Questo obiettivo di questo protocollo è quello di produrre axolotl chimerici con arti anteriori aploidi derivati dal tessuto donatore mutageno Cas9 utilizzando tecniche di innesto di tessuti embrionali.
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Articolo metodologico
Generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso l'innesto embrionale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un insieme crescente di tecniche e risorse genetiche consente ai ricercatori di sondare le origini molecolari della capacità di alcune specie di salamandre, come gli axolotl, di rigenerare interi arti da adulti. Qui, illustremo le tecniche utilizzate per generare axolotl chimerici con arti anteriori aploidi aploidi con anammi aploidi con anamne aploidi con anamne mutagenizzati di Cas9 che possono essere utilizzati per esplorare la funzione genica e la fedeltà della rigenerazione degli arti. Uniamo diverse tecniche embrionali e genetiche, tra cui la generazione di aploidi tramite attivazione in vitro, la mutagenesi CRISPR/Cas9 e l'innesto di tessuto in un unico protocollo per produrre un sistema unico per lo screening genetico aploide in un organismo modello di rigenerazione. Questa strategia riduce il numero di animali, lo spazio e il tempo necessari per l'analisi funzionale dei geni nella rigenerazione degli arti. Ciò consente anche di sapiere le funzioni specifiche della rigenerazione dei geni che possono essere necessarie per altri processi essenziali, come l'organogenesi, la morfogenesi dei tessuti e altri processi embrionali essenziali. Il metodo qui descritto è una piattaforma unica per condurre lo screening genetico degli aploidi in un sistema modello di vertebrato.
Introduzione
Storicamente, l'innesto di tessuto embrionale negli anfibi è stata una tecnica importante per esplorare i meccanismi fondamentali della biologia dello sviluppo e della rigenerazione. L'axolotl, una specie di salamandra, possiede un'impressionante capacità di rigenerare i tessuti e strutture complesse come arti e organi dopo lesioni o amputazioni. Allo stesso modo impressionante, possono ricevere, senza rigetto, innesti tissutali da altri individui a stadi embrionali, giovani e adulti1,2,3. Regioni di embrioni che producono intere strutture come arti, code, occhi e teste, e te....
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Protocollo
Le procedure sperimentali utilizzate in questo protocollo sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yale (IACUC, 2017–10557) ed erano conformi a tutte le politiche e linee guida federali che disciplinano l'uso degli animali vertebrati. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati sull'Ambystoma mexicanum (axolotls) in strutture dell'Università di Yale.
1. Generazione di embrioni diploide
- Ottenere embrioni diploidi GFP per fungere da ospiti di innesto attraverso l'accoppiamento naturale utilizzando uno o due genitori gfp 24
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Risultati
Lo sviluppo di embrioni aploidi può essere distinto dagli embrioni diploidi dal loro fenotipo29della loro "sindrome aploide". In fase di innesto, gli embrioni aploidi presentano una curvatura ridotta lungo l'asse anteriore-posteriore e un recinto incompleto della spina del tuorlo (Figura 3A). Un microscopio fluorescente può essere utilizzato per garantire che gli embrioni aploidi siano privi di espressioni GFP di deriv.......
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Discussione
Ci sono alcuni passaggi critici nel nostro protocollo per la generazione di chimere aploidi-diploidi che il tecnico operativo dovrebbe prendere in considerazione per risultati di innesto coerenti.
La ragione più probabile per cui la generazione di aploidi fallisce è dovuta a cattive condizioni di attivazione in vitro. Le quantità adeguate di spermatozoi motile devono essere utilizzate per attivare le uova. Per prolungare la motilità, i campioni di sperma devono sempre essere mantenuti a 4 grad.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Katherine Roberts per la sua cura della colonia axolotl. I finanziamenti per questo lavoro sono stati erogati dal Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 e 15-RMB-YALE-01) e dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Fellowship F32HD086942).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Utilizzare solo materiale Dumostar (può essere sterilizzato in autoclave) |
| Amfotericina B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotico-Antimicotico 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacina | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polisaccarosio 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Incubatore di riscaldamento/raffreddamento | RevSci | RS-IF-233 | |
| Gonadotropina corionica umana | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Kit di trascrizione | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reazioni |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Personalizzato | |
| Personalizzato NLS Cas9 Proteina | PNAbio | CP01-200 | 4 fiale da 50 &; g di proteina ciascuna |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Livello di trattamento |
| Ricette | |||
| 1,0x Soluzione di Ringer modificata di Marc (MMR) | 0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7,8), ph 7,4 | ||
| Holtfreter al 40% | 20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH a 7,4 |
Riferimenti
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. <....
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Ristampe e permessi
