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Summary

I macrofagi, in particolare i macrofagi primari, sono difficili da trasfecare in quanto sono specializzati nel rilevamento di molecole di origine non auto. Descriviamo un protocollo che consente una trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA generati da modelli di DNA come i plasmidi.

Abstract

I macrofagi sono cellule fagocitiche specializzate nel rilevamento di molecole di origine non auto. A tal fine, sono dotati di una vasta gamma di recettori di riconoscimento dei pattern (PRR). Purtroppo, questo rende anche i macrofagi particolarmente difficili da trasfecare poiché il reagente di trasfezione e gli acidi nucleici trafetti sono spesso riconosciuti dai PRR come non-sé. Pertanto, la trasfezione spesso si traduce nell’attivazione del macrofago e nella degradazione degli acidi nucleici trafetti o anche nel suicidio dei macrofagi. Qui, descriviamo un protocollo che consente la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari murini come macrofagi peritoneali (PM) e macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) con mRNA in vitro trascritto da modelli di DNA come plasmidi. Con questo semplice protocollo, i tassi di trasfezione di circa il 50-65% per il PM e circa l’85% per il BMDM sono raggiunti senza citotossicità o immunogenicità osservata. Descriviamo in dettaglio la generazione di mRNA per la trasfezione da costrutti di DNA come plasmidi e la procedura di trasfezione.

Introduction

I macrofagi sono cellule fagocitiche specializzate nel rilevamento, l’ingestione e la degradazione di microbi, cellule apoptotiche e detriti cellulari. Inoltre, aiutano a orchestrare le risposte immunitarie secernendo citochine e chemiochine e presentando antigeni alle cellule T e alle cellule B. I macrofagi svolgono anche un ruolo importante in numerosi altri processi, come la guarigione delle ferite, l’aterosclerosi, la tumorigenesi e l’obesità.

Per essere in grado di rilevare molecole non autonome come i modelli molecolari associati ai patogeni (PEN) e le molecole fuori luogo come i modelli molecolari associati ai danni (DAMP), i macrofagi sono dotati di una vasta gamma di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR)¹. Purtroppo, questo rende anche i macrofagi particolarmente difficili da trasfect² come la reagente di trasfezione³ e gli acidi nucleici transfettici^4,5,6,7 spesso sono riconosciuti dai PRR come non-sé. Per questo motivo, la trasfezione dei macrofagi utilizzando metodi chimici o fisici⁸ di solito si traduce nell’attivazione del macrofago e nella degradazione degli acidi nucleici transfettati o anche nel suicidio del macrofago tramite piroptosi, una forma di morte programmata delle cellule littiche innescata dopo il riconoscimento di PIS citosolici/DAMP come IL DNA o l’RNA estraneo⁹. La trasfezione biologica dei macrofagi utilizzando virus come adenovirus o lentivirus poiché i vettori sono spesso più efficienti, ma la costruzione di tali vettori virali richiede molto tempo e richiede il livello di biosicurezza 2 attrezzature^10,11.

Così, anche se i macrofagi sono oggetto di un’intensa ricerca, l’analisi delle loro funzioni a livello molecolare è ostacolata perché uno degli strumenti più importanti della biologia molecolare, la trasfezione di costrutti di acido nucleico per l’espressione esogena di proteine, è difficilmente applicabile. Questo spesso costringe i ricercatori a usare linee cellulari simili a macrofagi piuttosto che macrofagi in buona fede. Le applicazioni per la trasfezione di costruzione dell’acido nucleico includono l’espressione di versioni proteiche mutate o marcate, la sovraespressione di una proteina specifica, la rielezione delle proteine in un rispettivo sottofondo knockout e l’espressione di proteine di altre specie (ad esempio, , Cre ricombinante o guida RNA e Cas9 per l’eliminazione mirata del gene).

Qui, descriviamo un protocollo che permette la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari (solitamente difficili da trasfecti), che sono macrofagi peritoneici murini (PM) e macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) con mRNA generato da modelli di DNA come plasmidi. È importante sottolineare che l’mRNA trascritto in vitro generato utilizzando questo protocollo contiene i nucleoside modificati naturali 5-metili-CTP e pseudo-UTP che riducono l’immunogenicità e migliorano la stabilità^4,6,7,12,13. Inoltre, le 5’estremità dell’mRNA trascritto in vitro sono dephofosrylated da fosforesi antartiche per impedire il riconoscimento da parte del complesso RIG-I^14,15. Questo riduce al minimo il riconoscimento immunitario innato dell’mRNA trascritto in vitro. Con il nostro protocollo facile da eseguire, i tassi di trasfezione tra 50-65% (macrofagi peritoneali (PM)) e 85% (BMDM) sono raggiunti mentre, soprattutto, non vi è alcuna citotossicità o immunogenicità osservata. Descriviamo in dettaglio (i) come l’mRNA immunologicamente silenziato per la trasfezione può essere generato da costrutti di DNA come plasmidi e (ii) la procedura di trasfezione stessa.

Protocol

L’isolamento dei macrofafi dai topi è stato eseguito in conformità con la legge tedesca sulla protezione degli animali, in conformità con il Comitato Etico dell’Università di Colonia. NOT:</ Eseguire tutti i gradini indossando guanti. Eseguire tutte le fasi di trasfezione sotto un cappuccio a flusso laminare per prevenire la contaminazione delle cellule. Prima di lavorare con l’mRNA, pulire tutti gli strumenti come pipette e ogni superficie con 70% etanolo e/o un surfactant che degrada gli RNA (Tabella dei materiali). Assicurarsi che tutti i tubi di reazione siano privi di RNA e sterili. Utilizzare solo acqua sterile, senza RNAase, per le diluizioni. Utilizzare esclusivamente punte pipette con filtri. Cambiare le punte delle pipette dopo ogni passo di pipettatura. 1. Generazione del modello DNA NOT:</ Il modello di DNA per la trascrizione dell’mRNA in vitro che utilizza questo protocollo deve contenere una sequenza promotoria T7 per consentire l’attracco della polimerasi dell’RNA. Se il plasmide contenente la sequenza di DNA della proteina di interesse contiene già una sequenza promotore T7 correttamente orientata direttamente a monte della sequenza di interesse, è necessario eseguire la linearizzazione del plasmide (vedi passo 1.1.). In caso contrario, collegare un promotore T7 alla sequenza di interesse mediante reazione a catena polimerasi (PCR, vedere il passaggio 1.2.). Linearizzazione dei plasmidi contenenti promotori T7 Linearizzare i plasmidi già contenenti una sequenza promotore T7 correttamente orientata mediante digestione con un enzima di restrizione che taglia a valle il codone di arresto della sequenza di interesse. In caso contrario, la trascrizione non terminerà correttamente dopo la sequenza di interesse. NOT:</ È meglio usare enzimi di restrizione lasciando estremità smussate o sbalzi 5′. Confermare la linearizzazione completa del plasmide mediante elettroforesi gel agarose di DNA plasmide non digerito contro digerito. Purificare il DNA plasmide linearizzato prima dell’uso come modello di DNA per la trascrizione in mRNA in vitro utilizzando un kit di purificazione del DNA (Tabella dei materiali). Attacco del promotore T7 tramite PCR Utilizzare un primer in avanti contenente i seguenti componenti (nell’ordine indicato da 5′ a 3′): circa 5 bp casuali a monte del promotore (ad esempio, GAAAT); la sequenza promotoria T7 (TAATACGACTCACTATAG); due G in più per una maggiore efficienza di trascrizione (GG); la parte specifica della sequenza di destinazione che è omologa alla sequenza plasmide che circonda il codone di partenza. NOT:</ Dovrebbe essere composto da: 3-6 bp a monte della sequenza KO-AK e iniziare codon, la sequenza KO-AK e iniziare codon (di solito GCCACC ATG G), 12-18 bp a valle del codone di partenza. Se la sequenza di interesse non contiene già una sequenza DI KO-AK o un codon iniziale, questi possono essere collegati in questo passaggio semplicemente includendoli nella sequenza primer. Calcolare il tm del primer in avanti solo tenendo conto della parte omologa alla sequenza di destinazione. Per valutare la formazione di dische/fornaci, utilizzare l’intera sequenza di primer, che può facilmente superare i 50 bp. Utilizzare un primer inverso situato da qualche parte a valle del codon di arresto. NOT:</ Se la sequenza di interesse non contiene già un codone di arresto, può essere collegata in questo passaggio semplicemente includendola nella sequenza di primer. Utilizzare le primer in avanti e in retromarcia per eseguire una PCR utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà con correzione di bozze (Tabella dei materiali). Confermare la generazione di un singolo prodotto e la dimensione dell’amplificatore mediante elettroforesi gel agarose (ad esempio, utilizzare un gel di agarose dell’1% e una corrente costante 100 V). Purificare il prodotto PCR prima dell’uso come modello di DNA per la trascrizione dell’mRNA in vitro utilizzando un kit di purificazione del DNA. 2. Generazione di mRNA Scongelare tutti i componenti del kit di trascrizione dell’mRNA in vitro (vedere la Tabella dei materiali). Vortice per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g. Tenere sul ghiaccio fino all’uso. Preparare il mix di reazione per la trascrizione in vitro mRNA in un tubo di microcentrifuga da 0,5 ml nel seguente ordine (volume totale di 40:L): 20 L di 10x mix ARCA/NTP (incluso nel kit di trascrizione dell’mRNA in vitro); 0,25 – L di 5-metil-CTP (concentrazione finale (f.c.) è 1,25 mM; 50% del CTP totale); 0,25 l di pseudo-UTP (f.c. è 1,25 mM; 50% dell’UTP totale); X -L del modello di DNA; 2 -L di miscela di polimerasi di RNA T7 (incluso nel kit di trascrizione dell’mRNA in vitro); Y-L di H2O senza RNAse. NOT:</ X è un volume che contiene almeno 1 g di DNA. Ad esempio, 1,6 litri da una soluzione di stock da 625 ng/L. Y è il volume di riserva per il volume totale di 40 l. Vortice per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g. Incubare a 37 gradi centigradi per 30 min a 400 rpm su un miscelatore termico per la trascrizione in vitro. Quindi, aggiungere 2 -L di DNase I direttamente nel mix di reazione per la rimozione del DNA del modello. Vortice per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g. Incubare a 37 gradi centigradi per 15 min a 400 rpm su un mixer termico. Prendere una aliquota di 2 gradi per il gel di controllo (passaggio 3.3) e conservare a -80 gradi centigradi. Per la coda poli(A), aggiungere i seguenti componenti direttamente nella miscela di reazione precedente (ad un volume finale di 50:L): 5 l of 10x poly(A) polymerase remerase reammae (entrambi inclusi nel kit di trascrizione in vitro mRNA). Vortice per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g. Incubare il mix a 37 gradi centigradi per 30 min a 400 giri/m su un termomixer. Prendere una aliquota di 2 gradi per il gel di controllo (passaggio 3.3) e conservare a -80 gradi centigradi. Per la depforosofolazione delle estremità a 5 o più estremità dell’mRNA, aggiungere i seguenti componenti direttamente nella miscela di reazione precedente (ad un volume finale di 60 : 3 L di L2O senza RNAse; 6 – L di 10 volte buffer di reazione al fosfoculo articolare; 3 – L di fosfofofasi antartico (15 unità per 60 volume di reazione). Vortice per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g. Incubare il mix a 37 gradi centigradi per 30 min a 400 giri/m su un miscelatore termico. La fosfofasi antartica per incapacità di calore a 80 gradi centigradi per 2 minuti. NOT:</ Idealmente, utilizzare un mixer termico separato, non attendere fino a quando il primo mixer raggiunge la temperatura desiderata. 3. Purificazione dell’mRNA Purificare l’mRNA trascritto in vitro utilizzando un kit di purificazione dell’RNA dedicato (Tabella dei materiali). Aggiungere X :L della soluzione di eluizione al mix di reazione mRNA dal punto 2.10. Mescolare invertendo 5 volte. Aggiungere 300 l di concentrato di soluzione di binding. Mescolare con pipettaggio delicato 5 volte. NOT:</ X è il volume di riserva ad un volume totale di 100 l. Ad esempio, aggiungere una soluzione di eluzione di 40 ll al mix di reazione mRNA di 60. Aggiungete 100 l di etanolo senza RNAase. Mescolare con pipettaggio delicato 5 volte. Posizionare una colonna di filtro in uno dei tubi di raccolta forniti. Trasferire delicatamente la miscela di reazione mRNA al centro del filtro senza toccare il filtro. Centrifuga a 15.000 x g per 1 min a temperatura ambiente (RT). Sollevare con attenzione la colonna del filtro e scartare il flow-through nel tubo di raccolta. Riportare la colonna del filtro nello stesso tubo di raccolta. Aggiungere 500 l di soluzione di lavaggio (non dimenticate di aggiungere 20 mL di etanolo senza RNAase prima di utilizzare la soluzione di lavaggio per la prima volta). Centrifuga a 15.000 x g per 1 min a RT. Ripetere i passaggi 3.1.4-3.1.6 per lavare ancora una volta. Centrifuga a piena velocità (17.900 x g) per 1 min a RT per rimuovere qualsiasi fluido residuo dalla colonna filtro. Prendere con attenzione la colonna del filtro dal tubo di raccolta. Posizionare la colonna del filtro in un nuovo tubo di raccolta. Aggiungere 50 l di tampone di eluizione al centro del filtro senza toccare il filtro. Incubare a 65 gradi centigradi per 10 min su un mixer termico. Centrifuga a 15.000 x g per 1 min a RT. Rimuovere la colonna del filtro e scartarla. Misurare la concentrazione e la purezza dell’mRNA eluito, ad esempio, utilizzando uno spettrometro a microvolume per misurare l’assorbimento a 260 e 280 nm. NOT:</ Un rapporto A260/A280 di 1,8-2,1 è indicativo di mRNA altamente purificato. Verificare la presenza di un singolo prodotto, la lunghezza corretta della trascrizione e la coda poli(A) analizzando le aliquote dai passaggi 2.5 e 2.7 da un’elettroforesi gel agarose in condizioni di denatura (ad esempio, utilizzare un gel di agarose dell’1,2% contenente 20 mM 3-(N-morpholino) acido propanesulfonico [MOPS], acetato di sodio 5 mM, 1 mM EDTA e 20% di formaldeide ed eseguito in 20 mM MOPS, acetato di sodio 5 mM, 1 mM EDTA e 0.74 % formaldeide a 100 V corrente costante). Conservare l’mRNA purificato nel tubo di eluizione a -80 gradi centigradi fino alla trasfezione. Se si utilizzano solo quantità basse di mRNA per la trasfezione, l’mRNA è aliquota per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.NOTA: l’mRNA può essere conservato a -80 gradi centigradi per circa 1 anno. 4. Preparazione del macrofago Topi eutanasia C57/BL6 (utilizzare topi dello stesso sesso e di 6-24 settimane di età) per lussazione cervicale. NOT:</ Gli stessi mouse possono essere utilizzati per l’isolamento di PM (passaggio 4.2) e generazione di BMDM (passaggi 4.3 e 4.4). Per l’isolamento di PM utilizzare almeno due topi. Se solo BMDM devono essere generato un mouse di solito è sufficiente. Arricchimento immunomagnetico di macrofagi peritoneali. Riempire una siringa da 10 mL con una cannula da 0,9 x 40 mm con 8 mL di salina con buffer di fosfato ghiacciato (PBS) e 2 mL di aria. Svuotare la cavità peritoneale con PBS. L’aria formerà una bolla che riduce al minimo la perdita di PBS. Raccogli rapidamente la lavanda peritoneale con la stessa siringa e trasferiscila in un tubo di centrifugazione conica da 50 ml. Combinare cellule peritoneali di più topi, se necessario. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio. Sospensione delle cellule centrifuga a 650 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di 0,2 % NaCl per 30 s per lizzare i globuli rossi. Aggiungere 5 mL dell’1,6% NaCl ad un volume totale di 10 mL per ricostituire le condizioni isotoniche. Centrifuga a 650 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Eliminare il supernatante e rimettere in sospensione il pellet cellulare in 97,5 ll di tampone di sbarramento delle cellule magnetiche (MCS) (2 mM di acido etilenediaminetracetraacetico [EDTA], 5% di albumina di siero bovino [BSA] in PBS) per 1 lavage peritoneale (ad esempio, se tre topi sono stati lavati, risolare in 292.5L) per 1 lavage peritoneale (ad esempio, se tre topi sono stati lavati, risospendere in 292.5L ). Aggiungete 2,5 lofazioni di perline paramagnetiche coniugate a un anticorpo specifico di CD11b per 97,5 gradi di sospensione cellulare (ad es., aggiungete 7,5 l a 292,5 l). Incubare sul ghiaccio per 15 min a 150 rpm su uno shaker orbitale. Centrifuga sospensione cellulare a 650 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, scartare il supernatale e rimettere in sospensione il pellet cellulare in 1 mL di buffer MCS. Aggiungere 4 mL di buffer MCS per un volume totale di 5 mL e lavare le cellule pipetting su e giù delicatamente tre volte. Ripetere i passaggi 4.2.8 e 4.2.9 altre due volte per un totale di tre passaggi di lavaggio. Durante i passaggi di lavaggio posizionare una colonna LS in un separatore di celle magnetiche (vedere Tabella dei materiali). Risciacquare la colonna con 3 mL di buffer MCS. NOT:</ Evitare eventuali bolle in quanto questi possono ostare la colonna. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di buffer MCS. Aggiungere 3 mL di buffer MCS ad un volume totale di 4 mL, mescolare conilare su e giù tre volte. Trasferire i 4 mL di sospensione cellulare sulla colonna LS risciacquata. NOT:</ Anche in questo caso, evitare eventuali bolle in quanto questi possono ostare la colonna. Attendere che il serbatoio della colonna sia completamente vuoto. Non aggiungere ulteriore fluido fino a quando la colonna non smette di gocciolare. Aggiungere 3 mL di buffer MCS nella colonna. Quindi, attendere che il serbatoio della colonna sia completamente vuoto. Ripetere il passaggio 4.2.15 altre due volte. Posizionare la colonna LS in un tubo di centrifugazione conico da 15 mL. Applicare 5 mL di buffer MCS sulla colonna. Attendere fino a quando 2 mL di liquido è passato attraverso la colonna, quindi utilizzare lo stantuffo per spingere delicatamente la frazione rimanente nel tubo. Centrifuga sospensione cellulare a 650 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e scartare il supernatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di DMEM integrato con il 10% di siero di vitello fetale inattivato dal calore (FCS) (DMEM-FCS). Determinare il numero di cellule vitali contando in soluzione blu trypan in una camera di conteggio Neubauer e celle di semi in DMEM-FCS in piastre di coltura. NOT:</ Seme PM ad una densità di 100.000 cellule / pozzo in una piastra di microtitolto piatto inferiore. Non utilizzare piastre trattate con coltura tissutale come PM non può essere staccato da questi. Utilizzare invece piastre non trattate. Generazione di BMDM Rimuovere la pelle e i muscoli dalle zampe posteriori utilizzando un paio di forbici. Lavare ogni gamba con un’immersione corta nel 70% di etanolo. Staccare le gambe e aprire entrambe le estremità del femore e la tibia tagliando con le forbici. Riempire una siringa da 5 mL riempita con una cannula da 0,6 mm x 30 mm con 5 mL di endotossina molto bassa (VLE) RPMI 1640 e sciacquare il midollo osseo dalle ossa aperte in un piatto di coltura. Combinare il midollo osseo di più topi se necessario ripetendo i passaggi 4.3.1-4.3.3. Trasferire il midollo osseo in un tubo di centrifugazione conico da 50 ml. Centrifugare la sospensione del midollo osseo a 650 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e scartare il supernatante. Risospendere il pellet delle cellule in 5 mL di lisi di lissi del globulo rosso (8,3% NH4Cl, 0,1 M Tris) e incubare per 5 min a RT per lassizzare i globuli rossi. Centrifugare la sospensione cellulare a 650 x g a 4o C per 5 min e scartare il supernatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di VLE RPMI 1640 medio integrato con 10% FCS, 1% penicillina/streptomycin, 1% HEPES, 1% pyruvate di sodio e 10 ng/mL recombinante macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) (RP Aggiungere 4 mL diRPMI a un volume totale di 5 mL. Preparare 5 piatti Petri non trattati da 92 mm x 16 mm con camme (vedere la Tabella dei Materiali)per mouse con il pipetting di 7 mL diRPMI in ogni piatto. Trasferire la soluzione cellulare di 1 mL nei 5 piatti di coltura preparati e incubare a 37 e 5% CO2. Dopo 4 giorni, alimentale aggiungendo 4 mL diRPMI. Dopo 6-7 giorni, le cellule del midollo osseo sono completamente differenziate in BMDM. Raccolta di BMDM Rimuovere completamente il mezzo dai piatti di coltura. Aggiungere 5 mL di EDTA caldo da 0,2 mM in PBS ad ogni piatto. Raschiare delicatamente l’intera piastra con un raschietto cellulare per staccare il BMDM. Combinare le sospensioni cellulari in un tubo di centrifugazione conico da 50 mL. Sciacquare di nuovo tutti e 5 i piatti. Utilizzare lo stesso volume di 5 mL di CALDO 0.2 mM EDTA in PBS per tutti e 5 i piatti. Combina questa sospensione cellulare con quella del passaggio precedente. Centrifugare la sospensione cellulare a 650 x g per 5 min a 4o C e scartare il supernatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di VLE RPMI 1640 medio integrato con 10% FCS, 1% HEPES, 1% pironeva di sodio e10 ng/mL ricombinante M-CSF ma senza antibiotici (RPMI ) Determinare il numero di celle vitali contando in soluzione blu trypan in una camera di conteggio Neubauer e le cellule di semi inRPMI . NOT:</ Seme BMDM ad una densità di 50.000 cellule/ pozzo massimo in una piastra di microtitolazione piatta inferiore. Non utilizzare piastre trattate con la coltura dei tessuti come BMDM difficilmente può essere staccato da questi. Utilizzare invece piastre non trattate. 5. Trasfezione di macrofagi con mRNA Calcolare il volume richiesto del buffer di trasfezione mRNA. NOT:</ Il volume del buffer di trasfezione dell’mRNA richiesto dipende dalle dimensioni del pozzo: utilizzare 200 -L per la trasfezione in una piastra di 6 pozze, 100 l in una piastra di 12 pozze e così via. Aggiungere sempre un po ‘di volume di ricambio a causa della perdita di pipettaggio (ma non troppo, per prevenire la diluizione indebita di mRNA). Ad esempio, utilizzare 450 L invece di 4 x 100 L – 400 L per trasfecare in 4 pozzetti di una piastra di 12 pozzetti. Calcolare il volume richiesto del reagente di trasfezione mRNA. Il reagente di trasfezione mRNA viene aggiunto a un rapporto di 1:50. Ad esempio, per un volume finale di 450 l è necessario 9 L di reagente di trasfezione di mRNA. Calcolare la quantità totale di mRNA necessaria. Almeno 100 ng per 100.000 macrofagi sono necessari per una trasfezione efficiente, 200 ng funziona ancora meglio (ad esempio, 800 ng mRNA a transfect 400,000 macrofagi). Moltiplicare la quantità calcolata di mRNA necessaria con il numero totale di pozzi che devono essere trasfettati (ad esempio, 4 pozzi con 400.000 macrofagi ciascuno: 4 x 800 ng x 3.200 ng mRNA è richiesto in totale per tutti i pozzi). Ad esempio, se il vostro stock di mRNA è 426,8 ng/L, sono necessari 7,49 gradi per una trasfezione ottimale di 4 pozzi con 400.000 macrofagi ciascuno. Aggiungere il volume calcolato del buffer di trasfezione mRNA (passaggio 5.1.) meno i volumi per il reagente di trasfezione mRNA (passaggio 5.2) e l’mRNA (passaggio 5.3) a un tubo di reazione. Ad esempio, 450 l – 9 – L – 7,49 -L – 433,51 l. Scongelare il supporto mRNA e mescolare con un leggero capovolgimento del tubo di eluizione. Aggiungere il volume calcolato di mRNA (passaggio 5.3) al tubo di reazione con buffer di reazione mRNA (nell’esempio sopra riportato: 7,49 L in 433,51 . Vortice per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g. Vortice il reagente di trasfezione mRNA per 5 s e spin down per 2 s a 2.000 x g. Aggiungere il volume calcolato del reagente di trasfezione mRNA (passaggio 5.2) al tubo di reazione contenente il buffer di trasfezione mRNA e l’mRNA (nell’esempio sopra presentato: 9 -L di reagente di trasfezione mRNA). Vorticare il mix di trasfezione per 5 s e girare verso il basso per 2 s a 2.000 x g. Incubare per 15 min a RT. Nel frattempo, sostituire il mezzo di coltura dei macrofagi con un mezzo di coltura fresco e caldo (vedere i passaggi 4.2.18. e 4.4.5). Dopo la fase di incubazione 5.10, aggiungere il mix di trasfezione ai pozze contenenti i macrofagi in un volume appropriato per le dimensioni del pozzo (vedere il passaggio 5.1). Aggiungere la miscela di trasfezione dropwise in un cerchio dall’esterno al centro del pozzo. Rocciare delicatamente la piastra, prima in verticale e poi in direzione orizzontale per garantire una distribuzione uniforme del mix di trasfezione nel pozzo. Quindi, incubare a 37 e 5 % CO2. La sintesi della proteina codificata dall’mRNA transfetgiato inizierà poco dopo la trasfezione. Per ottenere i migliori risultati, incubare per almeno 6 h. Dopo l’incubazione, analizzare l’efficienza della trasfezione mediante microscopia (immuno)fluorescenza, citometria di flusso o immunoblot16,oppure utilizzare i macrofagi trafitti per l’esperimento di scelta.

Representative Results

Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per generare la codifica mRNA per le varianti NEMO e IKK per la trasfezione dei macrofagi primari16. La codifica plasmids per il tipo selvaggio con tag FLAG (NEMOWT) e il tipo di mutante C54/347A NEMO (NEMOC54/374A) (si veda la Tabella dei Materiali) contengono già un promotore T7 nell’orientamento corretto ( Figura1A). Così, abb…

Discussion

Qui presentiamo un protocollo per la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari solitamente difficili da raggiungere con mRNA tranincato in vitro. È importante sottolineare che la trasfezione dei macrofagi utilizzando questo protocollo non induce la morte cellulare né attiva la segnalazione infiammatoria che indica che né il reagente di trafezione né l’mRNA trascurato sono riconosciuti come non-sé.

La qualità dell’mRNA è di fondamentale importanza per la trasfezione di succes…

Materials

5-methyl-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase	New England BioLabs	M0289	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)	New England BioLabs	B0289	stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody	Invitrogen	MA1-41046	stored at -20 °C
anti-β-actin antibody	Sigma-Aldrich	A2228	stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams	Sarstedt	821,473	stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human	Miltenyi Biotec	130-049-601	stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104	stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10X)	Thermo Scientific	B64	stored at -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	stored at -20 °C
high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs Inc	M0491S	stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)	New England BioLabs	E2060	stored at -20 °C
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	stored at RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER	Polyplus transfection	409-0001DE	stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid	Addgene	11105	stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid	Addgene	62043	stored at -20 °C
poly(I:C)	Calbiochem	528906	stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	stored at -20 °C
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated	BioLegend	101212	stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated	eBioscience	12-4801-82	stored at 4 °C
recombinant M-CSF	Peprotech	315-02	stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit	ThermoFisher Scientific	AM1908	stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	stored at RT
ultrapure LPS from E.coli O111:B4	Invivogen		stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid	Addgene	11103	stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C