Qui, presentiamo un protocollo di test immunoistochimico per la rilevazione dell'antigene del virus della rabbia come test diagnostico alternativo per i tessuti fissati alla formalina.
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Articolo metodologico
Test immunoistochimico per il rilevamento dell'antigene del lyssavirus da tessuti fissati con formalina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una delle principali modalità diagnostiche per la rabbia è il rilevamento del complesso virale ribonucleoproteina (antigene) (antigene) nei campioni di tessuto infetto. Mentre il test degli anticorpi fluorescenti diretti (DFA) o il test immunoistochimico rapido diretto (DRIT) sono più comunemente utilizzati per il rilevamento dell'antigene, entrambi i test richiedono tessuti freschi e / o congelati per le impronte sui vetrini prima del rilevamento dell'antigene utilizzando anticorpi. Se i campioni vengono raccolti e fissati in formalina, nessuno dei due test è ottimale per il rilevamento dell'antigene, tuttavia, il test può essere eseguito mediante immunoistochimica convenzionale (IHC) dopo l'incorporamento in blocchi di paraffina e sezionamento. Con questo metodo IHC, i tessuti vengono colorati con anticorpi antirabbici, le sezioni vengono deparaffinizzate, l'antigene recuperato mediante proteolisi parziale o altri metodi e incubato con anticorpi primari e secondari. Gli antigeni vengono colorati utilizzando perossidasi di rafano / amminoetilcarazolo e contromacchiati con ematossilina per la visualizzazione utilizzando un microscopio ottico. Oltre al rilevamento specifico dell'antigene, la fissazione della formalina offre altri vantaggi come la determinazione dei cambiamenti istologici, condizioni rilassate per la conservazione e il trasporto dei campioni (a temperatura ambiente), capacità di testare casi retrospettivi e una maggiore sicurezza biologica attraverso l'inattivazione di agenti infettivi.
Introduzione
La rabbia è un'encefalite progressiva acuta causata dai virus a RNA a senso negativo appartenenti al genere lyssavirus1. Quasi il 99% di tutti i decessi umani causati dall'infezione da virus della rabbia (RABV), il tipo di membro del genere, è trasmesso dai cani2. La diagnosi di rabbia di animali sospetti si basa sulla rilevazione di antigene (principalmente nucleoproteina codificata virale, proteina N) in complesso con RNA genomico (complesso ribonucleoproteico, RNP) nel tessuto cerebrale3. Il rilevamento dell'antigene mediante il test degli anticorpi fluorescenti diretti (DFA) è considerato il gold standard per la diagnosi dirabbia 4. Il metodo utilizza materiale cerebrale congelato fresco o fresco, un'impronta tattile su un vetrino, fissazione in acetone, colorazione utilizzando anticorpi fluorescenti isotiocianati (FITC) etichettati come monoclonali o policlonali (mAbs / pAbs) e letti dalla microscopia a fluorescenza5. Il test DFA è rapido, sensibile e specifico per il rilevamento dell'antigene della rabbia nel tessuto cerebrale fresco. Recentemente, un test immunoistochimico rapido diretto (DRIT), tecnica di immunoistochimica modificata (IHC), ha dimostrato di mostrare una sensibilità simile al DFA ma offre il vantaggio della microscopia ottica per lavisualizzazione 6. Mentre il metodo di rilevamento utilizzato in DRIT è simile a IHC, la fase iniziale utilizza tessuti freschi o congelati per generare impressioni tattili del campione seguite dalla fissazione in formalina.
L'IHC è una tecnica ampiamente utilizzata per determinare i cambiamenti istologici e il rilevamento di proteine utilizzando anticorpi specifici in tessuti fissati con formalina incorporati in blocchi di paraffina. IHC è un test alternativo consolidato per il rilevamento dell'antigene della rabbia nelle sezioni tissutali7. IHC è stato particolarmente utilizzato per la diagnosi di casi retrospettivi che hanno mostrato malattie neurologiche per determinare il carico dellarabbia 8. I tessuti fissati in formalina incorporati nella paraffina preservano le proteine per il rilevamento anche dopo diversi anni se conservati a temperatura ambiente9. Il trattamento con formalina modifica le proteine attraversando e alterando le catene laterali degli aminoacidi, il che potrebbe rendere gli epitopi non più reattivi contro gli anticorpi10. Mentre il test IHC per il rilevamento dell'antigene della rabbia coinvolge mAbs o pAbs, quest'ultimo è vantaggioso in quanto possono essere rilevati più epitopi e lyssavirus divergenti11.
Le fasi standard coinvolte nell'IHC sono la fissazione della formalina dei tessuti, l'incorporamento in blocchi di paraffina, il sezionamento dei tessuti, la deparaffinizzazione e l'idratazione, il recupero dell'epitopo, la reattività contro gli anticorpi primari e secondari e lo sviluppo utilizzando substrati cromogenici. Questo manoscritto descrive un resoconto dettagliato del protocollo per la diagnosi della rabbia. Per il rilevamento dell'antigene della rabbia, viene utilizzato il siero di topo immunizzato con RABV (pAbs) generato presso i Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC) di Atlanta, in Georgia, in combinazione con anticorpi secondari anti-topo biotinilati. Gli addominali biotinilati sono rilevati dall'aggiunta del complesso streptaviduina-rafano perossidasi (HRP) seguito dallo sviluppo del colore con substrato amino-etilcarbazolo.
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Protocollo
Mentre il protocollo IHC è stato eseguito su tessuti fissati alla formalina, che inattiva RABV se presente, devono essere seguiti correttamente protocolli di biosicurezza appropriati. Tutte le procedure di biosicurezza sono descritte nella Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluso l'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) e l'obbligo di vaccinazione come descritto12. Inoltre, dovrebbe essere seguito un corretto contenimento e manipolazione di sostanze chimiche pericolose (come formalina, AEC e xilene) (ad esempio, cappe aspiranti).
1. Fissazione della formalina dei tessuti
- Posizionare i tessuti cerebrali di 3-5 mm raccolti dopo l'autopsia13 in una soluzione di formalina tamponata con fosfato al 10% (rapporto tessuto/formalina da 1:20 a 1:50) per 24-72 ore.
ATTENZIONE: La formalina è un fissativo tossico. - Registrare il peso approssimativo del tessuto (dimensioni), il tipo di tessuto (aree cerebrali) e il volume di formalina. È importante che i laboratori documentino e mantengano registri sui tempi di fissazione.
- Per una conservazione più lunga del tessuto dopo la fissazione della formalina e prima della lavorazione, posizionare il tessuto in etanolo al 70%.
2. Lavorazione dei tessuti
- Dopo la fissazione del campione, sezionare il tessuto per includere le aree cerebrali importanti, ad esempio le sezioni trasversali del tronco cerebrale, del cervelletto (3 lobi) o dell'ippocampo (entrambi gli ippocampi) ciascuno tagliato da 3 a 5 mm di spessore e inserito in cassette di elaborazione.
- Elaborare le cassette di tessuto per l'infiltrazione di cera di paraffina, incorporate in blocchi di paraffina e sezionate (da 3 a 6 μm) su un microtomo.
3. Preparazione dei materiali / colorazione dei piatti
- Impostare la macchia14 (Tabella dei materiali) come mostrato nella Figura 1. Riempire ogni piatto con 250 ml di soluzione.
- Preparazione della soluzione stock di substrato 3-ammino-9-etilcarbizolo (AEC)
- Sciogliere una compressa da 20 mg di 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC) in 5 ml di N,N, dimetilformammide usando una pipetta di vetro.
ATTENZIONE: AEC è cancerogeno.
- Sciogliere una compressa da 20 mg di 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC) in 5 ml di N,N, dimetilformammide usando una pipetta di vetro.
- Preparazione della soluzione stock di proteasi (ad es. Pronase) per il recupero dell'antigene
- Sciogliere 7 mg della proteasi in 200 ml di PBS.
- Preparazione del tampone di risciacquo PBS-T
- Aggiungere 10 ml di Tween da 80 a 990 mL di PBS. Mescolare bene per formare una soluzione omogenea.
4. Deparaffinizzazione e reidratazione dei tessuti
- Fare una sezione di paraffina da 5 μm usando un microtomo, farla galleggiare a bagnomaria a 38 °C e raccogliere su vetrini. Etichettare i vetrini con una penna/pennarello resistente ai reagenti.
- Posizionare i vetrini su un vassoio e sciogliere in forno a 55-60 °C per 1 ora. Non alzare la temperatura al di sopra di 60 °C in quanto può distruggere l'antigene virale.
- Togliere i vetrini dal forno e deparaffinizzare immediatamente in 3 risciacqui consecutivi di xilene da 5 min ciascuno nei piatti 1, 2 e 3.
- Reidratare le sezioni sul vetrino mediante immersioni sequenziali diminuendo la diluizione dell'etanolo in acqua deionizzata: (da 4 a 11 è un risciacquo a immersione) piatto 4: xilene/ 100% etanolo (1:1); piatto 5: 100% etanolo; piatto 6: 100% etanolo; piatto 7: 95% di etanolo; piatto 8: 95% etanolo; piatto 9: 80% di etanolo; piatto 10: 70% etanolo; piatto 11: acqua deionizzata (Figura 1. Allestimento del piatto).
ATTENZIONE: Lo xilene è una sostanza chimica pericolosa e il lavoro deve essere condotto in una cappa aspirante.
5. Recupero dell'antigene proteolitico
- Trattare i vetrini con la proteasi (2,5 μg/mL di PBS) per 30 minuti per il recupero dell'antigene proteolitico nel piatto 12.
- Quindi risciacquare in PBS-T per 10 minuti (piatto 13).
- Trattare con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti (piatto 14).
- Ancora una volta, lavare con PBS-T per 10 minuti (piatto 15).
6. Procedura di colorazione
- Maneggiare le diapositive una alla volta mantenendo le diapositive rimanenti immerse nel buffer (non rimuovere l'intero supporto della slitta - mantenere le diapositive bagnate). Rimuovere un vetrino e asciugare il tampone in eccesso (usando un tovagliolo di carta) da intorno alla sezione del tessuto facendo attenzione a non disturbare la sezione del tessuto. Incubare i vetrini in una camera di umidità, realizzati posizionando asciugamani di carta inumiditi, sul banco da laboratorio14 a temperatura ambiente con normale siero di capra (blocco) per 15 minuti.
- Incubare con l'anticorpo antirabbico primario di diluizione predeterminato ottimale (diluizione 1:250 del siero antirabbico di topo, non pubblicato) (controllo positivo) e anticorpi di controllo negativi a temperatura ambiente come sopra (fase 6.1.) per 60 minuti senza lavaggi intermedi.
- Dopo 60 minuti, lavare con PBS-T per 10 minuti (piatto 16).
- Incubare con l'anticorpo biotinilato (specie specifica) in una camera di umidità a temperatura ambiente per 15 minuti (manipolazione come al punto 6.1.).
- Lavare con PBS-T per 10 minuti (piatto 16).
- Incubare con il complesso Streptavidin-HRP in una camera di umidità a temperatura ambiente per 15 minuti (manipolazione uguale a 6.1.).
- Lavare con PBS-T per 10 minuti (piatto 16).
- Incubare con substrato di perossidasi, amino-etilcarbazolo (AEC), in una camera di umidità a temperatura ambiente per 10 minuti. Fare AEC appena prima dell'uso. Per fare ciò, aggiungere 1 mL di soluzione stock AEC a 14 mL di tampone di acetato 0,1M, pH 5,2. Aggiungere 0,15 ml di 3% H2O2. Filtrare la miscela appena prima dell'uso (filtro da 0,45 μm).
NOTA: La soluzione di lavoro di AEC è stabile solo per 2-3 ore. La soluzione stock AEC può essere conservata in frigorifero per periodi più lunghi. - Lavare in acqua deionizzata 10 min (piatto 17)
- Controintagliato con ematossilina di Gill diluita 1:2 con acqua deionizzata per 2 minuti (piatto 18).
- Risciacquare l'eccesso di ematossilina con risciacquo a immersione in acqua deionizzata (piatto 19 e 20).
- Risciacquare nel piatto Scott's Tap water 30 s (soluzione bluing) 21.
- Lavare in acqua deionizzata 10 min (piatto 22)
- Rimuovere le diapositive una alla volta - montare con un mezzo di montaggio solubile in acqua.
- Leggi le diapositive su un microscopio ottico.
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Risultati
La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi della colorazione IHC di campioni di controllo positivi e negativi in diversi tessuti cerebrali testati. La Figura 2A,D,G rappresenta campioni positivi a 200x, mentre la Figura 2B,E,H corrisponde rispettivamente all'ingrandimento 400x. Figura 2A-C corrisponde al tronco cereb...
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Discussione
A causa dell'elevato tasso di mortalità della rabbia dopo l'insorgenza dei sintomi, la diagnosi di animali sospetti per l'infezione da RABV è estremamente critica per un appropriato trattamento profilattico post-esposizione. La diagnosi di rabbia dipende principalmente da tecniche basate su DFA, DRIT e PCR che utilizzano tessuti freschi o congelati. Per il test di tessuti fissati alla formalina, il test IHC fornisce un metodo alternativo per il rilevamento sensibile e specifico dell'antigene RABV. Mentre i tessuti fissat...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i laboratori, gli epidemiologi e gli affiliati con i dipartimenti di sanità pubblica per la presentazione di campioni ai Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie. I risultati e le conclusioni di questo rapporto sono quelli degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale dei Centers for Disease Control and Prevention. L'uso di nomi commerciali e fonti commerciali è solo per l'identificazione e non implica l'approvazione da parte dei Centers for Disease Control and Prevention.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3% perossido di idrogeno | Pharamacy marche | Pronto all'uso 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-etilcarbazolo (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetato Tampone pH 5.2 | Poly Scientific R& D Corp. | s140 | |
| Formalina tamponata 10% fosfato tamponato | Fisher Scientific | SF100-4 | Certificato |
| Vetrini coprioggetti Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Etanolo 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Etanolo 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Formulazione dell'ematossilina di Gill #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| Kit Biotina-Streptavidina Perossidasi | Seracare | 71-00-18 | Anticorpo primario di topo |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Terreno di montaggio |
| N,N, Dimetil formammide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Obiettivo | Fornitori | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Obiettivo | Fornitori multipli | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Proteasi, Streptomyces griseus |
| Acqua del rubinetto di Scott | Poly Scientific R& D Corp. | s1887 | |
| Set di coloranti per vetrini Tissue-Tek | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Grado istologico |
| Zeiss Axioplan 2 imaging - microscopio |
Riferimenti
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