È stato sviluppato un protocollo di microdissezione di cattura laser (LCM) per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica nelle cellule ossee. L'attuale studio si concentra sulle sezioni del femore del topo. Tuttavia, il protocollo LCM riportato qui può essere utilizzato per studiare l'espressione genica nelle cellule di qualsiasi tessuto duro.
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Articolo metodologico
Un protocollo di microdissezione di cattura laser che produce RNA di alta qualità da ossa di mouse fresh-congelate
In questo articolo
Sommario
Abstract
La resa e l'integrità dell'RNA sono decisive per l'analisi dell'RNA. Tuttavia, è spesso tecnicamente difficile mantenere l'integrità dell'RNA durante l'intera procedura di microdissezione di cattura laser (LCM). Poiché gli studi LCM funzionano con basse quantità di materiale, anche le preoccupazioni circa le limitate rese di RNA sono importanti. Pertanto, è stato sviluppato un protocollo LCM per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica nelle cellule ossee. È stato valutato l'effetto del protocollo di colorazione, dello spessore delle criosezioni, della quantità di tessuto microdissecazione, del kit di estrazione dell'RNA e del sistema LCM utilizzato sulla resa e l'integrità dell'RNA ottenuto dalle cellule ossee microdisseche. Le sezioni ossee congelate spesse otto m sono state realizzate utilizzando una pellicola adesiva e macchiate utilizzando un protocollo rapido per una macchia Commerciale di LCM. Il campione è stato inserito tra una membrana di terephthalate (PET) in polietilene e la pellicola adesiva. Un sistema LCM che utilizza la gravità per la raccolta dei campioni e un metodo di estrazione dell'RNA basato su colonne è stato utilizzato per ottenere RNA di alta qualità di resa sufficiente. L'attuale studio si concentra sulle sezioni del femore del topo. Tuttavia, il protocollo LCM riportato qui può essere utilizzato per studiare l'espressione genica situ in cellule di qualsiasi tessuto duro sia in condizioni fisiologiche che nei processi della malattia.
Introduzione
I tessuti sono costituiti da tipi di cellule eterogenee e distribuite spazialmente. Diversi tipi di cellule in un dato tessuto possono rispondere in modo diverso allo stesso segnale. Pertanto, è essenziale poter isolare specifiche popolazioni cellulari per la valutazione del ruolo dei diversi tipi di cellule sia in condizioni fisiologiche che patologiche. La microdissezione di cattura laser (LCM) offre un metodo relativamente rapido e preciso per isolare e rimuovere le cellule specificate dai tessuti complessi1. I sistemi LCM utilizzano la potenza di un raggio laser per separare le cellule di interesse dalle sezioni del tessuto istologico senza....
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Protocollo
Il tessuto osseo dei topi è stato utilizzato in stretta conformità con le linee guida prevalenti per la cura degli animali e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza degli animali.
1. Animali e congelare l'incorporamento
- Animali da casa in condizioni di temperatura ambiente costante (RT; 24 ) e un ciclo di luce 12 h 12 h scuro con accesso gratuito al cibo e all'acqua.
NOTA: Tessuti ossei in questo studio sono stati ottenuti da topi di tipo selvatico C57BL/6 di tipo maschile di 3 mesi. - Alla necroscopia, i topi esanguinati dalla vena cava addominale in anestesia generale (ke....
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Risultati
È stato sviluppato un protocollo LCM per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica nelle cellule ossee dei femori murini. Nel protocollo ottimizzato, 8 sezioni di osso congelato spesse 8 m sono state tagliate su una pellicola adesiva e macchiate utilizzando un protocollo rapido per una macchia di sezione congelata LCM commerciale. Il campione è stato inserito tra la membrana PET e la pellicola adesiva. Le cellule ossee del topo sono state microcono utilizzando un siste.......
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Discussione
Sia la qualità dell'RNA che la quantità possono essere influenzate negativamente in tutte le fasi della preparazione del campione, come la manipolazione dei tessuti, il processo LCM e l'estrazione dell'RNA. Pertanto, è stato sviluppato un protocollo LCM per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per la successiva analisi dell'espressione genica.
Per LCM, la maggior parte dei laboratori utilizza le sezioni di 7,8 m di spessore2. Sezioni più spesse consentirebbero di.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Ute e Nikole Ginner per il loro eccellente aiuto tecnico, così come il personale Vetcore e la cura degli animali per il loro supporto.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Etanolo assoluto EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Pellicola adesiva (pellicola LMD) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies Agilent RNA | ||
| 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Soluzione di colorazione Arcturus HistoGene | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Strumento di montaggio del criofilm | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Vetrini per microscopio, colore di taglio arancione smerigliato | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Stampi per tessuti istologici PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion Sistema | Leica Microsystems | ||
| Lame per microtomo a basso profilo Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Acqua priva di nucleasi | VWR Life Science | E476-500ML | |
| Vetrini a membrana in PET 1,4 μ m | Macchine molecolari & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away decontaminante per superfici | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xilene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
Riferimenti
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Ca....
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Ristampe e permessi
