Qui descriviamo un metodo in vitro di imaging dal vivo per visualizzare il trasporto intracellulare di organelli e il traffico di proteine della membrana plasmatica negli astrociti murini. Questo protocollo presenta anche una metodologia di analisi delle immagini per determinare gli itinerari e la cinetica nel trasporto merci.
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Articolo metodologico
Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli astrociti sono tra i tipi di cellule più abbondanti nel cervello adulto, dove svolgono ruoli chiave in una molteplicità di funzioni. Come un giocatore centrale nell'omeostasi del cervello, gli astrociti forniscono ai neuroni metaboliti vitali e tamponamento di acqua extracellulare, ioni e glutammato. Componente integrante della sinapsi "tri-partite", gli astrociti sono anche critici nella formazione, potatura, manutenzione e modulazione delle sinapsi. Per consentire queste funzioni altamente interattive, gli astrociti comunicano tra di loro e con altre cellule gliali, neuroni, la vascolatura cerebrale e l'ambiente extracellulare attraverso una moltitudine di proteine della membrana specializzate che includono cellule molecole di aderenza, acquaporine, canali ionici, trasportatori di neurotrasmettitori e molecole di giunzione gap. Per supportare questo flusso dinamico, gli astrociti, come i neuroni, si basano su un trasporto intracellulare strettamente coordinato ed efficiente. A differenza dei neuroni, dove il traffico intracellulare è stato ampiamente delineato, il trasporto basato su microtubuli negli astrociti è stato meno studiato. Tuttavia, il traffico eso- ed endocitico delle proteine della membrana cellulare e del trasporto di organelli intracellulari orchestra la biologia normale degli astrociti, e questi processi sono spesso colpiti dalla malattia o in risposta a lesioni. Qui presentiamo un protocollo semplice alla coltura astrociti murini di alta qualità, per etichettare fluorescentmente proteine astrociti e organelli di interesse, e per registrare la loro dinamica di trasporto intracellulare utilizzando la microscopia con time-lapse. Dimostriamo anche come estrarre e quantificare i parametri di trasporto rilevanti dai film acquisiti utilizzando i plug-in disponibili per il software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ/FIJI).
Introduzione
Gli astrociti sono le cellule più abbondanti nel sistema nervoso centrale adulto, dove svolgono funzioni uniche di sviluppo e omeostatiche1. Gli astrociti modulano lo sviluppo sinaptico attraverso il contatto diretto con terminali pre e post-sinaptici come parte della sinapsi tri-partita, che contiene recettori del neurotrasmettitore, trasportatori e molecole di adesione cellulare che facilitano la formazione di sinapsi e comunicazione neurona-astrocito2. Inoltre, gli astrociti controllano attivamente la trasmissione sinaptica e prevengono l'eccitotossicità neuronale rimuovendo rapidamente i neurotrasmettitori eccitatori....
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione dell'Università della Carolina del Nord presso il Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Dissezione cerebrale e cultura dei principali astrociti del topo
NOTA: il seguente protocollo è stato adattato dai metodi pubblicati, che segue la procedura originale sviluppata da McCarthy e deVellis13,14,15. Le colture cellulari miste di mcCarthy/deVellis (MD) sono preparate dal giorno postnatale 2-4 (P2-P4), trattate con un fattore anti-mitotico, ....
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Risultati
Il protocollo per la creazione di astrociti MD topi sopra descritti dovrebbe produrre culture riproducibili e di alta qualità. Sebbene le colture contengano inizialmente un mix di astrociti, fibroblasti e altre cellule gliali, tra cui microglia e oligodendrociti (Figura1Bi,Biv; punte di freccia rosse), l'aggiunta di AraC alla coltura mista tra DIV5-DIV7 riduce al minimo la proliferazione di queste cellule contaminanti. Il trattamento combinato AraC e la strategia di purifica.......
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Discussione
Qui, descriviamo un approccio sperimentale per esprimere, visualizzare e monitorare gli organelli etichettati fluorescentmente e le proteine della membrana di interesse utilizzando la microscopia video time-lapse in astrociclici corticali corticali di topo ad alta purezza. Illustreremo anche una metodologia per misurare la dinamica delle particelle. La visualizzazione diretta delle dinamiche di proteine e organelli negli astrociti primari fornisce un potente strumento per studiare la regolazione del trasporto intracellul.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
DNL è stato supportato dalla University of North Carolina a Chapel Hill (UNC) School of Medicine come Simmons Scholar. TWR è stata supportata da UNC PREP Grant R25 GM089569. Il lavoro che utilizza l'UNC Neuroscience Center Microscopy Core Facility è stato sostenuto, in parte, dal finanziamento del NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P3 NS0 NS0 45892 e del NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2,5% tripsina (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Centrifuga da banco | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuga |
| per colture cellulari Clone | Gen Clone | 25-511 | |
| Microscopio per colture cellulari | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 cannocchiale invertito, microscopio per colture tissutali invertito con capacità fluorescenti |
| Citosina Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Sciogliere la polvere liofilizzata in acqua sterile per colture cellulari per ottenere uno stock di 10 mM, aliquotare e congelare per la conservazione a lungo termine |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Sciogliere la polvere liofilizzata in acqua deionizzata a una concentrazione massima di 20 mg/ml, riscaldare o sonicare secondo necessità. Utilizzare a 300 nM per la controcolorazione. |
| Microscopio da dissezione | Zeiss | Stemi 305 | |
| Forbici da dissezione | FST | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetale Siero bovino | Gemini | 100-106 | Inattivato a caldo |
| FIJI (Fiji è solo l'immagine J) | NIH | Versione 1.52i | |
| Pinzette a punta fine | F.S.T | 11254-20 | Stile #5 |
| Sorgente luminosa a fluorescenza | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP Anticorpo Segnalazione | cellulare | 3670S | GFAP (GA5) Anticorpo monoclonale di topo |
| Piatti con fondo in vetro | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | Piatto da 35 mm | N. 1.5 Vetrino coprioggetti | Diametro del vetro 14 mm | Pinze Graefe non rivestite |
| F.S.T | 11054-10 | Pinze Graefe Iris con punte curve | |
| Colorante fluorescente verde che colora i compartimenti acidi (endosomi tardivi e lisosomi) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-disciolto in DMSOS in una soluzione stock da 1 mM. Diluire fino alla concentrazione di lavoro finale nel terreno di coltura o nel tampone scelto. |
| Soluzione salina bilanciata di Hank (10x) | Gibco | 14065-056 | Senza magnesio e calcio |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Soluzione di imaging di cellule vive |
| Microscopio confocale invertito | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Reagente per potenziare la lipofezione | Life Technologies | 11514015 | Plus |
| Reagente per lipofezione | Technologies | 15338100 | Reagente per lipofectamina LTX Incubatore |
| agitazione orbitale | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , incubatore con agitazione orbitale con controllo della temperatura e della velocità |
| Soluzione di penicillina/strepomicina (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poli-D-lisina bromidrato | Sigma | P7405 | Sciogliere in tampone Tris, pH 8,5, a 1 mg/mL. Congelare per la conservazione a lungo termine. Evitare cicli di congelamento e scongelamento |
| Siero ridotto Terreno | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Fiasche per colture tissutali | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. Accesso al collo angolato al 100%, tappo filtrante ventilato idrofobico da 0,22 um |
| Incubatore per colture tissutali Thermo | Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, incubatore per colture tissutali con controllo |
| di temperatura, umidità e CO2Tris-Base | Sigma | T1503 | 8,402 g disciolto in un litro in acqua con 4,829 g Tris HCl per fare 0,1 M di tampone Tris, pH 8,5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4,829 g disciolto in un litro in acqua con 8,402 g Tris Base per fare 0,1 M di tampone Tris, pH 8,5 |
| Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo | Gibco | 25200072 | |
| Sistemi di filtraggio a vuoto | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, membrana in PES, 0,22 & micro; m |
| Vannas forbici dritte | Roboz | RS-5620 |
Riferimenti
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences<....
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Ristampe e permessi
