Generazione di Cardiomiociti Ventricular-Like HiPSC-Derived e preparati cellulari di alta qualità per la caratterizzazione della movimentazione del calcio

Summary

Qui descriviamo e convalidiamo un metodo per generare costantemente robusti cardiomiociti derivati da cellule staminali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo e caratterizzano la loro funzione. Queste tecniche possono aiutare a sviluppare informazioni meccanicistiche sui percorsi di segnalazione, fornire una piattaforma per lo screening farmacologico su larga scala e modellare in modo affidabile le malattie cardiache.

Abstract

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CMs) forniscono una preziosa fonte umana per studiare la scienza di base delle vie di manipolazione e segnalazione del calcio (Ca^2),nonché i saggi di screening e tossicità per i farmaci ad alto rendimento. Qui, forniamo una descrizione dettagliata delle metodologie utilizzate per generare iPSC-CMs di alta qualità in grado di riprodurre costantemente caratteristiche molecolari e funzionali attraverso diverse linee cellulari. Inoltre, viene descritto un metodo per valutare in modo affidabile la loro caratterizzazione funzionale attraverso la valutazione delle proprietà di gestione di Ca^2. Condizioni di ossigeno basso (O_2),selezione del lattato e tempo prolungato in coltura producono cardiomiociti ventricolari ad alta purezza e di alta qualità. Simile ai cardiomiociti di ratti adulti isolati (ARCM), gli iPSC-CM di 3 mesi presentano un'ampiezza Ca^{2 o} superiore, un tasso più veloce di riupposizione di Ca² o (decay-tau) e una risposta lusitropica positiva alla stimolazione zorrenergica rispetto ai 30 iPSC-CMs del giorno 30. La strategia è tecnicamente semplice, conveniente e riproducibile. Fornisce una solida piattaforma per modellare le malattie cardiache e per lo screening farmacologico su larga scala per colpire le proteine che maneggiano Ca^2.

Introduction

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CMs) sono un'attraente piattaforma a base umana per modellare una grande varietà di malattie cardiache in vitro^{1,2,3,4,5,6,7,8}. Inoltre, iPSC-CMs può essere utilizzato per la previsione di risposte dei pazienti a farmaci nuovi o esistenti, per lo screening composti colpiti, e sviluppare nuovi farmaci personalizzati

Protocol

Gli esperimenti che utilizzano cardiomiociti per ratti adulti in questo studio sono stati condotti con protocolli Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) approvati della Icahn School of Medicine sul Monte Sinai. I cardiomiociti di ratto adulti sono stati isolati dai cuori di ratto Sprague Dawley con il metodo basato su Langendorff come descritto in precedenza¹⁶.

1. Preparazione dei mezzi di comunicazione

1. Preparare i supporti hiPSC.
   1. Elittore il supplemento e il mezzo basale a temperatura ambiente (RT). Assicurarsi che il supplemento si sia scongelato completamente. Mescolare 400 mL del me....

Results

Il protocollo descritto nella Figura 1A ha generato cardiomiociti altamente puri che acquisiscono un fenotipo ventricolare/adulto con il tempo nella coltura. Come valutato dalla colorazione immunofluorescenza per la miosina regolatrice atriale e ventricolare catena di luce 2 isoformi (MLC2A e MLC2V, rispettivamente), la maggior parte delle cellule generate da questo protocollo sono state MLC2A-positivo al giorno 30 dopo l'induzione della differenziazione, mentre MLC2V è stat.......

Discussion

I passaggi critici per l'utilizzo di iPSC-CMs umani come modelli sperimentali sono: 1) la generazione di cardiomiociti di alta qualità (VM) in grado di garantire prestazioni costanti e risultati riproducibili; 2) permettere alle cellule di maturare in coltura per almeno 90 giorni per valutare adeguatamente il loro fenotipo; 3) eseguire studi elettrofisiologici, ad esempio misurazioni transitorie di calcio (Ca²⁾, per fornire una caratterizzazione funzionale fisiologicamente rilevante degli iPSC-CM umani. Abbiam.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-actina, &alfa;-Liscio muscolo anticorpo, monoclonale di topo	Sigma Aldrich	A5228
Alexa Fluor 488 capra anti topo	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 555 capra anti coniglio	Invitrogen	A21428
B27 Integratore	Gibco	17504-044
B27(-) insulina Integratore	Gibco	A18956-01
CHIR-99021	Selleckchem	S2924
DAPI colorante nucleare	ThermoFisher	D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-Glutammina + 15mM Hepes	Gibco	11330-032
Sollevatore di cellule a doppia estremità, lama piatta e J-Hook	Celltreat	229306
Piastra per coltura tissutale Falcon Multiwell, 6 pozzetti	Corning	353046
Riscaldatore fluidico in linea	Live Cell Instrument	IL-H-10
Fura-2, AM	Invitrogen	F1221
qualificata hESC	Corning	354277	Matrigel Matrix
hPSC media	Gibco	A33493-01	StemFlex Basal Medium
IWR-1	Sigma Aldrich	I0161
Camera di imaging per cellule vive	Strumento per cellule vive	EC-B25
MLC-2A, anticorpo monoclonale di topo	Sistemi sinaptici	311011
Calcio miocitario e sistema di contrattilità	Ionoptix	ISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, policlonale di coniglio (MLC2V)	Proteintech	10906-1-AP
Nalgene Unità filtranti sterili monouso a flusso rapido con membrana	PESThermoFisher	124-0045
PBS con Calcio e Magnesio	Corning	21-030-CV
PBS senza Calcio e Magensio	Corning	21-031-CV
Premium Glass Cover Slips	Lab Scientific	7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucosio (1X)	Gibco	11879-020
RPMI medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093
L-lattato di sodio	Sigma Aldrich	L7022
Integratore StemFlex	Gibco	A33492-01
Thiazovivin	Tocris	3845
Tripsina-EDTA (0,25%)	ThermoFisher	25200056
soluzione di Tyrode	Boston Bioproducts	BSS-355w	Regolare il pH a 7,2. Aggiungere 1,2 mM di cloruro di calcio