, con un segnale di intensità più alta ai bordi del modello rispetto al centro(Figura 6D, primo picco di profilo di intensità fluorescente). Nei nostri esperimenti il limite di risoluzione era di circa 2 m; a questa larghezza abbiamo osservato una diminuzione significativa (di circa il 50%) in intensità di fluorescenza fibrinogena rispetto all'intensità delle strisce più larghe (Figura 6F,G). La strutturazione con il sistema PRIMO e il protocollo qui descritto produceva modelli riproducibili, con la più alta deviazione standard dell'intensità fluorescente media misurata per la larghezza di 2 m da quattro singole unità di progettazione replicate(Figura 6 G). Anche la variazione all'interno delle strisce modellate è risultata bassa; il coefficiente di variazione variava dal 3 al 10%, con le strisce da 20 e 2 m che avevano la più grande variazione interna. È probabile che questo sia il risultato dell'effetto bordo e del limite di risoluzione del sistema, rispettivamente. Si noti che per queste misurazioni abbiamo misurato solo l'intensità al centro delle strisce, per evitare l'illuminazione irregolare risultante dall'obiettivo utilizzato per acquisire queste immagini (vignettazione, Figura 6E).

Alcuni esperimenti possono comportare domande che richiedono concentrazioni proteiche definite, che possono essere raggiunte in due modi: 1) variando la concentrazioneproteica( Figura 7A,B). L'incubazione con diverse concentrazioni di laminina, si traduce in intensità di fluorescenza significativamente diverse, aumentando con concentrazioni proteiche più elevate (Figura 7B). 2) La dose laser utilizzata per fendere la pellicola antiadesiva (PEG) può essere variata. Dosi laser più elevate rimuoveranno la pellicola antifouling in misura maggiore, generando più siti di legame per le proteine di interesse (Figura 7C,D) con conseguente intensità di fluorescenza significativamente diversa, aumentando con laser più alto dosi (Figura 7D).

Variare la dose laser permette la generazione di gradienti proteici all'interno dello stesso modello. Questo viene visualizzato nella Figura 8A, dove un modello di gradiente è stato progettato utilizzando diversi livelli di scala di grigi, dal nero (nessuna potenza laser) al bianco (potenza massima del laser).

L'intensità del laser è proporzionale al livello di scala di grigi del modello (compreso tra 0 e 255 in un'immagine a 8 bit), generando gradienti di illuminazione UV. La misurazione del profilo di intensità di fluorescenza lungo la striscia di gradiente è lineare nel modello di pattern (Figura 8B) e nel modello di sfumatura generato (Figura 8C,D). Ciò è riproducibile tra tutte le strisce sfumature all'interno dello stesso modello e modello di sfumatura (Figura 8B,D). La generazione di tali gradienti è estremamente utile e aiuta a imitare ambienti in vivo in cui le cellule spesso rispondono a gradienti di proteine bioattive^34,35,36,37.

Le cellule percepiscono ambienti extracellulari mutevoli, ma i saggi che consentono lo studio del comportamento cellulare quando le cellule incontrano tali cambiamenti sono limitati. LIMAP può essere utilizzato per micro-modello con più proteine nello stesso micro-pozzo. Esempi sono illustrati nella Figura 9 in cui sono stati generati modelli incrociati con strisce di fibronectina (orizzontale) e laminina (verticale). Quando si creano modelli con più proteine, è fondamentale utilizzare un passaggio di blocco tra la prima e la seconda incubazione proteica, per evitare il legame incrociato delle proteine (vedere il passaggio 7). L'efficienza di blocco può variare a seconda delle caratteristiche biochimiche delle proteine utilizzate per il rivestimento e consigliamo di testare diversi buffer di blocco, tra cui PLL-PEG (0,1 mg/mL) e BSA (1%). Per valutare questo effetto di rilegatura incrociata, abbiamo eseguito misurazioni dell'intensità della fluorescenza utilizzando ImageJ (Figura 9) e abbiamo dimostrato che il cross-binding può essere ridotto drasticamente, utilizzando buffer PLL-PEG (0,1 mg/mL) per fibronectina e laminina modelli incrociati (Figura 9D,H).

I modelli incrociati generati sono stati utilizzati per i saggi cellulari con cellule CAD (Figura 10A,B) o neuroni gangli ogani di radice dorsale del ratto (DRG) (Figura 10C). I loro neuriti (CAD) e gli assoni (DRG) crescono su linee diverse. Le cellule CAD sono utilizzate come modello neuronale poiché mostrano un profilo di espressione integrinsimile rispetto ai neuroni primari e mostrano ancora coni di crescita ricchi di actina dopo 48 h in coltura (Figura 10B), rendendoli adatti per la ricerca di percorso Studi.

Al fine di studiare i possibili effetti citotossici dei micromodelli generati verso i neuroni primari, i neuroni DRG sono stati isolati e coltivati su micromodelli a seguito di un protocollo pubblicato in precedenza³⁸. I risultati dimostrano che i neuroni primari tollerano l'ambiente dei micromodelli (Figura 10C). Attualmente stiamo studiando come una varietà di proteine ECM influenzi la ricerca del percorso assonale (neurite). La prova preliminare dei concetti trovati nelle cellule CAD sarà ulteriormente studiata utilizzando neuroni DRG. Al fine di convalidare la qualità dei micromodelli generati, è auspicabile che i modelli di immagine siano microscopia a fluorescenza per garantire che i bordi del modello siano ben definiti prima di procedere alla placcatura cellulare. Durante il processo di imaging, è importante garantire la regolazione ottica tra il microscopio e la fotocamera per evitare l'effetto oscuramento periferico (vignettificazione) che influisce sull'analisi posteriore e l'interpretazione dei dati. Inoltre, acquisire un'immagine di una regione priva di motivi utilizzando gli stessi tempi di esposizione che verranno utilizzati per l'immagine dei motivi e sottrarre l'immagine dall'immagine del modello.

In sintesi, per una generazione di micromodelli di buona qualità, si consiglia di valutare la concentrazioneproteica( Figura 7A,B), le dosi laser (Figura 7C,D), i livelli di fondo delle proteine ( Figura6E,F,H) e un un'efficiente fase di blocco (Figura 9) quando si utilizzano più proteine. In modo conclusivo, la qualità dei micromodelli generati con LIMAP è essenziale per ottenere dati affidabili e riproducibili dai saggi cellulari.

Figura 1: Schema di tecniche di micro-patterning: stampa di microcontatti e modellazione assistita da laser. (A) La stampa microcontatto utilizza un master litografico con microcaratteristiche definite per generare un timbro PDMS che viene incubato con la proteina di interesse. Questa proteina viene poi trasferita (stampata) su una superficie di vetro, generando micro-modelli proteici. (B) Le tecniche di patterning assistita da laser includono il fotopattern e il pattern laser diretto. (C) La maggior parte degli approcci fotopattern utilizza una fonte di luce UV e una fotomaschera (sia a contatto con la superficie del substrato o nel piano focale dell'obiettivo) con le geometrie desiderate al fine di fendere la superficie antifouling PEG in posizioni specifiche, creazione di un modello definito. Una successiva fase di incubazione delle proteine si traduce in adsorbimento proteico solo alle regioni di taglio laser. (D) LIMAP è una tecnica di fotopatterning che non richiede una fotomaschera a contatto con il substrato (cioè un approccio senza maschera e senza contatto). LIMAP utilizza un foto-intatore, che viene attivato da basse dosi di un laser, fendendo le regioni esposte alla luce di PEG. Questo crea siti di fissaggio per l'adsorbimento sequenziale delle proteine. (E) La modellazione laser diretta utilizza una luce ad alta energia per incidere direttamente la pellicola PEG, consentendo il legame delle proteine in quelle regioni incise. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Schema che mostra un riepilogo dei passaggi nel protocollo di micromodello. (A) Il micromodello con una proteina comporta un solo ciclo di micropattern (fotopatterning e incubazione delle proteine) e può essere eseguito in meno di 8 h. (B) Il micromodello con più proteine richiede due cicli sequenziali di micro-modello e può essere completato in 1-2 giorni, a seconda del numero di micro-modelli in fase di preparazione. È possibile passare attraverso la versione B del protocollo in 1 giorno di lavoro. Le frecce continue indicano il flusso diretto dei passaggi nel protocollo. Le frecce discontinue indicano che c'è un divario di tempo significativo tra un passaggio e l'altro (vedi passaggio 6.6 e 9.3). (C) Visione schematica dei modelli di esempio ottenuti dopo un ciclo di micropattern (strisce rosse) o due cicli sequenziali di micro patterning (strisce rosse e verdi). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: La generazione di modelli di pattern è versatile con LIMAP. (A,B) Esempi di modelli di pattern progettati con ImageJ (A balestre, lettere B). Le forme disegnate in bianco sono state proiettate alla massima potenza laser e le forme disegnate in nero non sono state proiettate. (C,D) Micromodelli ottenuti con LIMAP da modelli dopo incubazione con 10 g/mL fibrinogeno (verde). (C) Le balestre hanno una larghezza di 50 m e un'altezza di 50 m distanziate di 75 m orizzontalmente e di 50 m in verticale. (D) Le lettere hanno una larghezza di 80 m e un'altezza di 85 m. Le barre di scala in C e D rappresentano 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Materiali essenziali per il protocollo LIMAP. (A) Gli stencil utilizzati in questo protocollo hanno un diametro di 20 mm, sottili pezzi PDMS a forma circolare (spessore di 250 m) contenenti 4 micro-pozzi (4 mm di diametro ciascuno). I volumi utilizzati nei micropozzi vanno da 5 a 20 gradi, riducendo considerevolmente la quantità di reagenti e proteine necessari per ogni esperimento. (B) 6 pozzo piatto inferiore in vetro dove gli stencil sono già stati collocati in ogni bene. I micropozzi contengono 20 l di PBS per renderli visibili. (C) Piatto di calibrazione in cui il pozzo di vetro interno è stato contrassegnato con un evidenziatore verde, che verrà utilizzato per calibrare la messa a fuoco laser. (D) Vista schematica del pozzo in alto a sinistra dal piatto inferiore in vetro a 6 pozzetti in B (delineato con cerchio rosso tratteggiato). Il pozzo inferiore di vetro interno è rappresentato in bianco e lo stencil è mostrato in grigio. Lo stencil contiene 4 micro-pozzi (numerati 1-4), per il test di 4 diverse condizioni sperimentali (ad esempio, diverse concentrazioni proteiche, geometrie di pattern, combinazioni di proteine, ecc.). L'asterisco rappresenta il micro-bene contenente il modello di riferimento. (E) Vista schematica del micro-bene in cui è stato generato un modello di riferimento nella parte superiore (freccia con punta della freccia piena). Questo modello di riferimento è necessario per ottenere la messa a fuoco laser ottimale per la modellazione (vedere il passaggio 4). La freccia con punta di freccia vuota indica l'area centrale del micro-pozzo, che verrà utilizzata per la successiva modellazione dopo la calibrazione del sistema. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Configurazione del software per micro-patterning. (A) Modello di pattern con strisce parallele progettate con ImageJ e salvate come file Tiff a 8 bit. (B-D) Vista schematica dei ROI digitali (regioni di interesse) che si sovrapporranno agli attuali micro-pozzi in cui verranno generati micro-modelli. (B) Il modello di pattern da utilizzare (lunghezza 1824 pixel-415 m, larghezza 1140 pixel -260 m) è selezionato su Leonardo e viene proiettato sul ROI come unità di progettazione (strisce rosse nel rettangolo tratteggiato nero), che coprirà circa 0,1 mm² del zona micro-bene. L'unità di progettazione viene replicata in 4 colonne e 4 righe nel menu Replica (configurazione del modello), creando un modello nel micro-pozzo. NOTA lo spazio tra le colonne. (C) Per ripetere strisce continue, è necessario regolare la spaziatura tra le colonne. In questo caso, per ottenere una sovrapposizione tra le unità di progettazione, la spaziatura tra le colonne viene impostata nel menu di replica come Spaziatura negativa(D) Per tracciare più proteine nello stesso micro-bene, un allineamento accurato dei modelli è Obbligatorio. Durante la fase di configurazione del software (passaggio 5), caricare contemporaneamente tutti i modelli di pattern desiderati. Nell'elenco Azioni, selezionare solo le azioni specifiche da ripetere durante ogni ciclo di ripetizione e deselezionare il resto delle azioni (passaggio 5.12, 5.13 e 8.2). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Analisi della variabilità del modello mediante LIMAP. (A) Modello di pattern progettato con ImageJ utilizzato per micro-pattern quattro strisce di larghezza variabile (20, 10, 5, 2 m, dall'alto verso il basso). (B) Micromodello ottenuto dopo l'incubazione con 10 g/mL di fibrinogeno fluorescente (verde). (C) Misurazioni di intensità lungo una linea verticale che attraversa le strisce del micro-modello. (D) Profilo di intensità di fluorescenza verticale ottenuto dalla misurazione in (C). Nota che a larghezze maggiori (20 m) c'è una variazione nel profilo verticale causata dall'accumulo di proteine ai bordi della striscia, con conseguente due picchi distinti di intensità di fluorescenza (effetto bordo). Questo effetto è visibile solo nelle larghezze delle strisce di 20 m. (E) Misurazioni di intensità lungo le linee orizzontali rappresentate (fluorescenza e sfondo). (F) Profili di intensità di fluorescenza orizzontale ottenuti dalle misurazioni in (E). (G) Grafico che mostra l'intensità media per ogni larghezza di striscia, misurata da quattro singole unità di progettazione replicate (variazione tra modelli). NOTA l'adsorbiente ridotto delle proteine a modelli di larghezza di 2 strisce m. (H) La variazione all'interno delle strisce modellate (coefficiente di variazione) era bassa per tutte le larghezze delle strisce, che vanno dal 3 al 10%. I dati in G e H sono stati indicati come media: l'analisi statistica in G e H è stata eseguita utilizzando un test non parametrico ANOVA (Kruskal-Wallis) unidirezionale con confronti multipli. Il valore P è <0.001 per il significato di cancelazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: L'effetto delle variazioni nella potenza del laser e nella concentrazione di proteine per l'efficienza dell'adsorbimento delle proteine. (A) La superficie del PLL-PEG è stata rivestita al laser con una dose laser costante (1390 mJ/mm²) e incubata con le concentrazioni indicate di lamininina con etichetta fluorescente (magenta). (B) Quantificazione dell'intensità della fluorescenza delle strisce di laminina (A). (C) Le diverse dosi laser indicate sono state applicate, seguite dall'incubazione con la stessa concentrazione (10 g/mL) di fibronectin con etichetta fluorescente (verde). (D) Quantificazione dell'intensità della fluorescenza delle strisce di fibronectina in (C) che mostra che dosi laser più elevate sono correlate a livelli più elevati di proteine adsorbiti. Tutte le misure vengono sottratte di sfondo. I numeri di esempio sono indicati nella parte inferiore delle colonne; I dati sono indicati come media : l'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test Mann-Whitney non parametrico con calcolo a due code. Il valore P è <0.0001 per il significato di errore ".". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Generazione di un gradiente di concentrazione proteica all'interno di un micro-modello. (A) Modello di modello di modello sfumato in scala di grigi. (B) Profilo di intensità di fluorescenza misurato da (A). (C) Modello ottenuto con LIMAP dal modello di modello in (A) dopo l'incubazione con 10 g/mL di fibronectina fluorescente (verde). (D) Profilo di intensità di fluorescenza di n x 3 strisce e sfondo rappresentato come media : SEM, mostrando l'aumento lineare di intensità del gradiente proteico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: L'effetto di rilegatura incrociata quando si esegue la modelliera di più proteine in sequenza. (A-C, E-G) Modelli incrociati con lamininina con etichettatura fluorescente di fibronectina fluorescente (ciano, orizzontale) e laminina con etichetta fluorescente (magenta, verticale). (A-C) Campioni trattati con buffer di blocco BSA. (E-F) Campioni trattati con PLL-PEG per il blocco di siti di rilegatura non specifici (passaggio 7). (A, E) Canali di fluorescenza uniti che mostrano sia fibronectina che laminina. (B, F) Immagine che mostra solo la fibronectina. (C,G) Immagine che mostra solo laminin. Per C, notare la presenza di laminainina anche su strisce positive fibronectine orizzontali che è dovuto al blocco inefficace di siti di legame non occupati con BSA. Per G, si noti che il blocco con PLL-PEG impedisce l'associazione efficiente della laminina alle strisce fibronectine. (D,H) Profili di intensità di fluorescenza ottenuti dalle misure indicate (linea gialla diagonale) rispettivamente in A ed E. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Modelli incrociati per analizzare la ricerca del percorso neurite/axon. (A-C) Modelli incrociati con lamininina con etichettatura fluorescente di fibronectina fluorescente (ciano, orizzontale) e laminina con etichetta fluorescente (magenta, verticale). (A,B) Immagini fluorescenti di cellule CAD con neuriti che crescono lungo i micromodelli. Per visualizzare i neuriti, le cellule sono state coltivate per 48 h, fissate con 4% di PFA e macchiate per tubulina (A) o tubulina e actina (B). (C) I neuroni del ganglio dorsale-radicale (DRG) con assoni che crescono lungo i micro-modelli. Per visualizzare gli assoni, i neuroni DRG sono stati coltivati per 72 h, fissati con 4% PFA e macchiati per la tubulina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: Esempi di risultati negativi comuni ottenuti durante la generazione di micromodelli con LIMAP. (A-C) Strisce con motivi sub-ottimali di 10 g/mL fluorescently etichettati fibrinogeno (verde) ottenuti in circostanze diverse. (A) Il micro-ben essiccato durante la generazione del modello. Notare gli alti livelli di fluorescenza sullo sfondo (freccia) e la presenza di cristalli PBS (asterischi). (B) Le cuciture tra le strisce non sono state regolate correttamente durante l'impostazione del software, con conseguente striscia discontinua con spazi vuoti (freccia) tra le unità di progettazione (cfr. punto 3.4.7). (C) La messa a fuoco laser era sub ottimale causando strisce diffuse (frecce) che non rappresentano le larghezze effettive delle strisce del modello di modello, che dovrebbe essere 20, 10, 5, 2 m dall'alto verso il basso, come in (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Vantaggi del micromodellamento LIMAP (PRIMO) e confronto con la stampa a microcontatto
Mentre la stampa a microcontatto è forse la tecnica di micro-patterning più comunemente utilizzata nel campo biologico³⁹, sembra che ci sia un numero crescente di ricercatori che utilizzano la tecnologia LIMAP^{40,41,42 ,43,44}. Qui abbiamo presentato un protocollo utilizzando PRIMO, un sistema disponibile in commercio per LIMAP. Di seguito discutiamo brevemente i potenziali vantaggi e limitazioni della stampa di microcontatti e del fotopattern LIMAP.

La stampa a microcontatto richiede maestri litografici prodotti dal rivestimento a forma di spin di una fotomaschera (generalmente SU-8) su un wafer di vetro o silicio, che viene poi inciso al laser con le micro-caratteristiche desiderate. Questi master vengono utilizzati come modelli per creare un timbro PDMS⁴⁵. Il francobollo viene incubato con una proteina prescelta che adsorbe ad esso, e viene poi trasferito (stampato) sul piatto di coltura cellulare. Il processo di adsorbimento della proteina al timbro PDMS dipende dalla concentrazione di proteine, dal tampone e dal tempo di incubazione. Questi parametri devono essere testati in anticipo per ottenere risultati ottimali⁴⁶.

I maestri possono essere utilizzati in un numero considerevole di esperimenti, della durata di mesi o addirittura anni, se conservati correttamente. Tuttavia, un fattore limitante di questa tecnologia è la necessità di riprogettare nuovi maestri litografati per ogni modifica desiderata. I cambiamenti nei progetti sperimentali possono comportare una produzione di tempo di nuovi maestri (fino a diverse settimane) ritardando così gli esperimenti. In confronto, il fotomodellamento LIMAP non richiede un master fisico; utilizza modelli di pattern generati da software che possono essere utilizzati per adattare in modo flessibile le geometrie desiderate dei micromodelli alle mutevoli domande di ricerca. LIMAP può essere utilizzato anche per generare gradienti proteici all'interno dello stesso micro-modello (Figura 8), che è più difficile da ottenere in modo riproducibile utilizzando la stampa microcontatto⁴⁷.

Inoltre, la risoluzione del micromodello ottenuta con LIMAP, nel nostro caso, è di 2 m (Figura 6B).

L'avvicinamento a questa risoluzione ha aumentato la variabilità intra e inter-modello. La generazione di modelli intorno o superiore a 10 m di larghezza era altamente riproducibile (Figura 6G,H). Al contrario, con la stampa a microcontatto è difficile ottenere costantemente risoluzioni inferiori a 10 m ed è comune trovare artefatti quando si stampano piccole caratteristiche (dati non mostrati).

Abbiamo dimostrato che LIMAP può essere utilizzato per micro-modello più proteine (Figura 9) all'interno dello stesso micro-pozzo, consentendo ulteriori livelli di complessità da aggiungere agli esperimenti. Anche se questo potrebbe essere ottenuto con la stampa a microcontatto, allineare diverse proteine con un alto livello di precisione può essere tecnicamente piuttosto impegnativo. Mentre la modellazione di più proteine utilizzando LIMAP sembra dritto in avanti, è importante ricordare che il cross-binding delle proteine attraverso procedure di rivestimento sequenziale può essere ridotto attraverso il blocco di reagenti, ma non del tutto eliminato (Figura 9).

Per quanto riguarda il costo di una o l'altra tecnica, LIMAP come descritto qui richiede l'acquisto di apparecchiature di micro-patterning (PRIMO) che possono essere installate su diversi microscopi a fluorescenza e richiedono una fase motorizzata. Anche se questo investimento è inizialmente dispendioso in termini di costi, al lungo periodo non sono previsti acquisti aggiuntivi oltre agli articoli di consumo (stencil, PEG e PLPP) associati a LIMAP. In alternativa, gli stencil PDMS possono essere prodotti anche in laboratorio dal proprio sperimentatore seguendo i protocolli pubblicati^18,32. I maggiori costi per la stampa di microcontatti possono essere associati alla produzione di nuovi maestri, che possono diventare notevoli se gli esperimenti richiedono nuovi modelli.

Uno svantaggio di LIMAP è l'approccio relativamente basso throughput di questa tecnica. La stampa a microcontatto è in grado di produrre un gran numero di micromodelli in modo rapido ed efficiente in una fase di stampaggio simultanea, rispetto alla micro-modellazione laser sequenziale richiesta con LIMAP. Ad esempio, è possibile produrre 6 coperture in vetro stampatoin obiscante in circa 2 h con stampa a microcontatto utilizzando francobolli PDMS (esclusa la preparazione dei francobolli); la modellazione di un'area simile (piatto di 6 pozze) con LIMAP richiederebbe circa 4 h, escludendo la procedura di passività della superficie (considerando la configurazione del modello di modello descritta nel passaggio 5.12 e vedere la figura 5B).

Un altro fattore di limitazione della velocità della tecnologia LIMAP è il lungo tempo di illuminazione necessario per la modellazione di grandi aree (30 s per unità di progettazione con un laser da 7,5 mW/mm^2). In questi casi, la stampa di microcontatto potrebbe essere un'opzione preferita. Un nuovo foto-initiator (PLPP gel, Table of Materials) dovrebbe ridurre notevolmente il tempo impiegato per la modellazione, consentendo la generazione di centinaia di micro-modelli in grandi aree (fino a 8 mm²) in pochi minuti.

Un altro fattore importante da prendere in considerazione quando le superfici di micro-patterning per la coltura cellulare è la riproducibilità dei micromodelli tra diverse ripetizioni sperimentali, rispetto alla variabilità ottenuta con la stampa a microcontatto. Ad esempio, i grafici illustrati nella Figura 7B,D sono dati rappresentativi di tre ripetizioni sperimentali indipendenti con risultati molto simili (dati non mostrati). Sulla base della nostra esperienza e delle pubblicazioni precedenti, questo livello di riproducibilità è difficile da raggiungere con la stampa microcontatto^48,49,50,51^,52.

A differenza di altre tecniche di fotomodellamento che richiedono chimica dedicata per progettare materiali fotosensibili o l'uso di fotosensibilizzanti, che sono generalmente non molto biocompatibili³, la componente fotosensibile di LIMAP (PLPP ) è biocompatibile e ben tollerato dalle cellule²¹; nelle nostre mani non abbiamo sperimentato alcuna citotossicità in una varietà di cellule, tra cui CAD, neuroni DRG (Figura 10), fibroblasti, cellule epiteliali e cellule melanoma (dati non mostrati). Un altro vantaggio di LIMAP utilizzando PRIMO rispetto ad altre tecniche di foto-patterning è che non è necessaria alcuna fotomaschera. Simile alla stampa di microcontatti, nuove fotomaschere dovrebbero essere progettate e generate per ogni modello desiderato.

Tutte le limitazioni di cui sopra per la stampa microcontatto, si riferiscono all'approccio manuale della tecnica. Tuttavia, è possibile migliorare la produttività e la riproducibilità della stampa di microcontatto utilizzando un dispositivo automatizzato con carico del timbro e controllo della pressione⁵³.

Passaggi chiave del protocollo e risoluzione dei problemi per LIMAP utilizzando PRIMO
Uno dei problemi più comuni riscontrati durante questo protocollo è avere alti livelli di fluorescenza di fondo all'interno dei micro-modelli. Ciò può essere dovuto all'essiccazione di micro-pozzi che spesso si verifica a causa del loro piccolo volume. In questo caso, i cristalli PBS spesso appaiono intorno ai modelli ECM (Figura 11A).

Passaggi di lavaggio insufficienti o inefficienti dopo l'incubazione delle proteine possono anche provocare alti livelli di fluorescenza di fondo. Ciò può essere osservato in particolare con l'utilizzo di concentrazioni proteiche di 10 g/mL (Figura 11B) o superiore. L'eccesso di proteine sullo sfondo può essere ridotto includendo ulteriori passaggi di lavaggio con PBS.

La presenza di fondo proteico deve essere misurata e caratterizzata in ogni esperimento, calcolando l'intensità della fluorescenza di fondo (Figura 6E) e sottraendola dall'intensità dei micromodelli (Figura 6F-H e Figura 7B,D). Un elevato scarico proteico può avere un impatto sull'attaccamento e sulla germogliazione delle cellule CAD, compromettendo l'interpretazione dei risultati.

Avere spazi tra le unità di progettazione è un problema comune quando gli utenti hanno un'esperienza limitata (Figura 11B), che si verifica a causa di una sovrapposizione insufficiente tra i modelli. Due parametri nel software Leonardo possono essere regolati per superare questo: 1) una spaziatura negativa tra le colonne può essere richiesto, a seconda della progettazione del modello (passaggio 5.7 e vedere Figura 5B,C). In alternativa, 2) utilizzare l'opzione sfumatura nel menu Esperto per cucire le colonne. Un test rapido per determinare i parametri di spaziatura ottimali può essere eseguito utilizzando l'adesivo UV (Tabella dei materiali). Una piccola goccia di questo adesivo viene applicata a uno scivolo di vetro, che viene poi coperto con una vetrina di vetro, facendo un film. L'adesivo UV incorporato è fotografato con il modello modello di interesse utilizzando una dose laser bassa (30 mJ/mm²). Le regioni esposte ai raggi UV dell'adesivo incorporato saranno curate, diventando visibili sotto microscopia a campo luminoso. I risultati del test vengono visualizzati per valutare la spaziatura ottenuta all'interno del modello. Nei nostri esperimenti neuronali, un divario tra le strisce può influenzare negativamente il comportamento cellulare, producendo variazioni nelle dinamiche di crescita (sia a velocità ridotta che all'abbandono del percorso).

Nell'ultimo aggiornamento del software Leonardo (al momento della pubblicazione, Leonardo 4.11), è possibile caricare modelli di pattern più grandi progettati in precedenza che coprono un'area molto più grande (fino a 8 mm² utilizzando l'obiettivo 20X) della superficie del micro-pozzo rispetto all'attuale 0,1 mm² per unità di progettazione, eliminando la necessità di unire le unità di design più piccole. I bordi non definiti possono derivare da una mancanza di regolazione della messa a fuoco laser durante la generazione del modello (Figura 11C). È quindi fondamentale calibrare il laser ed eseguire i passaggi del modello di riferimento (vedere il passaggio 4) prima della modellazione. Strisce scarsamente definite si traducono in variazioni nella larghezza delle strisce, rendendo difficile la correlazione tra le dinamiche di crescita degli assoni e la larghezza delle strisce. Gli assoni tendono anche ad abbandonare le strisce che hanno bordi diffusi. Inoltre, la variabilità dei bordi può essere riscontrata anche quando si stampano strisce di 10-20 m di larghezza o superiore, con conseguente un contenuto proteico più elevato ai bordi rispetto alle regioni centrali del modello (Figura 6B,D). Questo effetto bordo è prodotto da una diffusione non omogenea del foto-initiator durante il processo di fotomodellazione. La reazione di fotocissione dipende dall'ossigeno, che si diffonde maggiormente ai bordi. Questo effetto bordo può essere ridotto al minimo omogeneizzando il foto-introiatore con una pipetta nel micro-pozzo durante il processo di fotomodellazione. Inoltre, un nuovo foto-introcorso commercializzato (gel PLPP), può anche ridurre l'effetto bordo (team di supporto del sistema PRIMO, comunicazione personale).

La microstampa di più di una proteina può provocare un incrocio (Figura 9A-D). Questo può essere ridotto al minimo aumentando l'efficienza di blocco che viene utilizzato per occupare siti di legame non specifici tra le fasi di incubazione per le due diverse proteine. Il legame incrociato delle proteine può perturbare la riproducibilità dei risultati sperimentali e può portare a un'errata interpretazione dei dati, poiché è difficile determinare il contributo di ciascuna proteina alle dinamiche di crescita degli assoni e ad altri comportamenti cellulari.

conclusione f
Ci auguriamo che il protocollo fornito utilizzando LIMAP faciliti la generazione di micro-modelli proteici attraverso l'uso del sistema PRIMO. Mentre il nostro protocollo si concentra su come produrre in modo affidabile micro-modelli in superfici di vetro 2D, altri hanno dimostrato che è possibile utilizzare LIMAP per micro-patterning di substrati morbidi⁵⁴, e superfici microstrutturate per le colture 3D⁴². Questi micromodelli possono essere uno strumento versatile per studiare le risposte cellulari ai cambiamenti nel loro micro-ambiente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di marcatura delle proteine Alexa 488	Invitrogen	A10235	Concentrazione di lavoro: N.A.
Kit di marcatura proteica Alexa 647	Invitrogen	A20173	Concentrazione di lavoro: N.A.
Celle CAD	ECACC	8100805	Concentrazione di lavoro: N.A.
Sonde molecolari	coniugate fibrinogeno-488	F13191	Concentrazione di lavoro: 10 μ g/ml
di terreno di coltura DMEM	Gibco	11320033	Concentrazione di lavoro: N.A.
Microscopio a epifluorescenza**	Nikon	Eclipse Ti invertito	Concentrazione di lavoro: N.A.
Fibronectina	Sigma	F4759	Concentrazione di lavoro: 10 μ g/ml (dopo l'etichettatura con il kit di marcatura delle proteine Alexa 488, vedi sopra) (diluito in PBS)
Fiji-Image J	www.imagej.nih.gov	Versione 2.0.0-rc-54/1.51f	Concentrazione di lavoro: N.A.
Illuminante fluorescente	Stabilo	Stabilo Boss Original	Concentrazione di lavoro: N.A.
HEPES	Gibco	15630080	Concentrazione di lavoro: 1M
Software Inkscape	Inkscape	Check ultimo aggiornamento	Concentrazione di lavoro: N.A.
Rodamina fluorescente rosso laminina	Cytoskeleton, Inc.	LMN01	Concentrazione di lavoro: 10 μ g/ml (diluito in PBS)
Leonardo software	Alvé ole	versione 4.11	Concentrazione di lavoro: N.A.
L-Glutammina	Sigma	G7513	Concentrazione di lavoro: 1%
Software Micro-manager	Imaging aperto	Controllo ultimo aggiornamento Concentrazione	di lavoro: N.A.
Stadio x/y motorizzato	PRIOR Scientific	Proscan II	Concentrazione di lavoro: N.A.
Nikon		NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (con lavori Nikon)	Concentrazione di lavoro: N.A.
PBS (senza Ca2+, Mg2+)	Sigma	D8537	Concentrazione di lavoro: 1X
stencil PDMS	Alvé ole	visit www.alveolelab.com	Concentrazione di lavoro: N.A.
PEG-SVA	Laysan bio, Inc.	MPEG-SVA-5000-1g	Concentrazione di lavoro: 50 mg/ml
Falloidina 405	Abcam	ab176752	Concentrazione di lavoro: 1:1000
Fotoiniziatore (PLPP)	Alvé ole	Classic PLPP	Concentrazione di lavoro: 14,5 mg/ml
Fotoiniziatore (PLPP gel)	Alvé ole	PLPP gel	Concentrazione di lavoro: 4,76% diluito in etanolo
Pulitore al plasma	Harrick Plasma	PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)	Concentrazione di lavoro: N.A.
PLL-PEG	SuSoS (distribuito anche da Alvé ole)	www.alveolelab.com	Concentrazione di lavoro: 0.1 mg/ml (diluito in PBS)
Poli-L-Lisina	Sigma	P4707	Concentrazione di lavoro: 0,01%
Primo equipment	Alvé ole	www.alveolelab.com	Concentrazione di lavoro: N.A.
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Concentrazione di lavoro: 1%
anticorpo anti-alfa Tubulina	Abcam	DM1A	Concentrazione di lavoro: 1:1000 cellule CAD
Anticorpo anti-beta 3 della tubulina	Sigma	T8660	Concentrazione di lavoro: 1:500 neuroni
Colla UV	Norland Products	NOA81	Concentrazione di lavoro: N.A.
Piatto con fondo in vetro a 1 pozzetto	Cellvis	D35-20-1.5-N	Concentrazione di lavoro: N.A.
Piatto con fondo in vetro a 6 pozzetti	Cellvis	P06-20-1.5-N	Concentrazione di lavoro: N.A.
Obiettivo 20x**	Nikon	senza anello di fase (consultare il catalogo aggiornato)	Concentrazione di lavoro: N.A. **Microscopio a epifluorescenza: sono state acquisite immagini e generati pattern su un microscopio invertito Eclipse Ti (Nikon), accoppiato all'apparecchiatura di micro-patterning PRIMO (Alvé ole), utilizzando un obiettivo 20x (0,75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Sono stati utilizzati set di filtri specifici Nikon per GFP, mCherry e Cy5 e la sorgente luminosa fluorescente era a LED (Lumencor), sebbene sia possibile utilizzare altre sorgenti di fluorescenza e set di filtri. Il microscopio è dotato di un tavolino x/y automatizzato (PRIOR Scientific) per la stampa di pattern multi-campo e di Nikon Perfect Focus per prevenire la deriva della messa a fuoco. Le immagini sono state raccolte utilizzando una fotocamera Retiga R6 (Q-Imaging).