Articolo metodologico

Generazione di Cardiomiociti Ventricular-Like HiPSC-Derived e preparati cellulari di alta qualità per la caratterizzazione della movimentazione del calcio

DOI:

10.3791/60135

⸱

17 gennaio 2020

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descriviamo e convalidiamo un metodo per generare costantemente robusti cardiomiociti derivati da cellule staminali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo e caratterizzano la loro funzione. Queste tecniche possono aiutare a sviluppare informazioni meccanicistiche sui percorsi di segnalazione, fornire una piattaforma per lo screening farmacologico su larga scala e modellare in modo affidabile le malattie cardiache.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CMs) forniscono una preziosa fonte umana per studiare la scienza di base delle vie di manipolazione e segnalazione del calcio (Ca2),nonché i saggi di screening e tossicità per i farmaci ad alto rendimento. Qui, forniamo una descrizione dettagliata delle metodologie utilizzate per generare iPSC-CMs di alta qualità in grado di riprodurre costantemente caratteristiche molecolari e funzionali attraverso diverse linee cellulari. Inoltre, viene descritto un metodo per valutare in modo affidabile la loro caratterizzazione funzionale attraverso la valutazione delle proprietà di gestione di Ca2. Condizioni di ossigeno basso (O2),selezione del lattato e tempo prolungato in coltura producono cardiomiociti ventricolari ad alta purezza e di alta qualità. Simile ai cardiomiociti di ratti adulti isolati (ARCM), gli iPSC-CM di 3 mesi presentano un'ampiezza Ca2 o superiore, un tasso più veloce di riupposizione di Ca2 o (decay-tau) e una risposta lusitropica positiva alla stimolazione zorrenergica rispetto ai 30 iPSC-CMs del giorno 30. La strategia è tecnicamente semplice, conveniente e riproducibile. Fornisce una solida piattaforma per modellare le malattie cardiache e per lo screening farmacologico su larga scala per colpire le proteine che maneggiano Ca2.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CMs) sono un'attraente piattaforma a base umana per modellare una grande varietà di malattie cardiache in vitro1,2,3,4,5,6,7,8. Inoltre, iPSC-CMs può essere utilizzato per la previsione di risposte dei pazienti a farmaci nuovi o esistenti, per lo screening composti colpiti, e sviluppare nuovi farmaci personalizzati9,10. Tuttavia, nonostante i progressi significativi, è necessario considerare diverse limitazioni e sfide quando si utilizzai iPSC-CMs11. Di conseguenza, i metodi per migliorare i protocolli di differenziazione cardiaca, per migliorare l'efficienza e la maturazione iPSC-CMs, e per generare sottotipi di cardiomiocito specifici (ventricolare, atriale e nodale) sono stati intensamente studiati e già portati a numerose strategie culturali per superare questi ostacoli12,13,14,15.

Nonostante la robustezza di questi protocolli, una delle principali preoccupazioni per l'uso di iPSC-CMs è la riproducibilità di procedure lunghe e complesse per ottenere cardiomiociti di alta qualità in grado di garantire le stesse prestazioni e risultati riproducibili. La riproducibilità è fondamentale non solo quando si confrontano linee cellulari con diversi background genetici, ma anche quando si ripetono confronti cellulari e molecolari della stessa linea cellulare. La variabilità cellulare, come le differenze ben per pozzo nella densità degli iPSC, può influenzare la differenziazione cardiaca, generando una bassa resa e cardiomiociti di scarsa qualità. Queste cellule potrebbero ancora essere utilizzate per eseguire esperimenti che non richiedono una popolazione pura di CMs (ad esempio, quando si eseguono misurazioni transitorie di Ca2o). Infatti, quando si esegue l'analisi elettrofisiologica, le non-CMs non batteranno, né spontaneamente né sotto stimolazione elettrica, quindi sarà facile escluderli dall'analisi. Tuttavia, a causa della scarsa qualità, gli iPSC-CM possono mostrare caratteristiche elettrofisiologiche alterate (ad esempio, irregolare Ca2 o transitorio, bassa ampiezza Ca2) che non sono dovute alla loro composizione genetica. Pertanto, soprattutto quando si utilizza iPSC-CMs per modellare la malattia cardiaca, è importante non confondere i risultati di un CM di scarsa qualità con il fenotipo della malattia. Prima di procedere a studi elettrofisiologici sono necessari processi di screening ed esclusione.

Questo metodo include protocolli ottimizzati per generare cardiomiociti ad alta purezza e di alta qualità e per valutare la loro funzione eseguendo misurazioni transitorie di Ca2 o utilizzando un sistema di acquisizione e analisi del calcio e della contrattilità. Questa tecnica è un modo semplice, ma potente, per distinguere tra prodotti iPSC-CM ad alta efficienza e preparati iPSC-CM a bassa efficienza e fornire una caratterizzazione più fisiologicamente rilevante degli iPSC-CMs umani.

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Protocollo

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Gli esperimenti che utilizzano cardiomiociti per ratti adulti in questo studio sono stati condotti con protocolli Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) approvati della Icahn School of Medicine sul Monte Sinai. I cardiomiociti di ratto adulti sono stati isolati dai cuori di ratto Sprague Dawley con il metodo basato su Langendorff come descritto in precedenza16.

1. Preparazione dei mezzi di comunicazione

  1. Preparare i supporti hiPSC.
    1. Elittore il supplemento e il mezzo basale a temperatura ambiente (RT). Assicurarsi che il supplemento si sia scongelato completamente. Mescolare 400 mL del mezzo basale e 100 mL del supplemento e filtrare utilizzando un filtro a vuoto da 0,22 m. Conservare a 4 gradi centigradi ed eseguire l'acquisiglia in BASE alla RT prima dell'uso.
  2. Preparare RPMI - B27.
    1. Assicurarsi che il supplemento B27 e il mezzo basale (RPMI 1640) a RT. Assicurarsi che il supplemento si sia scongelato completamente. Mescolare 490 mL del mezzo basale e 10 mL del supplemento 50x e filtrare utilizzando un filtro azionato a vuoto da 0,22 m. Conservare a 4 gradi centigradi ed eseguire l'acquisiglia in BASE alla RT prima dell'uso.
  3. Preparare l'insulina RPMI - B27 (-).
    1. Assicurarsi che il supplemento di insulina B27 (-) e il mezzo basale (RPMI 1640) a RT. Assicurarsi che il supplemento si è scongelato completamente. Mescolare 490 mL del mezzo basale e 10 mL del supplemento 50x e filtrare utilizzando un filtro azionato a vuoto da 0,22 m. Conservare a 4 gradi centigradi ed eseguire l'acquisiglia in BASE alla RT prima dell'uso.
  4. Preparare il supporto di selezione (RPMI (-) glucosio , B27 e lattato).
    1. Assicurarsi che il supplemento B27 e il mezzo basale (RPMI 1640 (-) glucosio) a RT. Assicurarsi che il supplemento si è scongelato completamente. Mescolare 490 mL del mezzo basale e 10 mL del supplemento 50x, aggiungere 4 mM di lattato di sodio costituito in acqua sterile, e filtrare utilizzando un filtro a vuoto 0,22 m. Conservare a 4 gradi centigradi ed eseguire l'acquisiglia in BASE alla RT prima dell'uso.
  5. Preparare RPMI 20.
    1. Miscelare il siero bovino fetale (FBS) (20% di concentrazione finale) e RPMI. Filtrare utilizzando un filtro da 0,22 m a vuoto e conservarlo a 4 gradi centigradi. Equilibrate a RT prima dell'uso.
  6. Preparare il passaggio dei supporti aggiungendo l'inibitore della proteina chinasi (ROCK) associata a Rho contenente l'inibitore della proteinacità (2 M) ai supporti hiPSC.
  7. Preparare il supporto D0 aggiungendo l'inibitore di GSK-3, da CHIR 99021 a RPMI - B27 (-) supporti insulinici (finale 10 M).
  8. Preparare i supporti D3 e D4 mescolando i supporti insulinici RPMI - B27 (-) con IWR-1 (5 m finale).
    NOTA: l'insulina è costituita da supporti D1 e D5. Il supporto D7 è costituito da RPMI - B27.
  9. Preparare il buffer di blocco (2% albumin semastro bovino [BSA], 2% FBS, 0.05% NP-40 in salina con buffer fosfato [PBS]): in un tubo conico da 50 mL, aggiungere 1 g di BSA, 1 mL di FBS, 49 mL di PBS e 250 luna di NP-40. Mescolare fino a completa dissoluzione.

2. Preparazione di piastre e copriletti con cellule staminali embrionali umane (hESC) qualificate

NOTA: Eseguire tutti i passaggi sotto una cappa di coltura dei tessuti sterilizzata.

  1. Soluzione di stock a matrice qualificata per il scongelo durante la notte sul ghiaccio a 4 gradi centigradi. Fare riferimento alla scheda di specifica del prodotto per determinare i volumi appropriati in quanto ciò può variare a seconda dello stock. Conservare queste aliquote a -20 gradi centigradi in tubi di microcentrifuga da 1,5 ml.
  2. Al fine di utilizzare la matrice per il rivestimento di piastre o coperture di vetro, prima scongelare una matrice di matrice aliquota qualificata hESC a 4 gradi centigradi per 30 min.
  3. Aliquota 24 mL del mezzo freddo di Dulbecco Eagle (DMEM): miscela nutritiva F-12 (DMEM/F:12) in un tubo conico da 50 mL.
  4. Mescolare il supporto freddo DMEM/F:12 con una pipetta di vetro da 2 mL per raffreddare la superficie della pipetta.
  5. Utilizzando la stessa pipetta, occupano circa 500-700 l di DMEM/F:12 freddo e si mescolano con la matrice a matrice a matrice a matrice adattata all'HESC all'interno del tubo di microcentrismo.
  6. Una volta mescolata correttamente, trasferire la soluzione al tubo conico da 50 mL contenente il freddo DMEM/F:12 e mescolare di nuovo.
  7. Per un piatto standard a 6 po', aggiungere 1 mL di questa miscela ad ogni pozzo. Assicurarsi che il pozzo sia interamente coperto. Lasciare le piastre a RT sotto la cappa di coltura dei tessuti per almeno 30 min. Se lo si desidera, conservare a 4 gradi centigradi subito dopo la placcatura per un massimo di 1 settimana di equilibrato e a RT per 30 minuti prima dell'uso.
  8. Per utilizzare le piastre, aspirare la matrice e sostituirla con supporti appropriati. Utilizzare immediatamente.
  9. Conservare i coperchi di vetro in un ambiente sterile (ad esempio, all'interno di una cappa di coltura di tessuto sterile).
  10. Prima del rivestimento, pulire ogni singola coverslip con 70% di etanolo. Una volta che il coperchio è asciutto, metterlo all'interno di un pozzo di una piastra sterile 6 bene.
  11. Prendere 250-300 l della soluzione a matrice qualificata hESC e dispensare con cura direttamente al centro del coperchio di vetro. Lasciare le copricopertine a RT sotto la cappa di coltura dei tessuti per almeno 30 min prima dell'uso.

3. Preparazione di piccole molecole

NOTA: Ricostituire tutte le piccole molecole e modulatori Wnt in DMSO se non diversamente specificato.

  1. Preparare 10 mM di 25 gradi centigradi ciascuno di IWR-1 e CHIR 99021 e conservare a -20 gradi centigradi.
  2. Ricostituire 10 mm di aliquote di 50 gradi centigradi ciascuno di Thiazovivin (inibitore del ROCK) e conservare a -20 gradi centigradi.

4. Manutenzione e passaggi degli iPSC

NOTA: Eseguire tutte le operazioni seguenti in una cappa di coltura di tessuto sterile.

  1. Mantenere gli iPSC in lastre standard 6 pozzi ed eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili. Mantenere le celle con 2 mL di supporti hiPSC per pozzo. Cambiare i media ogni due giorni. Mantenere le cellule a 37 gradi centigradi, 6% O2, 5% CO2. Passare le cellule quando sono tra 70-80% confluente.
  2. PBS PbS senza Ca2 e Mg2 a RT.
  3. Per avviare il processo di passaggio, aggiungere 1 mL di PBS senza Ca2 e Mg2 al pozzo che deve essere passaggio. Incubare a RT per 7-10 min. Controllare le cellule sotto il microscopio per assicurarsi che il trattamento PBS non abbia portato a una completa dissociazione del monostrato.
  4. Rimuovere PBS e sostituirlo con 1 mL di supporti passaging. Utilizzare un sollevatore di celle per raschiare delicatamente e sollevare le cellule dalla superficie del pozzo.
  5. Dissociare meccanicamente le cellule utilizzando una pipetta di vetro sterile da 2 mL. Ripetere fino a quando le cellule sono ben dissociate in modo uniforme in piccole colonie quando osservate al microscopio.
  6. Una volta che le cellule sono state sufficientemente dissociate, aggiungere 5 mL di supporti passaging per dividere le cellule 1:6. Regolare la quantità di supporti passaging da aggiungere in modo che corrisponda al rapporto di divisione preferito.
  7. Aspirare la matrice qualificata hESC dalla piastra rivestita a matrice hESC e sostituirla con 1 mL di supporti passaging per pozzo. Aggiungere 1 mL di cellule dissociate per pozzo.

5. Differenziazione cardiomiocita

  1. Utilizzare linee hiPSC che sono ben consolidate (più di 20 passaggi) ed esibiscono una morfologia omogenea prima di iniziare la differenziazione cardiaca.
  2. Assicurarsi che gli iPSC siano circa 70-80% confluente.
  3. Lavare le celle 1x in PBS senza Ca2 e Mg2.
  4. Aggiungere 2 mL di supporto D0 (passaggio 1,7) per pozzo e trasferire le cellule nell'incubatrice.
  5. Dopo 24 h, sostituire con 3 mL di supporti D1 per pozzo per 48 h.
  6. Il giorno 3, sostituire il supporto con 2 mL di supporti D3 per pozzo. Ripetere con i supporti D4 il giorno 4.
  7. Il giorno 5, sostituire il supporto con 3 mL di supporti D5 per pozzo.
  8. Il giorno 7, sostituire i supporti con 3 mL di supporti D7 per pozzo e trasferirli in un'incubatrice con 37 gradi centigradi, il 5% di CO2e la normale concentrazione di O2. Sostituire il supporto D7 (RPMI - B27) ogni 2 giorni.

6. Procedura di selezione e dissociazione iPSC-CM

  1. Dieci giorni prima di eseguire le misurazioni transitorie di Ca2 o qualsiasi analisi funzionale, sostituire il supporto RPMI - B27 con 3 mL di supporti di selezione per pozzo per 48 h.
  2. Sostituire il supporto con 3 mL di supporti di selezione per altri 48 h.
  3. Sostituire il supporto con 2 mL di RPMI - B27 supporti per pozzo per 24 h.
  4. Cappotto standard 6 piastre come descritto nella sezione 2.
  5. Aggiungere 1 mL di sterile 0.25% trypsin con EDTA ad ogni pozzo. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 5 min.
  6. Utilizzando una pipetta da 1.000 luna, dissociare meccanicamente le cellule in modo che le singole cellule possano essere osservate quando osservate al microscopio.
  7. Trasferire le cellule su un tubo conico sterile da 15 mL e aggiungere 2 mL di RPMI 20 supporti per pozzo. Centrifuga per 5 min a 800 x g.
  8. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in RPMI - B27 media. Aspirati la matrice qualificata hESC dalle piastre e sostituite con 1 mL di RPMI - supporto B27.
  9. Utilizzando una punta di pipetta da 1.000 mL, dissociare meccanicamente il pellet cellulare fino a quando la soluzione non appare omogenea.
  10. Trasferire circa 500.000 cellule ad ogni pozzo. Trasferimento in incubatrice per 24 ore.
  11. Sostituire il supporto con 3 mL di supporti di selezione per bene per 48 h.
  12. Sostituire il supporto con 3 mL di RPMI - B27 per pozzo. Mantenere le celle in supporti D7 (RPMI - B2 che cambiano i supporti ogni 2 giorni fino a quando non sono pronti per l'analisi funzionale.

7. Preparazione di iPSC-CMs per la citometria di flusso

  1. Una volta che le cellule sono dell'età desiderata e sono state sottoposte a selezione metabolica (sezione 6), lavare le cellule con PBS senza Ca2 e Mg2.
  2. Aggiungete 1 mL di prove 0,25% e incubate per 5-7 min a 37 gradi centigradi.
  3. Pipette la miscela 5-10x con una punta P1000 per singolarizzare le cellule, e trasferire a un tubo da 15 mL contenente 2 mL di RPMI 20.
  4. Girare le cellule a 600 x g per 5 min.
  5. Aggiungere 100 l di soluzione di fissaggio (4% PFA) al pellet cellulare. Aggiungere la soluzione goccia con vortice continuo e delicato e poi impostare sul ghiaccio per 15 min.
  6. Aggiungere 1,5 mL di PBS. Raccogliere le cellule con la centrifugazione e aspirare il supernatante.
  7. Per ogni esperimento, includere un controllo non colorato per condizione di fissazione/permeabilizzazione.
  8. Risospendere le celle in 500 - L di soluzione di blocco (2% FBS/2% BSA in PBS con 0.1% NP-40) per 30 min a RT.
  9. Senza rimuovere la soluzione di blocco, aggiungere l'anticorpo primario MLC2V/MLC2A (5 mg/mL) e incubare 45 min a RT.
  10. Lavare con buffer di blocco. Raccogliere le cellule con la centrifugazione e la soluzione aspirato.
  11. Aggiungere l'anticorpo secondario Alexa Fluor 555/488(1:750) diluito nel buffer di blocco per 45 min a RT o durante la notte a 4 gradi centigradi.
  12. Aggiungere 1,5 mL di PBS. Raccogliere le cellule con la centrifugazione e la soluzione aspirato.
  13. Risospendere le celle in 250-300 -L di PBS. Utilizzare una pipetta P1000 per disaggregare le cellule.
  14. Preparare i tubi rotondi con un tappo di colino a rete di nylon da 35 m. Pre-bagnato il colino cellulare con 50 gradi L di PBS e impostare il tubo sul ghiaccio.
  15. Trasferire la soluzione con le cellule disaggregate ai tubi rotondi con i tappi del colino cellulare. Lasciare che la soluzione cellulare per drenare naturalmente o toccare il fondo del tubo contro una superficie piana, se necessario, per garantire il drenaggio completo e la raccolta delle cellule nel tubo. Assicurarsi di rimettere il tubo sul ghiaccio il prima possibile.
  16. Sciacquare il colino cellulare con 250 l di PBS per recuperare eventuali cellule residue.
  17. Mantenere i tubi sul ghiaccio e coprire con un foglio di alluminio fino all'analisi della citometria di flusso.

8. Placcatura Cardiomiociti su coperture di vetro

NOTA: eseguire tutti i passaggi in un ambiente sterile.

  1. Preparare i copricopertine in vetro come descritto nei passaggi 2.10 e 2.11.
  2. Una volta che gli iPSC-CMs sono stati selezionati e sono dell'età desiderata, seguire i passaggi 6,5-6,7 per dissociare gli iPSC-CMs.
  3. Aspirare il superatante e risospendere le cellule in una quantità sufficiente di supporti RPMI 20 per avere circa 300.000 cellule per 250 .
  4. Utilizzando una pipetta di vetro da 2 mL, dissociare meccanicamente il pellet cellulare fino a quando la soluzione non appare omogenea.
  5. Aspirare la matrice qualificata hESC dai coverlips.
  6. Utilizzando una pipetta da 1000 luna, mescolare e tirare 250 l della soluzione dal tubo conico da 15 mL.
  7. Eroga lentamente i 250 gradi della soluzione sui coperchi del vetro, facendo particolare attenzione ad aggiungere solo all'area in cui è presente il rivestimento a matrice qualificato hESC.
  8. Trasferire con attenzione all'incubatrice e lasciare durante la notte, avendo cura di non scuotere o diffondere le cellule sui copriletti. La mattina successiva, aggiungere delicatamente 2 mL di supporto D7 (RPMI - B27) ad ogni pozzo con la coverslip. Cambiare il supporto dopo 24 h e ogni 2 giorni dopo.

9. Fissare le cellule

  1. Assicurarsi che una quantità adeguata di PBS con Ca2 e Mg 2e l'equilibratità sia fissata a 4 gradi centigradi.
  2. Preparare una soluzione di paraformaldeide (PFA) del 4% diluita in PBS con Ca2 e Mg2 e un'equilibratura a 4 gradi centigradi.
  3. Una volta che gli iPSC-CMs sono di età appropriata, hanno subito una selezione metabolica (sezione 6), e sono stati placcati su appendici (sezione 8), lavare le cellule 3x con 1 mL di PBS freddo con Ca2 e Mg2 per bene.
  4. Aggiungere 1 mL di freddo 4% PFA e lasciare le celle a RT sotto il cofano per 15 min.
  5. Lavare le cellule con PBS freddo per rimuovere l'eccesso di PFA.
  6. Aggiungete 2 mL di PBS con Ca2 e Mg2 e conservatevi a 4 gradi centigradi.

10. Immunofluorescenza Colorazione

  1. Rimuovere PBS dalle celle fisse e aggiungere 1 mL di buffer di blocco. Incubare per 1 h a RT.
  2. Rimuovere il buffer di blocco e aggiungere l'anticorpo primario (5 mg/mL) diluito nel buffer di blocco. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
  3. Lavare 3x in PBS con Ca2 e Mg2 per 5 min ciascuno.
  4. Aggiungere l'anticorpo secondario diluito nel buffer di blocco 1:1,000.
  5. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e incubare per 45 min a RT. Mantenere la lamina di alluminio per i seguenti passaggi.
  6. Lavare 3x in PBS con Ca2 e Mg2,5 min ciascuno.
  7. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di lavoro DAPI per coprire completamente le cellule e incubare a RT per 10 min.
  8. Lavare accuratamente il campione con PBS con Ca2 e Mg2 per rimuovere l'eccesso daPI.
  9. Prendere nuovi vetrini di vetro e aggiungere una goccia di supporto di montaggio nel mezzo. Utilizzare il contagocce per distribuire uniformemente il supporto di montaggio. Mettere i copricopertine con le celle a faccia in giù sui vetrini.
    NOTA: Le celle possono essere conservate per 30 giorni se protette dalla luce.

11. Valutazione dei transitori intracellulari Ca2

  1. Una volta che gli iPSC-CM hanno almeno 3 mesi, hanno subito una selezione metabolica (sezione 6), e sono stati placcati su cover, trattarli con 2 : L di Fura-2, AM (concentrazione finale: 1 M) e incubare a 37 gradi centigradi per 10 min.
    NOTA: Fura-2 è sensibile alla luce. Eseguire tutte le procedure di caricamento e gli esperimenti al buio.
  2. Preparare il sistema di acquisizione e analisi del calcio e della contrattilità.
    1. Alimentare il sistema assicurando che la lampada ad arco vieneavviata( Figura 1B).
    2. Posizionare la camera sul sistema e collegare i tubi dalla pompa all'ingresso e alle prese appropriate e il filo elettrico dallo stimolatore alla camera come mostrato nella Figura 1C.
    3. Riempire il tubo di perfusione che attraversa il riscaldatore in linea fluido con la soluzione di Tyrode preriscaldato a 37 gradi centigradi.
    4. Regolare le dimensioni della fotocamera e dell'apertura dell'inquadratura per ridurre al minimo l'area di sfondo.
  3. Montare un coperchio di vetro con iPSC-CMs nella camera e fissare.
  4. Aggiungere 500 -L della soluzione di Tyrode direttamente sopra il coperchio in vetro fissato delicatamente e iniziare a perfondere la camera (1,5 mL/min) con la soluzione di Tyrode.
  5. Pace iPSC-CMs con stimolazione sul campo di 1 Hz utilizzando lo stimolatore elettrico (10 V, 4 ms).
  6. Incubare iPSC-CMs nella camera con stimolazione per almeno 3/5 min per le cellule per lavare il coloranti Fura-2 e adattarsi all'ambiente e lavare il coloranti fluorescente.
  7. Regolare la finestra di visualizzazione all'area superiore sinistra della vetrina di vetro.
  8. Iniziare la registrazione.
  9. Dopo aver raccolto un flusso coerente di picchi di 5-10, fate clic su Pausa per interrompere temporaneamente la registrazione.
  10. Garantire che né lo stato attivo né le dimensioni della finestra di visualizzazione vengano modificati, spostare lo stage del microscopio nell'area adiacente, spostarsi verso l'estremità opposta e riprendere la registrazione.
  11. Ripetere i passaggi 11.9 e 11.10 per eseguire la scansione su copertina, inizialmente spostandosi a sinistra, quindi verso il basso in modo a zig-zag per coprire l'intera area coverslip. Questo consiste di 80-100 misurazioni per coverslip.
    NOTA: Limitare il tempo di misurazione totale a 10 min, poiché i fattori secondari causano una diminuzione di Ca2 o transitori.
  12. Una volta acquisiti i transitori Ca2, analizzare i dati con il software di analisi delle tracce di fluorescenza secondo le istruzioni del produttore.

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Risultati

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Il protocollo descritto nella Figura 1A ha generato cardiomiociti altamente puri che acquisiscono un fenotipo ventricolare/adulto con il tempo nella coltura. Come valutato dalla colorazione immunofluorescenza per la miosina regolatrice atriale e ventricolare catena di luce 2 isoformi (MLC2A e MLC2V, rispettivamente), la maggior parte delle cellule generate da questo protocollo sono state MLC2A-positivo al giorno 30 dopo l'induzione della differenziazione, mentre MLC2V è stat...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I passaggi critici per l'utilizzo di iPSC-CMs umani come modelli sperimentali sono: 1) la generazione di cardiomiociti di alta qualità (VM) in grado di garantire prestazioni costanti e risultati riproducibili; 2) permettere alle cellule di maturare in coltura per almeno 90 giorni per valutare adeguatamente il loro fenotipo; 3) eseguire studi elettrofisiologici, ad esempio misurazioni transitorie di calcio (Ca2), per fornire una caratterizzazione funzionale fisiologicamente rilevante degli iPSC-CM umani. Abbiam...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata sostenuta da AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Premio Mount Sinai KL2 Scholars per lo sviluppo della carriera di ricerca clinica e traslazionale KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 e AHA 18TPA34170460 (C.K.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anti-actina, &alfa;-Liscio muscolo anticorpo, monoclonale di topoSigma AldrichA5228
Alexa Fluor 488 capra anti topoInvitrogenA11001
Alexa Fluor 555 capra anti coniglioInvitrogenA21428
B27 IntegratoreGibco17504-044
B27(-) insulina IntegratoreGibcoA18956-01
CHIR-99021SelleckchemS2924
DAPI colorante nucleareThermoFisherD1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-Glutammina + 15mM HepesGibco11330-032
Sollevatore di cellule a doppia estremità, lama piatta e J-HookCelltreat229306
Piastra per coltura tissutale Falcon Multiwell, 6 pozzettiCorning353046
Riscaldatore fluidico in lineaLive Cell InstrumentIL-H-10
Fura-2, AMInvitrogenF1221
qualificata hESCCorning354277Matrigel Matrix
hPSC mediaGibcoA33493-01StemFlex Basal Medium
IWR-1Sigma AldrichI0161
Camera di imaging per cellule viveStrumento per cellule viveEC-B25
MLC-2A, anticorpo monoclonale di topoSistemi sinaptici311011
Calcio miocitario e sistema di contrattilitàIonoptixISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, policlonale di coniglio (MLC2V)Proteintech10906-1-AP
Nalgene Unità filtranti sterili monouso a flusso rapido con membranaPESThermoFisher124-0045
PBS con Calcio e MagnesioCorning21-030-CV
PBS senza Calcio e MagensioCorning21-031-CV
Premium Glass Cover SlipsLab Scientific7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucosio (1X)Gibco11879-020
RPMI medium 1640 (1X)Gibco11875-093
L-lattato di sodioSigma AldrichL7022
Integratore StemFlexGibcoA33492-01
ThiazovivinTocris3845
Tripsina-EDTA (0,25%)ThermoFisher25200056
soluzione di TyrodeBoston BioproductsBSS-355wRegolare il pH a 7,2. Aggiungere 1,2 mM di cloruro di calcio
matrice

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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