Presentato qui è un protocollo per l'uso dell'alginato come polimero nel microincapsulamento di cellule immortalate per la consegna a lungo termine di biologici agli occhi dei roditori.
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Articolo metodologico
Tecnologia a cellule incapsulate per la consegna dei biologici all'occhio del mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molte terapie attuali in fase di sviluppo per le malattie del polo posteriore dell'occhio sono biologiche. Questi farmaci devono essere somministrati frequentemente, in genere tramite iniezioni intravitrali. Le cellule incapsulate che esprimono il biologico di scelta stanno diventando uno strumento per la produzione e il rilascio di proteine locali (ad esempio, tramite la somministrazione di farmaci a lungo termine). Inoltre, i sistemi di incapsulamento utilizzano materiali permeabili che consentono la diffusione di nutrienti, rifiuti e fattori terapeutici all'interno e all'esterno delle cellule. Ciò si verifica mentre si mascherano le cellule dalla risposta immunitaria dell'ospite, evitando la necessità di soppressione del sistema immunitario dell'ospite. Questo protocollo descrive l'uso dell'algerino come polimero nel microincapsulamento accoppiato con il metodo elettrospray come tecnica di microincapsulazione. Le cellule ARPE-19, una linea cellulare RPE umana che nasce spontaneamente, è stata utilizzata in esperimenti di terapia cellulare a lungo termine a causa della sua funzionalità di durata, ed è usato qui per incapsulare e consegnare le capsule agli occhi del topo. Il manoscritto riassume i passaggi per la microincapsulazione cellulare, il controllo qualità e la consegna oculare.
Introduzione
Le terapie basate sulle cellule rappresentano tecniche biologiche rivoluzionarie che sono state ampiamente applicate in medicina. Recentemente, sono stati applicati con successo nel trattamento di malattie neurodegenerative, malattie degli occhi, e il cancro. Le terapie cellulari coprono un'ampia gamma di campi, dalla sostituzione cellulare alla somministrazione di farmaci, e questo protocollo si concentra su quest'ultimo. Le microcapsule alginate biodegradabili (MC) hanno dimostrato l'efficacia come sistema di somministrazione e stanno diventando ampiamente utilizzate in campo biomedico. Alginato è stato utilizzato in microincapsulazione grazie al suo semplice proces....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con la dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca ophtalmic e Vision e sono stati approvati dalla Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee sotto il protocollo ID 00399.
1. Cultura cellulare
- Generare cellule epiteliali del pigmento reticolare umano (ARPE-19) linea cellulare esprimendo stabilmente il gene di scelta secondo i protocolli pubblicati14,15.
- Mantenere le cellule nel Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrate con 10% siero bovino fetale (FBS).
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Risultati
Le cellule ARPE-19 sono una linea cellulare UMANA RPE immortalata spontaneamente che ha dimostrato di essere suscettibile di incapsulamento e sopravvivenza a lungo termine dopo l'impianto di capsule nell'occhio. Gli strumenti per l'incapsulamento algerato sono illustrati nella Figura 1. In questo studio, è stato dimostrato che dopo l'incapsulamento in algerino, le cellule in capsule altnate sono state confermate da immagini a campo luminoso (Figura 2A). I saggi .......
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Discussione
Questa tecnica di incapsulamento delle cellule è relativamente veloce e facile da eseguire; tuttavia, per ottenere risultati accurati a valle, è necessario tenere presenti alcuni punti. Le cellule devono essere mantenute in coltura in un piatto Petri prima dell'incapsulamento e tenute a giusta confluenza. L'incapsulamento deve essere eseguito in una corretta cappa di ventilazione con flusso d'aria regolato, se possibile. Troppo forte di una corrente d'aria può influenzare la formazione di capsule, soprattutto negli esper.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Lo studio è stato sostenuto in parte da sovvenzioni assegnate a B. R. dai National Institutes of Health (R01EY019320), dal Department of Veterans Affairs (RX000444 e BX003050) e dal South Carolina SmartState Endowment.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 3 mL | BD | 309656 | |
| 30 G 1" Ago smussato | SAI Tecnologia di infusione | B30-100 | |
| Acido alginico sale sodico, da alghe brune | Sigma | A0682 | |
| Atropina Solfato Soluzione oftalmolica (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | per dilatazione pupillare |
| BD Siringa da 1 ml 26 G x 3/8 (0,45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson e L'azienda | DG518105 500029609 REF 309625 | per generare il foro guida |
| Cloruro di calcio, anidro, granulare | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | per lubrificare gli occhi durante l'anestesia |
| Goniotaire: Ipromellosa (2,5%) Soluzione demulcente oftalmolica (sterile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | per lubrificare gli occhi durante l'anestesia |
| Punta dell'ago/siringa di Hamilton: 27 G, Small Hub RN NDL, lunghezza custum (12 mm), stile di punta 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | per la somministrazione intravitreale di capsule |
| Siringa di Hamilton: 2,5 &; L, Modello 62 RN SYR, NDL Venduto separatamente | Hamilton | 7632-01 | per la somministrazione intravitreale di capsule |
| Tampone HEPES, 1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| Generatore ad alta tensione | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-Ornitina cloridrato, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomicina e Polimixina B Solfato e Desametasone Unguento oftalmolico | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiotico per prevenire l'infezione dopo iniezione intravitreale |
| Fenofenefrina cloridrato Soluzione oftalmolica (2,5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | per dilatazione pupillare |
| Cloruro di sodio | Sigma | S-5886 | |
| Siringa sterile filtri, 0,2 μ m | VWR | 28143-312 | |
| Pompa a siringa | GRASEBY | MS16A |
Riferimenti
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Drug delivery systems: entering the mainstream. Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).
- Tonnesen, H. H., Karlsen, J. Alginate in drug delivery systems. Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).
- Vilos, C., Velasquez, L. A. <....
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Ristampe e permessi
