Articolo metodologico

Test immunoistochimico per il rilevamento dell'antigene del lyssavirus da tessuti fissati con formalina

DOI:

10.3791/60138

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26 ottobre 2021

 , 
1Poxvirus and Rabies Branch, Division of High-Consequence Pathogens and Pathology, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo di test immunoistochimico per la rilevazione dell'antigene del virus della rabbia come test diagnostico alternativo per i tessuti fissati alla formalina.

Abstract

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Una delle principali modalità diagnostiche per la rabbia è il rilevamento del complesso virale ribonucleoproteina (antigene) (antigene) nei campioni di tessuto infetto. Mentre il test degli anticorpi fluorescenti diretti (DFA) o il test immunoistochimico rapido diretto (DRIT) sono più comunemente utilizzati per il rilevamento dell'antigene, entrambi i test richiedono tessuti freschi e / o congelati per le impronte sui vetrini prima del rilevamento dell'antigene utilizzando anticorpi. Se i campioni vengono raccolti e fissati in formalina, nessuno dei due test è ottimale per il rilevamento dell'antigene, tuttavia, il test può essere eseguito mediante immunoistochimica convenzionale (IHC) dopo l'incorporamento in blocchi di paraffina e sezionamento. Con questo metodo IHC, i tessuti vengono colorati con anticorpi antirabbici, le sezioni vengono deparaffinizzate, l'antigene recuperato mediante proteolisi parziale o altri metodi e incubato con anticorpi primari e secondari. Gli antigeni vengono colorati utilizzando perossidasi di rafano / amminoetilcarazolo e contromacchiati con ematossilina per la visualizzazione utilizzando un microscopio ottico. Oltre al rilevamento specifico dell'antigene, la fissazione della formalina offre altri vantaggi come la determinazione dei cambiamenti istologici, condizioni rilassate per la conservazione e il trasporto dei campioni (a temperatura ambiente), capacità di testare casi retrospettivi e una maggiore sicurezza biologica attraverso l'inattivazione di agenti infettivi.

Introduzione

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La rabbia è un'encefalite progressiva acuta causata dai virus a RNA a senso negativo appartenenti al genere lyssavirus1. Quasi il 99% di tutti i decessi umani causati dall'infezione da virus della rabbia (RABV), il tipo di membro del genere, è trasmesso dai cani2. La diagnosi di rabbia di animali sospetti si basa sulla rilevazione di antigene (principalmente nucleoproteina codificata virale, proteina N) in complesso con RNA genomico (complesso ribonucleoproteico, RNP) nel tessuto cerebrale3. Il rilevamento dell'antigene mediante il test degli anticorpi fluorescenti diretti (DFA) è considerato il g....

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Protocollo

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Mentre il protocollo IHC è stato eseguito su tessuti fissati alla formalina, che inattiva RABV se presente, devono essere seguiti correttamente protocolli di biosicurezza appropriati. Tutte le procedure di biosicurezza sono descritte nella Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluso l'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) e l'obbligo di vaccinazione come descritto12. Inoltre, dovrebbe essere seguito un corretto contenimento e manipolazione di sostanze chimiche pericolose (come formalina, AEC e xilene) (ad esempio, cappe as....

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Risultati

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La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi della colorazione IHC di campioni di controllo positivi e negativi in diversi tessuti cerebrali testati. La Figura 2A,D,G rappresenta campioni positivi a 200x, mentre la Figura 2B,E,H corrisponde rispettivamente all'ingrandimento 400x. Figura 2A-C corrisponde al tronco cereb.......

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Discussione

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A causa dell'elevato tasso di mortalità della rabbia dopo l'insorgenza dei sintomi, la diagnosi di animali sospetti per l'infezione da RABV è estremamente critica per un appropriato trattamento profilattico post-esposizione. La diagnosi di rabbia dipende principalmente da tecniche basate su DFA, DRIT e PCR che utilizzano tessuti freschi o congelati. Per il test di tessuti fissati alla formalina, il test IHC fornisce un metodo alternativo per il rilevamento sensibile e specifico dell'antigene RABV. Mentre i tessuti fissat.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo i laboratori, gli epidemiologi e gli affiliati con i dipartimenti di sanità pubblica per la presentazione di campioni ai Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie. I risultati e le conclusioni di questo rapporto sono quelli degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale dei Centers for Disease Control and Prevention. L'uso di nomi commerciali e fonti commerciali è solo per l'identificazione e non implica l'approvazione da parte dei Centers for Disease Control and Prevention.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3% perossido di idrogenoPharamacy marchePronto all'uso 3% H2O2
3-Amino-9-etilcarbazolo (AEC)Millipore SigmaA6926
Acetato Tampone pH 5.2Poly Scientific R& D Corp.s140
Formalina tamponata 10% fosfato tamponatoFisher ScientificSF100-4Certificato
Vetrini coprioggetti CorningFisher Scientific12-553-47124 X 50 mm
Etanolo 190 ProofPharmco-AAPER111000190
Etanolo 200 ProofPharmco-AAPER111000200
Formulazione dell'ematossilina di Gill #2Fisher ScientificCS401-1D
Kit Biotina-Streptavidina PerossidasiSeracare71-00-18Anticorpo primario di topo 
ImmunoHistoMountMillipore Sigmai1161Terreno di montaggio
N,N, Dimetil formammide GRFisher ScientificD119
Soluzione salina tamponata con fosfato HyCloneRR14440.0101M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 ObiettivoFornitori
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 ObiettivoFornitori multipli
PronaseMillipore Sigma53702Proteasi, Streptomyces griseus
Acqua del rubinetto di Scott Poly Scientific R& D Corp.s1887
Set di coloranti per vetrini Tissue-TekFisher Scientific50-294-72
TWEEN-80 Millipore SigmaP1754
XyleneFisher ScientificX3S-4Grado istologico
Zeiss Axioplan 2 imaging - microscopio
multipli

Riferimenti

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  1. Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
  2. Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384<....

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