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Articolo metodologico

Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino

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⸱

DOI:

10.3791/60255

⸱

20 settembre 2019

 ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica. La nostra applicazione di imaging time-lapse consente all'utente di identificare le cellule in varie fasi della mitosi, monitorare e identificare i difetti mitotici e analizzare la dinamica del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo l'esposizione a farmaci anti-mitotici.

Abstract

L'imaging time-lapse delle cellule vive è uno strumento importante nella biologia cellulare che fornisce informazioni sui processi cellulari che potrebbero altrimenti essere trascurati, fraintesi o mal interpretati dall'analisi a cellule fisse. Sebbene l'imaging e l'analisi delle celle fisse siano robuste e sufficienti per osservare lo stato costante cellulare, può essere limitata nella definizione di un ordine temporale di eventi a livello cellulare ed è mal equipaggiata per valutare la natura transitoria dei processi dinamici, tra cui progressione mitotica. Al contrario, l'imaging delle cellule vive è uno strumento eloquente che può essere utilizzato per osservare i processi cellulari a livello di singola cellula nel tempo e ha la capacità di catturare le dinamiche dei processi che altrimenti sarebbero scarsamente rappresentati nell'imaging di cellule fisse. Qui descriviamo un approccio per generare cellule che trasportano marcatori fluorescenti etichettati di cromatina e microtubuli e il loro uso in approcci di imaging a cellule vive per monitorare l'allineamento del cromosoma metafase e l'uscita mitotica. Descriviamo tecniche basate sull'imaging per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica, compresa l'identificazione delle cellule in varie fasi della mitosi, l'identificazione e il monitoraggio dei difetti mitotici, nonché l'analisi delle dinamiche del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo il trattamento con inibitori mitotici.

Introduzione

L'analisi basata sull'immagine delle cellule fisse è comunemente usata per valutare i cambiamenti del livello della popolazione cellulare in risposta a varie perturbazioni. In combinazione con la sincronizzazione delle celle, seguita dalla raccolta e dall'imaging di punti temporali seriali, tali approcci possono essere utilizzati per suggerire una sequenza cellulare di eventi. Tuttavia, l'imaging a cellule fisse è limitato in quanto le relazioni temporali sono implicite per una popolazione e non dimostrate a livello di singole cellule. In questo modo, mentre l'imaging e l'analisi delle cellule fisse sono sufficienti per osservare fenotipi robusti e cambiamenti di stato costante, la capacità di rilevare cambiamenti transitori nel tempo e cambiamenti che influenzano solo una sottopopolazione delle cellule è imperfetta. Al contrario, l'imaging delle cellule vive è uno strumento eloquente che può essere utilizzato per osservare i processi cellulari e subcellulari all'interno di una singola cellula, o popolazione cellulare, nel tempo e senza l'aiuto di approcci di sincronizzazione che possono avere un impatto sul comportamento cellulare 1 : il nome del , 2 Il nome del sistema , 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6.

La formazione di un mandrino mitotico bipolare è essenziale per la corretta segregazione cromosomica durante la divisione cellulare, con conseguente due cellule figlie geneticamente identiche. I difetti nella struttura del mandrino mitotico che corrompono la progressione mitotica e compromettono la fedeltà della segregazione cromosomica possono portare a divisioni cellulari catastrofiche e a una riduzione della vitalità cellulare. Per questo motivo, i veleni mitotici che alterano la formazione del mandrino sono promettenti terapie per limitare la rapida proliferazione delle cellule tumorali7,8,9. Tuttavia, l'analisi a cellule fisse della struttura del mandrino dopo l'aggiunta di veleni mitotici è limitata nella sua capacità di valutare il processo dinamico di formazione del mandrino e non può indicare se i cambiamenti osservati nella struttura del mandrino sono permanenti o sono invece transitorio e può essere superato per consentire la divisione cellulare di successo.

In questo protocollo, descriviamo un approccio per valutare la dinamica della mitosi in seguito alle perturbazioni del mandrino mediante l'imaging delle cellule vive. Utilizzando la linea cellulare RPE-1 immortalata hTERT progettata per esprimere un Histone 2B con tag RFP per visualizzare la cromatina, insieme a una z-tubulina con tag EGFP per visualizzare i microtubuli, la tempistica dell'allineamento del cromosoma della metafase, l'insorgenza dell'anfase e, infine, l'insorgenza il destino delle cellule mitotiche viene valutato utilizzando segnali visivi di movimento cromosomico, compattazione e morfologia nucleare.

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Protocollo

1. Generazione di cellule hTERT-RPE-1 che esprimono stabilmente RFP-Histone 2B (RFP-H2B) e z-tubulin-EGFP (tub-EGFP)

NOTA: Tutti i passi seguono tecniche asettiche e si svolgono in un armadio di sicurezza di livello di biosicurezza II (BSL2).

  1. Generare retrovirus che trasporta i geni di interesse (z-tubulina-EGFP e RFP-H2B) con la trasfezione di 293T cellule con le plasmiche lentivirali appropriate secondo le istruzioni del produttore del sistema di erogazione della trasfezione a base di lipidi.
    1. Giorno 1: Utilizzare una pastortta di vetro usa e getta per aspirare il mezzo di coltura cellulare da una piastra di cellule 293T sub-confluente e lavare via il mezzo residuo con salina tamponata fosfato (PBS) aggiungendo 5 mL di PBS. Swirl per distribuire PBS sul fondo della piastra, quindi aspirare il PBS con una pipetta pasteur in vetro usa e getta sterile.
    2. Aggiungete 2 mL di 0,05% di cipina che è stata preriscaldata a 37 gradi centigradi e riportare la piastra su un'incubatrice umidificata a 37 sC con 5% di CO2 per 2-5 min per consentire il rilascio delle cellule aderenti dalla superficie del piatto di coltura cellulare.
    3. Aggiungere 8 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina/streptomicina alla piastra contenente la trippsina.
    4. Risospendere le cellule con il tubo e trasferire delicatamente la sospensione in un tubo conico sterile da 15 mL. Posizionare il tubo conico in una centrifuga bilanciata e ruotare a 161 x g per 5 min a temperatura ambiente per spingere delicatamente le cellule.
    5. Aspirare la soluzione media/trippsina da cellule pellettate e resospendere le cellule in 10 mL di DMEM integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina. Utilizzare un emocitometro per contare le sospensioni cellulari 293T e la piastra 2 x 106 293T cellule per pozzo di un 6 pozzo.
    6. Cellule di coltura in un volume totale di 2 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrate con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina/streptomicina e mantenute in un incubatore umido a 37 gradi centigradi con 5% di CO2.
    7. Giorno 2: Pipette 7 - L di reagente di consegna trasfezione a base di lipidi e 100 l di mezzo siero ridotto in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e permettergli di incubare a temperatura ambiente per 5 min (tubo #1).
    8. In un tubo di microcentrismo da 1,5 mL separato, la pipetta 1 g di vettore di espressione RFP-H2B (o 1 g di vettore di espressione di z-tubulina-EGFP), insieme a 5 reagenti di potenziatore (come richiesto dalle linee guida del produttore), 0,5 g di pMD2.G e 1 psPAX2 e 100 medio siero (#2 tubo).
    9. Combinare il contenuto dei gradi 1.1.7 e 1.1.8 con il tubo pipettando attentamente #2 in #1 del tubo e incubare per 20 min a temperatura ambiente.
      NOTA: La reazione può essere scalata in base alle esigenze per la trasfezione delle cellule in pozzi aggiuntivi.
    10. Pipetta la reazione di trasfezione dropwise al pozzo desiderato contenente 293T cellule in 2 mL di media e riportare il piatto all'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi con 5% CO2.
      NOTA: per generare celle che esprimono sia RFP-H2B che z-tubulina-EGFP, generare virus separati per ogni costrutto di espressione (passaggi 1.1.7- 1.1.9).
    11. Giorno 3: Aspirata e sostituire il mezzo con 2 mL di DMEM fresco integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomiacina. Riportare il piatto nell'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
  2. Giorno 4: Raccogliere il mezzo contenente particelle virali espresse, essendo cauti a non interrompere o rimuovere 293T cellule. Filtrare il mezzo contenente particelle di virus passandolo attraverso un filtro da 0,45 M collegato a una siringa da 5 mL. Virus dell'aliquota per l'immagazzinamento a breve termine a 4 gradi centigradi, o di stoccaggio a lungo termine a -80 gradi centigradi.
    NOTA: Le particelle virali ottenute in questo modo saranno presenti in un intervallo compreso tra 1 x 107 e 1 x 108 Unità trasduttrice/mL. Poiché le cellule e le cellule che producono virali da infettare sono entrambe coltivate nello stesso mezzo, la concentrazione virale per sostituire il mezzo non è necessaria e le particelle virali filtrate possono essere utilizzate direttamente per infettare le cellule.
  3. Seme 2 x 105 cellule hTERT-RPE-1 per pozzo di un piatto di 6 po 'in preparazione per l'infezione virale. Cellule di coltura in 2 mL di DMEM integrate con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina e mantenere in un incubatore umidificato a 37 c con 5% CO2.
  4. Giorno 5: Aggiungere bromuro di esadimethrine (ad esempio, polibrene) alle cellule hTERT-RPE-1 ad una concentrazione finale di 8 g/mL. Infettare le cellule con una miscela di 500 l di virus diluito in 500 - L di mezzo di coltura cellulare.
    NOTA: La soluzione di bromuro di hexadimethrine viene preparata in acqua distillata sterile, quindi filtrata attraverso un filtro da 0,45 m.
  5. Giorno 6: Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro usa e getta, aspirare il mezzo da pozzi contenenti le cellule infette dal virus. Sostituire il mezzo di coltura cellulare con 2 mL di DMEM contenente 10% FBS, 1% penicillina/streptomicina e concentrazioni appropriate di antibiotici da selezionare per l'integrazione e l'espressione plasmide.
    NOTA: Il plasmide di espressione z-tubulina-EGFP utilizzato negli esperimenti descritti porta un gene della resistenza alla fornella e il plasmide di espressione RFP-H2B porta un gene di resistenza blasticidin. Pertanto, per la selezione delle cellule hTERT RPE-1 vengono utilizzati 10 g/mL di puromycin e 2 g/mL di blasticidin, RFP-H2B. Le concentrazioni di antibiotici utilizzati per la selezione possono differire per varie linee cellulari utilizzate.
  6. Mantenere le cellule sotto selezione antibiotica per 5-7 giorni, sostituendo il mezzo ogni 3 giorni con un supporto fresco contenente reagenti di selezione appropriati.
    NOTA: le celle devono essere mantenute alla sottoconfluenza durante la selezione e devono essere espanse in base alle esigenze, come descritto nei passaggi da 1.1.1 a 1.1.4.
  7. Utilizzare l'imaging immunofluorescenza per confermare l'espressione dei costrutti contrassegnati.
    NOTA: se lo si desidera, è possibile derivare cloni di celle singole per ottenere livelli di espressione uniformi all'interno della popolazione di celle. Una volta confermati i cloni stabili, le cellule possono essere mantenute nelle condizioni di coltura standard in assenza di selezione antibiotica.

2. Preparazione delle cellule per l'imaging delle cellule vive a seguito di perturbazioni del mandrino mitotico

NOTA: utilizzare tecniche asettiche ed eseguire i passaggi in un cabinet di sicurezza BSL2.

  1. Utilizzando una sterile pipetta Pasteur in vetro usa e getta, aspirare il mezzo dalla piastra di coltura contenente la linea cellulare che trasporta i costrutti di espressione (dal punto 1.7). Lavare brevemente le cellule con 10 mL di PBS sterile. Swirl per distribuire PBS sul fondo della piastra, quindi aspirare PBS con una pipetta Pasteur in vetro usa e getta sterile.
  2. Aggiungere 2 mL di 0,05% di prova alla piastra da 10 cm. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 2-5 min o fino a quando le cellule si sono staccate dalla superficie della piastra.
  3. Aggiungere 8 mL di mezzo fresco alla piastra contenente la cappina. Risospendere le cellule con il tubo e trasferire delicatamente la sospensione in un tubo conico sterile da 15 mL. Posizionare il tubo conico in una centrifuga bilanciata e ruotare a 161 x g per 5 min a temperatura ambiente per spingere delicatamente le cellule.
  4. Aspirare con attenzione il superatante e risospendere in 10 mL di PBS pipetting delicatamente con una pipetta sierologica da 10 mL. Posizionare il tubo conico in una centrifuga bilanciata e ruotare a 161 x g per 5 min a temperatura ambiente per spingere delicatamente le cellule.
  5. Aspirare con attenzione il supernatante e risospendere in 10 mL del mezzo fresco pipeting delicatamente con una pipetta sierologica da 10 mL.
  6. Contare le celle, quindi calcolare il numero di cella utilizzando un emacytometro e diluire ad una concentrazione di 1-2 x 105 cellule / mL nel mezzo di coltura cellulare. Semina 500 l della sospensione cellulare per ogni pozzo di una piastra inferiore sterile da 12 pozzetto. Posizionare la piastra nell'incubatrice a coltura cellulare e consentire alle cellule di aderire alla superficie della piastra.
    NOTA: l'imaging a celle vive richiede che le cellule siano ben aderenti in modo che rimangano associate al piano di imaging durante l'acquisizione dell'immagine. La durata del tempo necessario affinché le cellule aderiscano dopo la placcatura possono differire da una linea cellulare a quella successiva e devono essere ottimizzate per la linea cellulare in fase di studio.
  7. Fino a 30 minuti prima di inizializzare l'imaging time-lapse, aggiungere una concentrazione rilevante di un farmaco mitotico a uno o più pozzi seminato con le cellule. Per tenere conto del potenziale impatto del solvente organico sul comportamento cellulare, aggiungere lo stesso volume del diluente dell'inibitore alle cellule come controlli. Ad esempio, assicurarsi che l'aggiunta di 100 nM dell'inibitore specifico della chinasi mitotica Aurora A (ad esempio, alisertib) sia parallela a un volume uguale di DMSO, il diluente per questo farmaco, in un pozzo di controllo delle cellule.
    NOTA: L'analisi comparativa dei cambiamenti dinamici nella progressione mitotica richiede la preparazione di pozzi di cellule in assenza di perturbazioni per consentire l'imaging di mitosi normali in parallelo alle condizioni sperimentali.

3. Microscopio impostato per l'imaging time-lapse di RFP-H2B, cellule esprimibili di z-tubulina-GFP (Figura 1, Figura 2)

  1. Posizionare la piastra di coltura cellulare contenente RFP-H2B, con cellule hTERT RPE-1 che esprimono le cellule hTERT RPE-1 in un inserto di fase appropriato su un microscopio a epifluorescenza invertito dotato di una fotocamera ad alta risoluzione (dimensione in pixel di 0,67 camera ambientale preriscaldata a 37 gradi centigradi, e un sistema di erogazione per umidificato 5% CO2.
    NOTA: sia le camere ambientali chiuse che gli inserti a fase controllata dalla temperatura possono essere appropriati a condizione che sia possibile fornire il 5% di CO2 umidificato e ottenere un controllo stabile della temperatura.
  2. Utilizzare un obiettivo d'aria 20x con un'apertura numerica di 0,5 e attrezzato per la fluorescenza ad alto contrasto e il contrasto di fase o l'imaging del campo luminoso. Visualizzare le celle con il contrasto di fase o il campo luminoso e regolare il percorso e la messa a fuoco fine sul microscopio per mettere a fuoco le cellule.
  3. Identificare e impostare i tempi di esposizione ottimali per l'acquisizione di immagini di campo luminoso, GFP e RFP selezionando il rispettivo cubo di filtro con eccitazione ed emissione appropriate per i fluorofori che verranno fotografati. In alternativa, fare clic sul pulsante di esposizione automatica per immettere un tempo di esposizione predeterminato. Se il segnale non è sufficientemente intenso, selezionare il binning dei pixel per consentire tempi di esposizione più brevi facendo clic sulla scheda binning e selezionando 2 x 2 pixel binning dal menu a discesa.
    NOTA: La fototossicità può compromettere la progressione mitotica e la vitalità cellulare. Il fallimento delle cellule mitotiche nelle popolazioni di controllo nel completare le mitosi normali può essere un'indicazione che i tempi di esposizione e/o la durata dell'imaging devono essere ulteriormente ottimizzati.
  4. Utilizzare un software di acquisizione e analisi che consente di acquisire contemporaneamente l'imaging multi-coordinate e multi-pozzetto e definire i parametri per l'acquisizione dell'immagine.
    1. Selezionare e calibrare lo stadio del microscopio al piatto multi-bene, secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare il software di acquisizione delle immagini per evidenziare o selezionare in altro modo i pozze che verranno immagini facendo clic sui pozzi rilevanti nel diagramma del formato piastra che viene utilizzato.
    2. Sotto il pannello di controllo GeneratedPoints (Figura 2), definire le coordinate all'interno di ogni pozzo che verrà visualizzato facendo clic sulla scheda Posizionamento punti e selezionando il posizionamento delle coordinate predefinite o casuali da dal menu a discesa. Selezionare la scheda Area di lavoro e selezionare limitata dal menu a discesa per limitare l'area di selezione delle coordinate per escludere i contorni del pozzo. Fare clic sulle schede Conteggio e Distribuzione per selezionare rispettivamente il numero e la distribuzione dei punti da acquisire.
      NOTA: Il numero di coordinate che possono essere imagete per bene all'interno dell'incremento del tempo di 5 min sarà limitato dal numero di pozzi da immaginare, nonché dal tempo di esposizione per ogni canale. Tipicamente, 5-8 coordinate per pozzo sono sufficienti per osservare almeno 50 cellule in ogni condizione di progresso attraverso la mitosi entro 4 h.
    3. Selezionare e immettere l'intervallo di tempo e la durata per raccogliere le immagini facendo clic e immettendo i valori nel pannello di controllo TimeSequence.
      NOTA: L'acquisizione di immagini ogni 1-5 minuti è appropriata per monitorare le dinamiche della progressione mitotica. La durata complessiva dell'imaging deve riflettere l'endpoint desiderato e la velocità di proliferazione della linea cellulare. Ad esempio, 4 ore sono sufficienti per vedere molte cellule progredire attraverso la mitosi, 16 ore sono sufficienti per vedere la maggior parte delle cellule RPE-1 in una popolazione asincrona progredire attraverso la mitosi.

4. Analisi dell'immagine time-lapse per determinare la temporizzazione della metafase e il destino delle cellule mitotiche a seguito di perturbazioni del mandrino mitotico

NOTA: eseguire l'analisi delle immagini utilizzando un software di acquisizione immagini (Table of Materials), ImageJ o un software di analisi delle immagini comparabile.

  1. Visualizza la cromatina etichettata RFP-H2B selezionando le immagini acquisite con il cubo del filtro RFP sul posto. Identificare una cella che entra in mitosi come indicato dalla compattazione iniziale della cromatina(Figura 2C,freccia blu) e l'inviluppo nucleare si rompe (quando la z-tubulina-EGFP non è più esclusa dal confine nucleare).
  2. Determinare la temporizzazione mitotica dell'allineamento della metafase e dell'insorgenza dell'anafase nelle singole celle: traccia reperino la cella attraverso i tempi consecutivi nel filmato acquisito per determinare il numero di punti temporali/minuti dall'immissione mitotica fino alla cromatina con etichetta RFP-H2B completa l'allineamento in corrispondenza dell'equatore cellulare durante la metafase (Figura 2C, punta della freccia gialla).
  3. Per monitorare la temporizzazione mitotica, la fedeltà mitotica e il destino delle cellule, continuare a tracciare la cella attraverso tempi consecutivi per identificare la coordinata temporale in cui è evidente la segregazione del cromosoma anaphase(Figura 2C, freccia bianca) e/o dove si è verificata la decompazione della cromatina e la riforma dell'involucro nucleare (come indicato dall'esclusione della tubulina dal nucleo).
    NOTA: le perturbazioni nell'assemblaggio del mandrino o nella progressione mitotica possono essere valutate in funzione del tempo necessario per ottenere un mandrino mitotico bipolare e ottenere un allineamento cromosomico completo o per completare la segregazione del cromosoma anaphase.
  4. Visualizza RFP-H2B per identificare le cellule in ogni popolazione che presentano difetti mitotici, tra cui cromosomi in ritardo e ponti cromatici durante la segregazione cromosomica anafase.
    NOTA: La fedeltà mitotica compromessa può anche provocare cellule figlie multinucleate o micronucleate e può essere visualizzata nelle celle dopo l'uscita mitotica, come nella Figura 3.

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Risultati

Valutazione della progressione mitotica in presenza di perturbazioni del mandrino
La regolazione della messa a fuoco del mandrino è un passo essenziale nella corretta formazione del mandrino bipolare. Interruzione in questo processo attraverso l'esaurimento delle proteine, inibizione dei farmaci, o alterazioni nel numero centroso centroso struttura del mandrino corrotto e ritardare o arrestare la progressione mitotica10,

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Discussione

La risoluzione temporale fornita dall'imaging time-lapse consente la visualizzazione e la valutazione degli eventi cellulari sequenziali all'interno di singole cellule. Gli approcci che fanno uso della sincronizzazione cellulare seguita dalla raccolta e dalla fissazione delle cellule nei punti temporali sequenziali sono limitati in quanto i confronti vengono infine effettuati tra popolazioni di cellule. Nei contesti in cui la risposta cellulare alle perturbazioni può essere non uniforme, o in cui il processo visualizzato...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

DLM è supportato da una NSF GRFP. ALM è supportato dal finanziamento dello Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% TripsinaGibo-Life sciences25-510Una serina proteasi utilizzata per rilasciare cellule aderenti da piastre di coltura
Provette da centrifuga da 15 mlOlympus Plastics28-101
20x CFI Plan Obiettivo Fluor.NikonPer l'uso nell'imaging di cellule vive per visualizzare sia il campo chiaro che la fluorescenza
Cellule 293T ATCCCRL-3216Per l'uso nella trasfezione retrovirale; utilizzato nella fase 1.1
a-tubulina-EGFP Addgenevari numeriVettore di espressione per l'alfa tubulina fusa con un tag proteico fluorescente verde; per l'uso nella visualizzazione della tubulina nell'imaging di cellule vive: disponibile in commercio tramite addgene e altri fornitori
AlisertibSelleckchemS1133Inibitore di piccole molecole della chinasi mitotica Aurora A. La concentrazione stock viene preparata a 10mM in DMSO e utilizzata a una concentrazione finale di 100nM.
BlasticidinaInvitrogenA11139-03Agente di selezione antibiotica; utilizzato per selezionare le cellule che esprimono EGFP
C02AirgasPer l'uso in colture cellulari e imaging di cellule vive
Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)Chroma49005Set di filtri a banda singola; lunghezza d'onda di eccitazione 545 nm con larghezza di banda di 25 nm ed emissione a lunghezza d'onda di 605 nm con larghezza di banda di 70 nm; per la visualizzazione di H2B-RFP
Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)Chroma49002Set di filtri a banda singola; lunghezza d'onda di eccitazione 470 nm con larghezza di banda di 40 nm ed emissione a lunghezza d'onda di 525 nm con larghezza di banda di 50 nm; per la visualizzazione di
pipette Pastuer in vetro monouso GFP-tubulina, sterilizzate Fisher Scientific13-678-6APer l'uso in celle di aspirazione 
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibo-Life sciences11965-084Terreno di coltura cellulare per la crescita di cellule RPE-1 e 293T
Siero fetale bovino (FBS)Gibo-Life sciences10438-026Integratore di terreno di coltura cellulare
Lipofectamine 3000 e p3000InvitrogenL3000-015Reagente di trasfezione a base di lipidi per la trasfezione di plasmidi; utilizzato in 1.1.4
Piastre per colture tissutali multipozzettoCorningvariper l'uso in colture cellulari, trasfezione/infezione e imaging di cellule vive
Microscopio Nikon Ti-EMicroscopioa epifluorescenza invertito Nikon per l'uso nell'imaging di cellule vive
NikonVersione 4.51Software di acquisizione e analisi delle immagini; utilizzato nelle sezioni 3 e 4
OPTI-MEMGibo-Life sciences31985-070Terreno sierico ridotto per la trasfezione cellulare; utilizzato nella fase 1.1.3
Penicillina/StreptomicinaGibo-Life sciences15140-122antibiotico utilizzato in colture cellulari
salina tamponata con fosfato medio (PBS)Caisson labsPBP06-10X1LTsoluzione salina sterile per l'uso con colture cellulari
pMD2.GAddgene12259Costrutto di espressione dell'involucro VSV-G lentivirale; utilizzato nel passaggio 1.1.4
PolybreneSigma-AldrichH9268Polimero cationico utilizzato per migliorare l'efficienza dell'infezione virale; utilizzato nel passaggio 1.1.10
psPAXAddgene12260plasmide di confezionamento lentivirale di 2a generazione; utilizzato nel passaggio 1.1.4
PuromicinaInvitrogenant-pr-1Agente di selezione antibiotica; utilizzato per selezionare per RFP-H2B che esprimono cellule RFP-H2B
RFP- Istone 2B (H2B)Addgenevari numeriVettore di espressione per l'istone 2B marcato con proteina fluorescente rossa; per l'uso nella visualizzazione della cromatina nell'imaging di cellule vive: disponibile in commercio tramite Addgene e altri fornitori
RNAi MaxInvitrogen13778-150Reagente di trasfezione a base di lipidi per la trasfezione di cellule RPE-1 costrutti siRNA
ATCCCRL-4000Linea cellulare epiteliale pigmentata retinica umana
Piatto di coltura tissutale 100x20mmCorning 353003per l'uso nella coltura di cellule aderenti
Zyla sCMOS camera Fotocamera Nikoncollegata al micrscopio, utilizzata per catturare immagini di cellule
NIS Elements HC  soluzione

Riferimenti

  1. Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
  2. Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491(2016).
  3. Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
  4. Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
  5. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
  6. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
  7. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
  8. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
  9. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411(2012).
  10. Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
  11. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
  12. Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
  13. Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
  14. Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
  15. Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
  16. Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
  17. Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131(2011).
  18. Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
  19. Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
  20. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  21. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564(2009).
  22. Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
  23. Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
  24. Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
  25. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).

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