Qui presentiamo un protocollo per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica. La nostra applicazione di imaging time-lapse consente all'utente di identificare le cellule in varie fasi della mitosi, monitorare e identificare i difetti mitotici e analizzare la dinamica del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo l'esposizione a farmaci anti-mitotici.
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Articolo metodologico
Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'imaging time-lapse delle cellule vive è uno strumento importante nella biologia cellulare che fornisce informazioni sui processi cellulari che potrebbero altrimenti essere trascurati, fraintesi o mal interpretati dall'analisi a cellule fisse. Sebbene l'imaging e l'analisi delle celle fisse siano robuste e sufficienti per osservare lo stato costante cellulare, può essere limitata nella definizione di un ordine temporale di eventi a livello cellulare ed è mal equipaggiata per valutare la natura transitoria dei processi dinamici, tra cui progressione mitotica. Al contrario, l'imaging delle cellule vive è uno strumento eloquente che può essere utilizzato per osservare i processi cellulari a livello di singola cellula nel tempo e ha la capacità di catturare le dinamiche dei processi che altrimenti sarebbero scarsamente rappresentati nell'imaging di cellule fisse. Qui descriviamo un approccio per generare cellule che trasportano marcatori fluorescenti etichettati di cromatina e microtubuli e il loro uso in approcci di imaging a cellule vive per monitorare l'allineamento del cromosoma metafase e l'uscita mitotica. Descriviamo tecniche basate sull'imaging per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica, compresa l'identificazione delle cellule in varie fasi della mitosi, l'identificazione e il monitoraggio dei difetti mitotici, nonché l'analisi delle dinamiche del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo il trattamento con inibitori mitotici.
Introduzione
L'analisi basata sull'immagine delle cellule fisse è comunemente usata per valutare i cambiamenti del livello della popolazione cellulare in risposta a varie perturbazioni. In combinazione con la sincronizzazione delle celle, seguita dalla raccolta e dall'imaging di punti temporali seriali, tali approcci possono essere utilizzati per suggerire una sequenza cellulare di eventi. Tuttavia, l'imaging a cellule fisse è limitato in quanto le relazioni temporali sono implicite per una popolazione e non dimostrate a livello di singole cellule. In questo modo, mentre l'imaging e l'analisi delle cellule fisse sono sufficienti per osservare fenotipi robusti e cambiamenti di stat....
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Protocollo
1. Generazione di cellule hTERT-RPE-1 che esprimono stabilmente RFP-Histone 2B (RFP-H2B) e z-tubulin-EGFP (tub-EGFP)
NOTA: Tutti i passi seguono tecniche asettiche e si svolgono in un armadio di sicurezza di livello di biosicurezza II (BSL2).
- Generare retrovirus che trasporta i geni di interesse (z-tubulina-EGFP e RFP-H2B) con la trasfezione di 293T cellule con le plasmiche lentivirali appropriate secondo le istruzioni del produttore del sistema di erogazione della trasfezione a base di lipidi.
- Giorno 1: Utilizzare una pastortta di vetro usa e getta per aspirare il mezzo di coltura cellulare da una piastra di cellule 293T ....
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Risultati
Valutazione della progressione mitotica in presenza di perturbazioni del mandrino
La regolazione della messa a fuoco del mandrino è un passo essenziale nella corretta formazione del mandrino bipolare. Interruzione in questo processo attraverso l'esaurimento delle proteine, inibizione dei farmaci, o alterazioni nel numero centroso centroso struttura del mandrino corrotto e ritardare o arrestare la progressione mitotica10,
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Discussione
La risoluzione temporale fornita dall'imaging time-lapse consente la visualizzazione e la valutazione degli eventi cellulari sequenziali all'interno di singole cellule. Gli approcci che fanno uso della sincronizzazione cellulare seguita dalla raccolta e dalla fissazione delle cellule nei punti temporali sequenziali sono limitati in quanto i confronti vengono infine effettuati tra popolazioni di cellule. Nei contesti in cui la risposta cellulare alle perturbazioni può essere non uniforme, o in cui il processo visualizzato.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
DLM è supportato da una NSF GRFP. ALM è supportato dal finanziamento dello Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina | Gibo-Life sciences | 25-510 | Una serina proteasi utilizzata per rilasciare cellule aderenti da piastre di coltura |
| Provette da centrifuga da 15 ml | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Obiettivo Fluor. | Nikon | Per l'uso nell'imaging di cellule vive per visualizzare sia il campo chiaro che la fluorescenza | |
| Cellule 293T ATCC | CRL-3216 | Per l'uso nella trasfezione retrovirale; utilizzato nella fase 1.1 | |
| a-tubulina-EGFP | Addgene | vari numeri | Vettore di espressione per l'alfa tubulina fusa con un tag proteico fluorescente verde; per l'uso nella visualizzazione della tubulina nell'imaging di cellule vive: disponibile in commercio tramite addgene e altri fornitori |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Inibitore di piccole molecole della chinasi mitotica Aurora A. La concentrazione stock viene preparata a 10mM in DMSO e utilizzata a una concentrazione finale di 100nM. |
| Blasticidina | Invitrogen | A11139-03 | Agente di selezione antibiotica; utilizzato per selezionare le cellule che esprimono EGFP |
| C02 | Airgas | Per l'uso in colture cellulari e imaging di cellule vive | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Set di filtri a banda singola; lunghezza d'onda di eccitazione 545 nm con larghezza di banda di 25 nm ed emissione a lunghezza d'onda di 605 nm con larghezza di banda di 70 nm; per la visualizzazione di H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Set di filtri a banda singola; lunghezza d'onda di eccitazione 470 nm con larghezza di banda di 40 nm ed emissione a lunghezza d'onda di 525 nm con larghezza di banda di 50 nm; per la visualizzazione di |
| pipette Pastuer in vetro monouso GFP-tubulina, sterilizzate | Fisher Scientific | 13-678-6A | Per l'uso in celle di aspirazione |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Terreno di coltura cellulare per la crescita di cellule RPE-1 e 293T |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Integratore di terreno di coltura cellulare |
| Lipofectamine 3000 e p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Reagente di trasfezione a base di lipidi per la trasfezione di plasmidi; utilizzato in 1.1.4 |
| Piastre per colture tissutali multipozzetto | Corning | vari | per l'uso in colture cellulari, trasfezione/infezione e imaging di cellule vive |
| Microscopio Nikon Ti-E | Microscopio | a epifluorescenza invertito Nikon per l'uso nell'imaging di cellule vive | |
| Nikon | Versione 4.51 | Software di acquisizione e analisi delle immagini; utilizzato nelle sezioni 3 e 4 | |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Terreno sierico ridotto per la trasfezione cellulare; utilizzato nella fase 1.1.3 |
| Penicillina/Streptomicina | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotico utilizzato in colture cellulari |
| salina tamponata con fosfato medio (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | soluzione salina sterile per l'uso con colture cellulari |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Costrutto di espressione dell'involucro VSV-G lentivirale; utilizzato nel passaggio 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Polimero cationico utilizzato per migliorare l'efficienza dell'infezione virale; utilizzato nel passaggio 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | plasmide di confezionamento lentivirale di 2a generazione; utilizzato nel passaggio 1.1.4 |
| Puromicina | Invitrogen | ant-pr-1 | Agente di selezione antibiotica; utilizzato per selezionare per RFP-H2B che esprimono cellule RFP-H2B |
| RFP- Istone 2B (H2B) | Addgene | vari numeri | Vettore di espressione per l'istone 2B marcato con proteina fluorescente rossa; per l'uso nella visualizzazione della cromatina nell'imaging di cellule vive: disponibile in commercio tramite Addgene e altri fornitori |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Reagente di trasfezione a base di lipidi per la trasfezione di cellule RPE-1 costrutti siRNA |
| ATCC | CRL-4000 | Linea cellulare epiteliale pigmentata retinica umana | |
| Piatto di coltura tissutale 100x20mm | Corning | 353003 | per l'uso nella coltura di cellule aderenti |
| Zyla sCMOS camera | Fotocamera Nikon | collegata al micrscopio, utilizzata per catturare immagini di cellule |
Riferimenti
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochor....
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Ristampe e permessi
