Articolo metodologico

Generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso l'innesto embrionale

DOI:

10.3791/60156

⸱

29 gennaio 2020

 ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo obiettivo di questo protocollo è quello di produrre axolotl chimerici con arti anteriori aploidi derivati dal tessuto donatore mutageno Cas9 utilizzando tecniche di innesto di tessuti embrionali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un insieme crescente di tecniche e risorse genetiche consente ai ricercatori di sondare le origini molecolari della capacità di alcune specie di salamandre, come gli axolotl, di rigenerare interi arti da adulti. Qui, illustremo le tecniche utilizzate per generare axolotl chimerici con arti anteriori aploidi aploidi con anammi aploidi con anamne aploidi con anamne mutagenizzati di Cas9 che possono essere utilizzati per esplorare la funzione genica e la fedeltà della rigenerazione degli arti. Uniamo diverse tecniche embrionali e genetiche, tra cui la generazione di aploidi tramite attivazione in vitro, la mutagenesi CRISPR/Cas9 e l'innesto di tessuto in un unico protocollo per produrre un sistema unico per lo screening genetico aploide in un organismo modello di rigenerazione. Questa strategia riduce il numero di animali, lo spazio e il tempo necessari per l'analisi funzionale dei geni nella rigenerazione degli arti. Ciò consente anche di sapiere le funzioni specifiche della rigenerazione dei geni che possono essere necessarie per altri processi essenziali, come l'organogenesi, la morfogenesi dei tessuti e altri processi embrionali essenziali. Il metodo qui descritto è una piattaforma unica per condurre lo screening genetico degli aploidi in un sistema modello di vertebrato.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Storicamente, l'innesto di tessuto embrionale negli anfibi è stata una tecnica importante per esplorare i meccanismi fondamentali della biologia dello sviluppo e della rigenerazione. L'axolotl, una specie di salamandra, possiede un'impressionante capacità di rigenerare i tessuti e strutture complesse come arti e organi dopo lesioni o amputazioni. Allo stesso modo impressionante, possono ricevere, senza rigetto, innesti tissutali da altri individui a stadi embrionali, giovani e adulti1,2,3. Regioni di embrioni che producono intere strutture come arti, code, occhi e teste, e tessuti più specifici, come neuroectodermi e somiti, possono essere innestati tra embrioni per produrre animali chimerici1,2,4,5,6. Per quasi un secolo, studi su tali animali chimerici hanno fornito informazioni cruciali sulla rigenerazione, la differenziazione dei tessuti, il controllo delle dimensioni e il patterning1,7,8.

Nell'ultimo decennio, numerosi studi trascrizionali sui tessuti rigeneranti hanno prodotto approfondimenti sui programmi genetici alla base della rigenerazione della salamandra9,10,11,12,13. Questi studi hanno aggiunto un elenco in espansione di geni candidati che, ad oggi, sono in gran parte caratterizzati nel contesto della rigenerazione. Tecniche mirate di mutagenesi, come CRISPR/Cas, ora permettono lo studio di tali geni, e tali approcci genetici sono notevolmente facilitati dal recente sequenziamento e assemblaggio del grande genoma axolotl14,15,16.

Abbiamo cercato di sviluppare tecniche che associavano la biologia dello sviluppo classico alla nuova tecnologia genetica allo scopo di sezionare i meccanismi di rigenerazione. I metodi per la generazione di embrioni aploidi di axolotle e altre salamandre sono stati stabiliti per decenni17. Mentre queste tecniche sono state a lungo notate come vantaggi delle salamandre come organismi modellogenetico 18, pochi studi genetici successivi hanno incorporato animali aploidi. Usiamo l'attivazione in vitro nell'axolotl per produrre embrioni aploidi che fungono da donatori di tessuti per l'innesto19. Utilizzando embrioni che trasportano marcatori genetici fluorescenti, abbiamo ideato metodi affidabili per generare arti derivati quasi interamente dai tessuti donatrici (Figura 1A). Combinando queste due tecniche, abbiamo aggirato la letale embrionale tardiva associata all'aploidia, consentendo la produzione di arti aploidi completamente sviluppati e innestati (Figura 1B, Figura 1Be Figura 2).

Conducendo la mutagenesi mediata DA CRISPR/Cas in embrioni aploidi prima dell'innesto per creare axolotli chimerici con arti aploidi mutanti, possiamo studiare la funzione genica specificamente nel contesto dello sviluppo e della rigenerazione degli arti. Ciò consente il salvataggio di arti da fenotipi mutanti potenzialmente embrionali-letali. Mentre la microiniezione CRISPR/Cas può generare animali altamente mutanti, tali animali sono tipicamente altamente mosaici, con un certo grado di ritenzione di alleli wildtype e una varietà di mutazioni distinte nei siti mirati14,20. La mutagenesi a base di CRISPR nelle cellule aploidi aumenta la penetrazione delle mutazioni della perdita di funzione di singolo allele, in quanto non possono essere mascherate da alleli wildtype conservati. Per questo motivo, lo screening basato su CRISPR nelle linee cellulari aploidi viene sempre più utilizzato per studiare la base genetica di molti processi cellulari21,22,23. Combinando il tracciamento del lignaggio basato su CRISPR con i nostri protocolli di innesto di boccioli aploidi, l'approccio qui descritto può servire come piattaforma per schermi genetici aploidi in animali viventi20.

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Protocollo

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Le procedure sperimentali utilizzate in questo protocollo sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yale (IACUC, 2017–10557) ed erano conformi a tutte le politiche e linee guida federali che disciplinano l'uso degli animali vertebrati. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati sull'Ambystoma mexicanum (axolotls) in strutture dell'Università di Yale.

1. Generazione di embrioni diploide

  1. Ottenere embrioni diploidi GFP per fungere da ospiti di innesto attraverso l'accoppiamento naturale utilizzando uno o due genitori gfp 24.
  2. Raccogliere le uova diploide appena posate e metterle in un setaccio di metallo.
  3. Sciacquare accuratamente le uova con la soluzione del 40% di Holtfreter (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH a 7.4).
  4. Mettete le uova nella soluzione fresca del 40% di Holtfreter e conservatele a 12 gradi centigradi.
    NOTA: gli embrioni diploidi devono sempre essere ottenuti prima di passare alla generazione di embrioni aploidi.

2. Generazione di embrioni aploidi

  1. Preparazione del donatore di gameti femminili
    1. 48 h prima di effettuare l'attivazione in vitro, anestesizzare un axolotl femminile bianco o bianco/RFP sessualmente maturo per immersione in MS-22 2thong tampone HEPES nel 40% soluzione Holtfreter25.
    2. Assicurarsi che l'animale sia completamente anetizzato dopo circa 30 min di immersione pizzicando saldamente la coda tra il pollice e l'indice. Gli animali completamente anestesizzati non rispondono fisicamente ad alcun pizzico.
    3. Preparare una soluzione di gonadotropina corionica umana (HCG) contenente 10.000 U/mL in salina sterile.
    4. Utilizzando una siringa insulinica da 30 G, iniettare 0,15 CC di HCG (1.500 unità) nella muscolatura dorsale all'arto posteriore della femmina anetizzata con un angolo di 45 gradi rispetto alla linea mediana per evitare il contatto con il midollo spinale.
    5. Riportate la femmina al 40% di Holtfreter e mettetela in un frigorifero da 8,12 gradi centigradi.
    6. Dopo 48 h, riportare la femmina a temperatura ambiente. Mettere alcune pietre o piante di plastica nel suo contenitore come superfici per la deposizione delle uova.
      NOTA: Le femmine iniettate con HCG spesso depositano casi di gelatina vuoti per diverse ore prima di deporre le uova.
    7. Rimuovere le pietre o piante di plastica dopo che la femmina ha iniziato costantemente deponendo le uova.
    8. Lasciare che la femmina si sieda nel serbatoio vuoto per 30 min a 1 h.
      NOTA: Trattenendo i materiali per l'animale di deporre le uova permetterà un controllo più rigoroso della raccolta degli ovociti.
  2. Collezione di gameti maschili
    1. Mentre la deposizione dell'uovo della femmina è in stallo, anestesizza un axolotl maschile GFP -essere sessualmente maturo per fungere da donatore di sperma, come nel punto 2.1.1.
    2. Posizionare il maschio completamente anetizzato sulla schiena su asciugamani di carta umidi sotto un microscopio dissegente.
    3. Se lo sperimentatore è destrorso, posizionare la punta di una pipetta P1000 alla base della cloaca con la mano destra.
    4. Posizionare l'indice sinistro e il pollice della mano sinistra di 2,3 cm rostral sul bacino. Spremere delicatamente l'animale mentre si spostano le dita verso le zampe posteriori per eliminare i campioni di urina spermica.
    5. Raccogliere ciascuno che viene lavato fuori dalla cloaca in un singolo tubo di microcentrifuga. Ripetere questo processo per raccogliere da 6 a 10 campioni.
    6. Pipetta 5,0 l da ogni campione su una piastra di Petri per ispezionare la qualità dello sperma utilizzando un microscopio invertito.
      NOTA: I campioni di spermatozoi concentrati sono di colore bianco latteo, in genere vanno da 5 a 20 -L, e di solito vengono recuperati dopo che vengono estratti diversi campioni di urina spermica di volume più elevato. Lo sperma raccoglierà nella parte inferiore dei tubi in campioni di volume più elevato quando lasciato indisturbato. I campioni concentrati di spermatozoi sani sono altamente motili e perdono attività man mano che la loro concentrazione diminuisce. I maschi sani possono produrre fino a 50 -L di sperma concentrato.
  3. Collezione gamete femminile
    1. Dopo aver ottenuto e confermato un campione di spermatozoi sano, anestesizzare l'axolotl femminile iniettato da HCG come nel passo 2.1.1.
    2. Posizionare la femmina completamente anetizzata su asciugamani di carta umidi sulla schiena.
    3. Estrarre le uova non fecondate dalla femmina utilizzando un movimento della mano simile a quello nel passaggio 2.2.4.
    4. Raccogliere le uova con pinze bagnate e trasferirle in una piastra di petri di 10 cm. Trattare le uova con sperma irradiato entro 15 min dalla raccolta.
  4. Preparazione di gameti maschili e attivazione in vitro
    1. Utilizzare una pipetta P10 o P20 per pipettare lo sperma su e giù, rompendo i grumi per formare una sospensione omogenea.
    2. Approssimare la percentuale di spermatozoi motili posizionando una goccia di 0,5 ll di sospensione dello sperma non diluita su un coperchio della piastra di Petri o su un vetrino di vetro ed esaminando con un microscopio invertito.
    3. Aggiungete 9,5 ll di 0,1 x la soluzione di Ringer modificata di Marc (MMR; Tabella dei materiali) a questo campione per fare una diluizione di spermatoma 20x. Delicatamente pipette su e giù per mescolare.
    4. Con un microscopio invertito, contare lo sperma in tre gocce da 1,0 ll dell'aliquota diluita 20 volte su una copertura di piastra di Petri o su un emocitometro per stimare la concentrazione di spermatozoi della sospensione non diluita.
    5. Preparare lo sperma per l'irradiazione diluindo un'aliquota del campione di sperma originale a circa 80.000 cellule motili/mL in sterile 0,1x MMR.
    6. Contare il numero di uova ottenute negli ultimi 15 min. Utilizzare la punta della pipetta per distribuire questa sospensione in uno strato spesso 1 mm.
    7. Utilizzando un ascensore di plastica, posizionare il campione a 4 cm dalle lampadine di un parassa da 254 nm. Geneticamente disattivare lo sperma irradiando il campione con 800.000 uJ/mm2.
    8. Utilizzando una pipetta P10, pipette la sospensione sulle uova non fecondate, ricoprendo ogni uovo con 0,25-0,5 litri di sperma irradiato. Lasciare che le uova si siedano a temperatura ambiente per 30 min.
    9. Dopo 30 min, allagare le uova con 0,1x MMR. Mettete immediatamente le uova in un'incubatrice di 8-10 gradi centigradi per le iniezioni il giorno successivo o a 18 gradi centigradi per le iniezioni entro 7 ore dopo l'attivazione (hpa).
    10. Dejelly aploidi con forza affilata 30 min dopo l'idratazione. Mettete immediatamente le uova in un'incubatrice di 8-10 gradi centigradi per le iniezioni il giorno successivo o a 18 gradi centigradi per le iniezioni lo stesso giorno.

3. Mutagenesi e manutenzione haploid

  1. Microiniezioni CRISPR/Cas9
    1. Progetta sgRNA utilizzando CRISPRscan e sintetizza26,27.
    2. Per la mutagenesi multiplex, preparate uno stock di 5 sgRNA (10 ng/L per ogni sgRNA) e una proteina Cas9 (1 g/l). Preparare una diluizione di 100 volte di questo stock (0,1 ng/L per sgRNA, 10 ng/L Cas9) per l'iniezione. Per il singolo gene, alta frequenza di mutazione, seguire il protocollo descritto in precedenza28.
    3. Iniettare gli embrioni aploidi allo stadio a cella singola di 7 ha se immagazzinati a 18 gradi centigradi o iniettare gli embrioni il giorno successivo allo stadio di 2/8 cellule se sono immagazzinati a 8.10 gradi centigradi.
    4. Trasferire gli embrioni a 1,0 x MMR con 400 polisucrosi al 20%.
    5. Se a singola cellula, iniettare a ogni embrione una goccia di 5 nL della soluzione di iniezione (circa 1/4 raggio dell'uovo) contenente una massa totale di 0,5 pg/sgRNA e 50 pg Proteina Cas9. Se multicellulare, distribuire questa massa iniettando volumi più piccoli in più cellule.
    6. Lasciare che gli embrioni guariscano nella polisucrosi 400 per un minimo di 4 h e un massimo di 18 h a 18 gradi centigradi.
  2. Alloggiamento embrionale aploide
    1. Trasferire gli embrioni a 0,1x MMR con antibiotico-antimicotico.
    2. Casa ogni embrione in un pozzo individuale di una piastra di 24 pozze, come alcuni moriranno o si svilupperanno in modo anomalo. Mantenere a 16/18 gradi centigradi. Temperature più basse possono essere utilizzate per prolungare lo sviluppo, se necessario.
    3. Sostituire i supporti con mMR fresco 0.1x con antibiotico-antimicotico a giorni alterni.

4. Preparazione dell'embrione dell'ospite diploide

  1. Mantenere gli embrioni nel rivestimento della gelatina a 12-16 gradi centigradi fino a raggiungere lo stadio da 22 a 26.
  2. Raccogliere gli embrioni pronti per l'innesto, posizionarli all'interno di un setaccio (dimensioni della rete di 4 mm) e sciacquarli delicatamente con il 40% della soluzione di Holtfreter.
  3. Trasferire gli embrioni in mMR calibro sterilizzato 0,1x contenenti 1,5% di candeggina fino a 2 min. Sommergendo completamente gli embrioni nella soluzione di candeggina e vorinferoli delicatamente per garantire che il rivestimento della gelatina entri pienamente in contatto con la soluzione di candeggina per uccidere i microbi presenti sugli embrioni.
  4. Dopo 2 min, diluire la soluzione di candeggina contenente gli embrioni con un volume uguale di filtro-sterilizzato 0.1x MMR.
  5. Versare delicatamente gli embrioni in un setaccio candeggina sanitizzato (dimensioni maglia 4 mm) e risciacquare gli embrioni cinque volte con 0,1m MMR sterilizzato con filtro.
  6. Collocare gli embrioni in sterili piatti di Petri da 10 cm con 0,1 mM con antibiotici per la denicecciatura (penicillina 100 unità/mL, streptomicina 100 g/l, 0,25 g/mL, gentamicin 25 g/mL).
  7. Sotto uno stereoscopio fluorescente, rimuovere i cappotti di gelatina e le membrane vitelline dagli embrioni GFP utilizzando pinze affilate (dimensioni della punta 0,05 x 0,01 mm2).
  8. Trasferire gli embrioni di GFP in una nuova piastra di Petri. Ridurre al minimo la quantità di liquido trasferito dalla piastra di Petri dove sono stati dejellied.
  9. Risciacquare gli embrioni dell'ospite di GFP con sterili 0,1 volte MMR con antibiotici da quattro a sei volte per rimuovere i contaminanti.
  10. Collocare gli embrioni puliti a 4 gradi centigradi durante la notte prima dell'innesto.
    NOTA: Il raffreddamento degli embrioni li rende più rigidi e puliti separazioni del mesoderma dall'endoderma fattibile.

5. Generazione Chimera aploide-diploide-diploide

  1. Preparazione chirurgica di piatti e supporti
    1. Preparare sterili piatti chirurgici operativi versando autoclaved 2% agarose in 0.1x MMR in sterili 35 mm piatti di Petri facile afferratura. Riempire i piatti di petri a metà strada con agarose.
    2. Dopo che l'agarose si raffredda, utilizzare un bisturi sterile per tagliare una depressione lunga 25 mm nell'agarose per tenere gli embrioni in posizione.
    3. Riempire il piatto con supporti chirurgici sterili (0,1m MMR con anti-micoplasma 2,5 g/mL, amphotericin B 0,25 g/mL e ciprofloxacin 10,0 g/mL) e conservare in frigorifero a 4 gradi centigradi.
  2. Procedura di innesto dell'embrione
    1. Collocare all'interno della depressione della parabola operativa prescolata un donatore sano di aploide con uno o due embrioni dell'ospite diploide GFP e corrispondente allo stadio all'interno della depressione della parabola operativa preclata contenente supporti chirurgici (Figura 3).
      NOTA: Se possibile, eseguire la procedura su una fase di raffreddamento (10 o inferiore).
    2. Utilizzare due pinze ultra-sottili e autoclaved (punta dritta, dimensioni della punta 0,05 x 0,02 mm2) per rimuovere gli strati di ectoderm e mesodermi dall'ospite con l'arto gemma vicino al centro (Figura 4).
      NOTA: La regione di innesto di tessuto rettangolare comprende il bocciolo dell'arto ed estende dalla nona somite alla metà posteriore del rigonfiamento branchiale, circa 2 mm, lungo l'asse posteriore anteriore. Lungo l'asse dorsoventrale, la regione innestata si estende per circa 1,5 mm, comprese le somiti appena oltre il bordo ventrale del rigonfiamento branchiale branchiale. La regione innestata comprende tutto il mesoderma laterale della piastra e le metà laterali dei somiti, senza disturbare l'endoderma sottostante. Vedere Figura 4 e il video di accompagnamento per i dettagli.
    3. Mettere da parte il tessuto ospite e rimuovere un lasso di tessuto di dimensioni equivalenti dal donatore aploide utilizzando gli stessi metodi.
    4. Posizionare la lastra di tessuto del donatore aploide sulla regione corrispondente dell'embrione del donatore.
    5. Fissare il tessuto coprendolo con un frammento di vetro rettangolare autoclato da un vetro di copertura del microscopio schiacciato e premendolo delicatamente nel corpo dell'embrione ospite.
    6. Capovolgere l'embrione del donatore aploide sul suo lato opposto per raccogliere il germoglio dell'arto per il secondo embrione ospite. Ripetere i passaggi da 5.2.2 a 5.2.5.
    7. Rimuovere con cautela i tessuti ospiti in eccesso rimanenti e l'embrione del donatore dal piatto.
    8. Lasciare gli innesti con le ancore del frammento di vetro in posizione per 60-75 min, controllando ogni 20 min per assicurarsi che il vetro non sia scivolato via.
    9. Dopo che gli innesti di tessuto aderiscono completamente, utilizzare le pinze per staccare lentamente le ancore del frammento di vetro.
  3. Manutenzione Chimera
    1. Trasferite gli embrioni innestati su supporti chirurgici freschi e manteneteli a 8,12 gradi centigradi durante la notte per guarire. Casa individualmente embrioni innestati in piastre 12 o 24-bene.
    2. Dopo 36-48 h, trasferire gli embrioni innestati in sterile 0,1x MMR antibiotic-antimicotic. I forti antibiotici nei media chirurgici causano tossicità negli embrioni innevati dopo 3 giorni.
    3. Sostituire i supporti con mMR freschi 0,1x e antibiotici ogni 2/3 giorni.
    4. Mantenere gli embrioni innestati a 18 gradi centigradi fino a quando non sono in grado di nutrirsi di28.
    5. Dopo 1 o 2 mesi di sviluppo e cura, gli arti aploidi possono essere segnati per la purezza dell'innesto utilizzando un microscopio a dissezione fluorescente.
      NOTA: La presenza di tessuto GFP non neurale o non-sanguinario derivato da host negli arti è un indicatore di innesto impuro ed è spesso associata allo sviluppo anormale degli arti. Questi animali dovrebbero essere esclusi da ulteriori analisi.

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Risultati

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Lo sviluppo di embrioni aploidi può essere distinto dagli embrioni diploidi dal loro fenotipo29della loro "sindrome aploide". In fase di innesto, gli embrioni aploidi presentano una curvatura ridotta lungo l'asse anteriore-posteriore e un recinto incompleto della spina del tuorlo (Figura 3A). Un microscopio fluorescente può essere utilizzato per garantire che gli embrioni aploidi siano privi di espressioni GFP di deriv...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ci sono alcuni passaggi critici nel nostro protocollo per la generazione di chimere aploidi-diploidi che il tecnico operativo dovrebbe prendere in considerazione per risultati di innesto coerenti.

La ragione più probabile per cui la generazione di aploidi fallisce è dovuta a cattive condizioni di attivazione in vitro. Le quantità adeguate di spermatozoi motile devono essere utilizzate per attivare le uova. Per prolungare la motilità, i campioni di sperma devono sempre essere mantenuti a 4 grad...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare Katherine Roberts per la sua cura della colonia axolotl. I finanziamenti per questo lavoro sono stati erogati dal Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 e 15-RMB-YALE-01) e dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Fellowship F32HD086942).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
#55 Dumont ForcepsFine Science Tools11295-1Utilizzare solo materiale Dumostar (può essere sterilizzato in autoclave)
Amfotericina BSigma AldrichA2942-20ML20 mL
Antibiotico-Antimicotico 100xThermo Fisher15240062
CiprofloxacinaSigma Aldrich17850-5G-F
Ficoll 400 (polisaccarosio 400)bioworld40600032-3Ficoll 400
GentamicinSigma AldrichG1914-250MG
Incubatore di riscaldamento/raffreddamentoRevSciRS-IF-233
Gonadotropina corionica umanaMerkChorulon
Megascript T7 Kit di trascrizioneThermo FisherAM133440 reazioni
Miroscope Cooling StageBrook IndustriesPersonalizzato
Personalizzato NLS Cas9 ProteinaPNAbioCP01-2004 fiale da 50 &; g di proteina ciascuna
PlasmocinInvivogenant-mpt-1Livello di trattamento
Ricette
1,0x Soluzione di Ringer modificata di Marc (MMR)0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7,8), ph 7,4
Holtfreter al 40%20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH a 7,4
Soluzione di

Riferimenti

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