Articolo metodologico

Un metodo ad alto throughput in Situ per la stima della ploidia nucleare epatica nei topi

DOI:

10.3791/60095

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19 aprile 2020

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1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

In questo articolo

Sommario

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Vi presentiamo un metodo robusto, conveniente e flessibile per misurare i cambiamenti nel numero di epatociti e nella ploidia nucleare all'interno di campioni di tessuto fisso/crioconservato che non richiede citometria di flusso. Il nostro approccio fornisce una potente firma a livello campione di citologia epatica ideale per monitorare la progressione delle lesioni epatiche e della malattia.

Abstract

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Quando il fegato è ferito, il numero di epatociti diminuisce, mentre le dimensioni della cellula, le dimensioni del nucleare e l'aumento della ploidia. L'espansione di cellule non parenchychymal come cholangiociti, miofibromi, progenitori e cellule infiammatorie indicano anche danni epatici cronici, rimodellamento dei tessuti e progressione della malattia. In questo protocollo, descriviamo un semplice approccio ad alto contenuto di velocità per calcolare i cambiamenti nella composizione cellulare del fegato che sono associati a lesioni, malattie croniche e cancro. Mostriamo come le informazioni estratte dalle sezioni di tessuto bidimensionali (2D) possono essere utilizzate per quantificare e calibrare la ploidia nucleare degli epatociti all'interno di un campione e consentire all'utente di individuare specifici sottoinsiemi di ploidia all'interno del fegato in situ. Il nostro metodo richiede l'accesso a materiale epatico fisso/congelato, reagenti di immunocitochimica di base e qualsiasi piattaforma di imaging standard ad alto contenuto. Serve come una potente alternativa alle tecniche di citometria di flusso standard, che richiedono l'interruzione del tessuto appena raccolto, la perdita di informazioni spaziali e potenziale pregiudizio di disaggregazione.

Introduzione

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Gli epatociti nel fegato dei mammiferi possono sottoporsi a citocinesi bloccata per produrre cellule binucleari, e l'endoreplicare del DNA per produrre nuclei poliploidi contenenti fino a 16N contenuto di DNA. Aumento complessivo della ploidia cellulare e nucleare durante lo sviluppo postnatale, l'invecchiamento e in risposta a diversi stress cellulari1. Il processo di poliploidizzazione è dinamico e reversibile2, anche se la sua precisa funzione biologica rimane poco chiara3. L'aumento della ploidia è associato alla ridotta capacità proliferiva4,alla diversità genetica

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati precedentemente approvati dal comitato etico del CIPF. I topi sono stati alloggiati in una struttura senza agenti patogeni presso il Centro de Investigaciàn Pràncipe Felipe (Valencia, Spagna), registrati come allevatore sperimentale di animali, utente e centro di approvvigionamento (reg n. n. ES 46 250 0001 002) ai sensi dell'attuale normativa europea e spagnola in materia di benessere degli animali (RD 53/2013).

1. Raccolta dei tessuti e preparazione del campione

NOTA: Questo protocollo descrive come congelare il tessuto senza previa fissazione o crioconservazione. Pe....

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Risultati

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Questo metodo è stato utilizzato per misurare l'impatto della lesione colestatica sul fegato adulto del topo alimentando gli animali per 0-21 giorni con una dieta epatossica contenente lo 0,1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dicollididene (DDC)17. L'alimentazione cronica della DDC provoca lesioni epatocellulari aumento dell'espansione ploidia e periportalia dei PNG. L'utente deve essere consapevole che la tensione del topo e le differenze dipendenti dall'età possono esist.......

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Discussione

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Viene descritto un approccio ad alto contenuto e ad alto contenuto per l'analisi del rimodellamento dei tessuti e la stima della ploidia nucleare epatocite nel fegato murino. Una volta che ha familiarità con la procedura, un utente può elaborare, immagini e analizzare più campioni in un periodo di 3-5 giorni, generando set di dati testati di grandi dimensioni che forniscono una firma dettagliata dello stato di salute del fegato. Data la semplicità del metodo di preparazione del campione, insieme al gran numero di cellule.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione spagnola del governo MINECO BFU2014-58686-P (LAN) e SAF-2017-84708-R (DJB). LAN è stata sostenuta da un premio nazionale DI MineCO Ramàn y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 e Plan GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) e FMN da una studentessa regionale della Generalitat Valencian ACIF/2016/020. RP vorrebbe riconoscere il professor Ewa K. Paluch per il finanziamento. Ringraziamo la Dott.ssa Alicia Martanez-Romero (servizio CIPF Cytometry) per l'aiuto con la piattaforma IN Cell Analyzer.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3,5-dietossicarbossivinil-1,4-diidrocollidina dieta (DDC)TestDiet1810704Modified LabDiet dieta per topi 5015 con 0,1% DDC
Alexa Fluor 488 asino anti-capra IgG (H+L)InvitrogenA11055Diluizione 1:500
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA7906
Criostato Leica CM1850 UVLeica biosystemsCM1850 UVSezionamento tissutale
Fluorescente Mezzo di montaggioDakoS3023
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 8Software statistico per la rappresentazione grafica dei dati
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261Concentrazione finale 5 &; g/mL
IN Cell Analyzer 1000GE Healthcare Bio-Sciences Corpimaging e analisi cellulare ad alto contenuto
MATLABMathWorksR2019aSoftware di analisi dei dati per l'analisi automatizzata della ploidia nucleare
Vetrini coprioggetti per microscopioVWR International630-2864Dimensioni di 24 x 60 mm
Microsoft Office ExcelMicrosoftSpeadsheet software
OCT Tissue TekPascual y Furió4583
ParaformaldeidePanreac AppliChem141451.121
Penna per immunocolorazioneSigma-AldrichZ377821-1EAVetrini
microscopio polisineVWR International631-0107
Coniglio policlonale Anti-HNF4αThermo Fisher ScientificPA5-79380Diluizione 1:250 (alternativa)
Rabit policlonale Anti-HNF4&alfa;Santa Cruz Biotechnologysc-6556Diluizione 1:200 (anticorpo utilizzato nello studio)
Tween 20Sigma-AldrichP5927
Sistema di per con larghezza della punta di 5 mm

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
  2. Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
  3. G....

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Hepatocyte Nuclear PloidyHigh Throughput ImagingLiver Tissue SectionsImmunocytochemistryNuclear SegmentationHNF4 alpha AntibodyHoechst StainingPloidy QuantificationFluorescence MicroscopyCellular Composition Analysis

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