Trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA trascritto in vitro

Sommario

I macrofagi, in particolare i macrofagi primari, sono difficili da trasfecare in quanto sono specializzati nel rilevamento di molecole di origine non auto. Descriviamo un protocollo che consente una trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA generati da modelli di DNA come i plasmidi.

Abstract

I macrofagi sono cellule fagocitiche specializzate nel rilevamento di molecole di origine non auto. A tal fine, sono dotati di una vasta gamma di recettori di riconoscimento dei pattern (PRR). Purtroppo, questo rende anche i macrofagi particolarmente difficili da trasfecare poiché il reagente di trasfezione e gli acidi nucleici trafetti sono spesso riconosciuti dai PRR come non-sé. Pertanto, la trasfezione spesso si traduce nell'attivazione del macrofago e nella degradazione degli acidi nucleici trafetti o anche nel suicidio dei macrofagi. Qui, descriviamo un protocollo che consente la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari murini come macrofagi peritoneali (PM) e macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) con mRNA in vitro trascritto da modelli di DNA come plasmidi. Con questo semplice protocollo, i tassi di trasfezione di circa il 50-65% per il PM e circa l'85% per il BMDM sono raggiunti senza citotossicità o immunogenicità osservata. Descriviamo in dettaglio la generazione di mRNA per la trasfezione da costrutti di DNA come plasmidi e la procedura di trasfezione.

Introduzione

I macrofagi sono cellule fagocitiche specializzate nel rilevamento, l'ingestione e la degradazione di microbi, cellule apoptotiche e detriti cellulari. Inoltre, aiutano a orchestrare le risposte immunitarie secernendo citochine e chemiochine e presentando antigeni alle cellule T e alle cellule B. I macrofagi svolgono anche un ruolo importante in numerosi altri processi, come la guarigione delle ferite, l'aterosclerosi, la tumorigenesi e l'obesità.

Per essere in grado di rilevare molecole non autonome come i modelli molecolari associati ai patogeni (PEN) e le molecole fuori luogo come i modelli molecolari associati ai danni (DAMP), i macrofa....

Protocollo

L'isolamento dei macrofafi dai topi è stato eseguito in conformità con la legge tedesca sulla protezione degli animali, in conformità con il Comitato Etico dell'Università di Colonia.

NOT: Eseguire tutti i gradini indossando guanti. Eseguire tutte le fasi di trasfezione sotto un cappuccio a flusso laminare per prevenire la contaminazione delle cellule. Prima di lavorare con l'mRNA, pulire tutti gli strumenti come pipette e ogni superficie con 70% etanolo e/o un surfactant che degrada gli RNA (Tabella dei materiali). Assicurarsi che tutti i tubi di reazione siano privi di RNA e sterili. Utilizzare solo acqua ....

Risultati

Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per generare la codifica mRNA per le varianti NEMO e IKK per la trasfezione dei macrofagi primari¹⁶. La codifica plasmids per il tipo selvaggio con tag FLAG (NEMO^WT) e il tipo di mutante C54/347A NEMO (NEMO^C54/374A) (si veda la Tabella dei Materiali) contengono già un promotore T7 nell'orientamento corretto ( Figura1A). Così, abbia.......

Discussione

Qui presentiamo un protocollo per la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari solitamente difficili da raggiungere con mRNA tranincato in vitro. È importante sottolineare che la trasfezione dei macrofagi utilizzando questo protocollo non induce la morte cellulare né attiva la segnalazione infiammatoria che indica che né il reagente di trafezione né l'mRNA trascurato sono riconosciuti come non-sé.

La qualità dell'mRNA è di fondamentale importanza per la trasfezione di successo dei .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
5-metil-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	conservato a -20 gradi; C
Fosfatasi antartica	New England BioLabs	M0289	conservato a -20 gradi C
Tampone di reazione alla fosfatasi antartica (10x)	New England BioLabs	B0289	conservato a -20 ° C
anticorpo NEMO/IKKγ	Invitrogen	MA1-41046	conservato a -20 gradi C
anticorpo anti-beta;-actina	Sigma-Aldrich	A2228	conservato a -20 gradi C
piastre di Petri 92,16 mm con camme	Sarstedt	821,473	conservate presso RT
CD11b Microsfere di topo e umano	Miltenyi Biotec	130-049-601	conservate a 4 ° C
Cre ricombinasi + T7-Promotor primer in avanti	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, conservato a -20 ° C
Cre ricombinasi + T7-Promotor primer inverso	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, conservato a -20 ° C
Kit di purificazione del DNA: Kit di purificazione QIAquick PCR	Qiagen	28104	conservato presso RT
eGFP + T7-Promotor primer forward	Sigma-Aldrich		5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, conservato a -20 ° C
eGFP + T7-Promotor inverso	primer Sigma-Aldrich		5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, conservato a -20 ° C
Tampone Fast Digest (10x)	Thermo Scientific	B64	conservato a -20 ° C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	conservato a -20 ° C
Polimerasi ad alta fedeltà con correzione di bozze: Q5 DNA-polimerasi ad alta fedeltà	New England Biolabs Inc	M0491S	conservato a -20 ° C
IKKβ + T7-Promotor primer in avanti	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, conservato a -20 ° C
IKKβ + T7-Promotor inverso	primer Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, conservato a -20 °
Kit di trascrizione mRNA CIn vitro: Kit mRNA HiScribe T7 ARCA (con coda polyA)	New England BioLabs	E2060	conservato a -20 gradi; C
Colonne LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	conservate presso RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	conservate presso tampone
trasfezione RT mRNA e reagente: jetMESSENGER	Trasfezione Polyplus	409-0001DE	conservata a 4 gradi; C
Mutant IKKβ Plasmide IKK-2S177/181E	Addgene	11105	conservato a -20 ° C
mutante NEMOC54/347A plasmide	Addgene	27268	conservato a -20 ° C
pEGFP-N3 plasmide	Addgene	62043	conservato a -20 ° C
poly(I:C)	Calbiochem	528906	immagazzinato a -20 ° C
pPGK-Cre plasmide			F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Nuove varianti della Cre ricombinasi inducibile: un nuovo mutante della proteina di fusione Cre-PR mostra una maggiore sensibilità e una gamma ampliata di inducibilità. Acidi nucleici Res. 29, 47e (2001). immagazzinato a -20 ° C
pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	conservato a -20 gradi; C
Separatore QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976	conservato presso RT
Anticorpo CD11b anti-ratto-topo, BioLegend coniugato con APC		101212	conservato a 4 gradi; C
Anticorpo F4/80 ratto-anti-topo, PE-coniugato	eBioscience	12-4801-82	conservato a 4 gradi; C
Ricombinante M-CSF	Peprotech	315-02	conservato a -20 ° Kit
di purificazione dell'RNA C: Kit di pulizia della trascrizione MEGAclear	ThermoFisher Scientific	AM1908	conservato a 4 gradi C
Surfattante che degrada l'RNAsi: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	conservato presso RT
LPS ultrapuro da E.coli O111:B4	Invivogen		conservato a -20 ° C
Wild type IKKβ plasmide	Addgene	11103	conservato a -20 gradi C
Plasmide NEMO di tipo selvatico	Addgene	27268	conservato a -20 ° E