Qui, presentiamo un protocollo di test immunoistochimico per la rilevazione dell'antigene del virus della rabbia come test diagnostico alternativo per i tessuti fissati alla formalina.
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Articolo metodologico
Test immunoistochimico per il rilevamento dell'antigene del lyssavirus da tessuti fissati con formalina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una delle principali modalità diagnostiche per la rabbia è il rilevamento del complesso virale ribonucleoproteina (antigene) (antigene) nei campioni di tessuto infetto. Mentre il test degli anticorpi fluorescenti diretti (DFA) o il test immunoistochimico rapido diretto (DRIT) sono più comunemente utilizzati per il rilevamento dell'antigene, entrambi i test richiedono tessuti freschi e / o congelati per le impronte sui vetrini prima del rilevamento dell'antigene utilizzando anticorpi. Se i campioni vengono raccolti e fissati in formalina, nessuno dei due test è ottimale per il rilevamento dell'antigene, tuttavia, il test può essere eseguito mediante immunoistochimica convenzionale (IHC) dopo l'incorporamento in blocchi di paraffina e sezionamento. Con questo metodo IHC, i tessuti vengono colorati con anticorpi antirabbici, le sezioni vengono deparaffinizzate, l'antigene recuperato mediante proteolisi parziale o altri metodi e incubato con anticorpi primari e secondari. Gli antigeni vengono colorati utilizzando perossidasi di rafano / amminoetilcarazolo e contromacchiati con ematossilina per la visualizzazione utilizzando un microscopio ottico. Oltre al rilevamento specifico dell'antigene, la fissazione della formalina offre altri vantaggi come la determinazione dei cambiamenti istologici, condizioni rilassate per la conservazione e il trasporto dei campioni (a temperatura ambiente), capacità di testare casi retrospettivi e una maggiore sicurezza biologica attraverso l'inattivazione di agenti infettivi.
Introduzione
La rabbia è un'encefalite progressiva acuta causata dai virus a RNA a senso negativo appartenenti al genere lyssavirus1. Quasi il 99% di tutti i decessi umani causati dall'infezione da virus della rabbia (RABV), il tipo di membro del genere, è trasmesso dai cani2. La diagnosi di rabbia di animali sospetti si basa sulla rilevazione di antigene (principalmente nucleoproteina codificata virale, proteina N) in complesso con RNA genomico (complesso ribonucleoproteico, RNP) nel tessuto cerebrale3. Il rilevamento dell'antigene mediante il test degli anticorpi fluorescenti diretti (DFA) è considerato il g....
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Protocollo
Mentre il protocollo IHC è stato eseguito su tessuti fissati alla formalina, che inattiva RABV se presente, devono essere seguiti correttamente protocolli di biosicurezza appropriati. Tutte le procedure di biosicurezza sono descritte nella Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluso l'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) e l'obbligo di vaccinazione come descritto12. Inoltre, dovrebbe essere seguito un corretto contenimento e manipolazione di sostanze chimiche pericolose (come formalina, AEC e xilene) (ad esempio, cappe as....
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Risultati
La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi della colorazione IHC di campioni di controllo positivi e negativi in diversi tessuti cerebrali testati. La Figura 2A,D,G rappresenta campioni positivi a 200x, mentre la Figura 2B,E,H corrisponde rispettivamente all'ingrandimento 400x. Figura 2A-C corrisponde al tronco cereb.......
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Discussione
A causa dell'elevato tasso di mortalità della rabbia dopo l'insorgenza dei sintomi, la diagnosi di animali sospetti per l'infezione da RABV è estremamente critica per un appropriato trattamento profilattico post-esposizione. La diagnosi di rabbia dipende principalmente da tecniche basate su DFA, DRIT e PCR che utilizzano tessuti freschi o congelati. Per il test di tessuti fissati alla formalina, il test IHC fornisce un metodo alternativo per il rilevamento sensibile e specifico dell'antigene RABV. Mentre i tessuti fissat.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i laboratori, gli epidemiologi e gli affiliati con i dipartimenti di sanità pubblica per la presentazione di campioni ai Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie. I risultati e le conclusioni di questo rapporto sono quelli degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale dei Centers for Disease Control and Prevention. L'uso di nomi commerciali e fonti commerciali è solo per l'identificazione e non implica l'approvazione da parte dei Centers for Disease Control and Prevention.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3% perossido di idrogeno | Pharamacy marche | Pronto all'uso 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-etilcarbazolo (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetato Tampone pH 5.2 | Poly Scientific R& D Corp. | s140 | |
| Formalina tamponata 10% fosfato tamponato | Fisher Scientific | SF100-4 | Certificato |
| Vetrini coprioggetti Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Etanolo 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Etanolo 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Formulazione dell'ematossilina di Gill #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| Kit Biotina-Streptavidina Perossidasi | Seracare | 71-00-18 | Anticorpo primario di topo |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Terreno di montaggio |
| N,N, Dimetil formammide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Obiettivo | Fornitori | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Obiettivo | Fornitori multipli | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Proteasi, Streptomyces griseus |
| Acqua del rubinetto di Scott | Poly Scientific R& D Corp. | s1887 | |
| Set di coloranti per vetrini Tissue-Tek | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Grado istologico |
| Zeiss Axioplan 2 imaging - microscopio |
Riferimenti
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384<....
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Ristampe e permessi
