I saggi di interazione co-cultura presentati in questo protocollo sono economici, ad alta produttività e semplici. Questi saggi possono essere utilizzati per osservare le interazioni microbiche in co-cultura, identificare i modelli di interazione e caratterizzare il potenziale inibitorio di un ceppo microbico di interesse contro i patogeni umani e ambientali.
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Articolo metodologico
Analisi di cocultura ad alta produttività per l'analisi delle interazioni microbiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio delle interazioni tra microrganismi ha portato a numerose scoperte, da nuovi antimicrobici a intuizioni in ecologia microbica. Molti approcci utilizzati per lo studio delle interazioni microbiche richiedono attrezzature specializzate e sono costosi e dispendiosi in termini di tempo. Questo documento presenta un protocollo per i saggi di interazione con co-cultura che sono economici, scalabili a grandi numeri di campione e facilmente adattabili a numerosi progetti sperimentali. I microrganismi sono coltivati insieme, con ogni pozzo che rappresenta una combinazione a coppie di microrganismi. Un organismo di prova è coltivato su un lato di ogni pozzo e prima incubato nella monocoltura. Successivamente, gli organismi bersaglio vengono contemporaneamente inoculati sul lato opposto di ogni pozzo utilizzando un timbro di inoculazione stampato in 3D. Dopo la co-coltura, i saggi completati sono segnati per fenotipi visivi, come la crescita o l'inibizione. Questi saggi possono essere utilizzati per confermare i fenotipi o identificare modelli tra gli isolati di interesse. Utilizzando questo metodo semplice ed efficace, gli utenti possono analizzare combinazioni di microrganismi in modo rapido ed efficiente. Questo approccio di cocoltura è applicabile alla scoperta di antibiotici e alla ricerca sul microbioma basata sulla cultura ed è già stato applicato con successo a entrambe le applicazioni.
Introduzione
In natura, i microrganismi raramente esistono in isolamento; di conseguenza, interagiscono costantemente con altri organismi. Pertanto, studiare come i microrganismi interagiscono tra loro è essenziale per comprendere una moltitudine di comportamenti microbici1. Le interazioni microbiche possono essere mutualistiche, commensal o antagoniste. Questi in terazioni possono influenzare non solo i microrganismi stessi, ma anche gli ambienti e gli host che i microrganismi colonizzano1,2.
Molti scienziati studiano le interazioni microbiche per identificare nuove molecole antimicrobiche. Una delle prime molecole antimicrobiche clinicamente importanti è stata trovata attraverso lo studio delle interazioni microbiche. Sir Alexander Fleming osservato un contaminante Penicillium spp. isolare che ha inibito la crescita di un ceppo Staphylococcus, che ha portato alla scoperta della penicillina antibiotica comunemente usato3 . La caratterizzazione dei meccanismi utilizzati dai microrganismi per antagonizzare i loro concorrenti rimane una risorsa fruttuosa per la scoperta di molecole antimicrobiche. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato che Streptomyces sp. ceppo Mg1 produce linearizzate antibiotiche, che hanno un'attività littica e degradante contro Bacillus subtilis4.
Inoltre, un peptide non-ribosomially sintetizzato chiamato lugdunin è stato recentemente scoperto dopo l'osservazione che nasale commensal Staphylococcus lugdunensis inibisce Staphylococcus aureus5. Gli studi hanno anche dimostrato che le interazioni mutualistiche tra microrganismi sono altrettanto potenti delle interazioni antagoniste per la scoperta di molecole antimicrobiche. Ad esempio, molte formiche che coltivano funghi nella tribù Attini porto batteri simbiotici chiamati Pseudonocardia sul loro esoscheletro che produce molecole antifungini per inibire un patogeno obbligatorio della loro coltura fungina6. Poiché lo studio delle interazioni microbiche è stato utile per scoprire molecole di antimicrobici, l'uso di schermi ad alta velocità potrebbe portare alla scoperta di nuove molecole antimicrobiche.
Per quanto riguarda i costi e la facilità di prestazione, le metodologie utilizzate per studiare le interazioni microbiche vanno da semplici a complesse. Per esempio, un saggio agar plug è un metodo economico e semplice che può essere utilizzato per studiare l'antagonismo tra più microrganismi7. Tuttavia, un saggio agar plug non è una procedura efficiente e può essere laborioso per molte combinazioni a coppie. Per valutare gli effetti dei prodotti prodotti microbicamente sugli isolati di destinazione di interesse in modo ad alta produttività, molti laboratori utilizzano analisi di diffusione del disco8. Questi saggi sono facili e poco costosi e possono essere scalabili a un numero più elevato di campioni7. Tuttavia, questo test richiede la generazione di estratti microbici e può produrre risultati fuorvianti per alcune combinazioni di organismi bersaglio e antibiotici, come Salmonella e cefalosporine9.
Gli approcci precedenti si basano su componenti isolati per suscitare una risposta in un organismo bersaglio, invece di consentire ai microrganismi di interagire tra loro. Questo è interessante perché le interazioni tra microbi possono provocare la produzione di molecole antimicrobiche "criptiche" che non sono prodotte in monocoltura. Per esempio, è stato recentemente dimostrato che la chiavetina antimicrobica è prodotta solo da un Micromonospora sp. quando co-collezionato con un Rhodococcus sp. che è isolato dallo stesso microbioma di spugna10. Metodologie di interazione più complesse aggirano questo potenziale ostacolo alla monocultura. Ad esempio, l'iChip è utile per isolare batteri rari e difficili da coltivare da campioni ambientali e consente l'osservazione delle interazioni microbiche attraverso la crescita in situ11. Per studiare le interazioni in dettaglio, è possibile utilizzare la spettrometria di massa di massa di massa di imaging laser assistita a matrice (MALDI-TOF-IMS). Questo approccio fornisce informazioni dettagliate sulla composizione e la distribuzione di piccole molecole e peptidi prodotti da colonie microbiche interagenti ad alta risoluzione spaziale. MALDI-TOF-IMS è stato utilizzato anche in molteplici studi sulle interazioni batteriche per caratterizzare i meccanismi della concorrenza12,13,14,15. Tuttavia, MALDI-TOF-IMS spesso richiede una laboriosa preparazione del campione, competenze specializzate per il funzionamento delle apparecchiature e costosi spettrometri di massa. Per questi motivi, è una tecnica difficile da utilizzare per gli studi ad alta velocità effettiva. Pertanto, sarebbe utile un saggio di cocultura semplice, scalabile e ad alto throughput per le interazioni microbiche che supera molte limitazioni degli approcci di cui sopra.
In questo caso, viene presentato un protocollo per la cocultura microbica ad alta produttività. Questo saggio è semplice e facilmente incorporato negli studi preesistenti sulle interazioni microbiche. A differenza di molti metodi comunemente usati per lo studio delle interazioni microbiche, il nostro metodo è semplice, poco costoso ed è suscettibile di studiare un gran numero di interazioni. Questi saggi non sono solo facili da eseguire, ma i materiali sono ampiamente disponibili dalla maggior parte dei fornitori di laboratorio o delle risorse pubbliche (ad esempio, biblioteche e spazi per maker). Di conseguenza, questo saggio è vantaggioso come prima linea di indagine per identificare e analizzare modelli interessanti tra molte combinazioni a coppie di microrganismi, che possono essere particolarmente utili per lo studio dell'ecologia microbica.
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Protocollo
Il consenso informato è stato ottenuto dai genitori del donatore, e il Comitato Human Subjects presso l'Università del Wisconsin-Madison ha approvato lo studio (numero di approvazione dell'Institutional Review Board [IRB] H-2013-1044).
1. Cultura di esempio
NOT: Questa procedura viene utilizzata qui per lo studio delle interazioni tra batteri isolati dalla cavità nasale umana. In linea di principio, i seguenti metodi sono applicabili a qualsiasi condizione di coltura. Il brodo di infusione di cuore cerebrale (BHI) viene utilizzato per la propagazione generale dei batteri nasali. Tutte le piastre sono solidificate utilizzando 1,5% agar. Per questo studio, i campioni vengono prelevati dalla soluzione salina vampata di fusione nel naso di un donatore (lavaggio nasale), trasferiti in tubi di microcentrifuga e congelati a -80 gradi centigradi.
- Utilizzare tecniche di coltura standard per lastrare 100 l di ciascuno dei campioni di lavaggio scongelati su piastre BHI.
- Incubare le piastre a 37 gradi centigradi per 1 settimana.
- Dopo l'incubazione, seleziona le colonie di 2 colonie per piastra distinta e passaggia gli isolati aerobicamente sulle piastre BHI sfilando una colonia dalla piastra iniziale su una nuova piastra BHI e incubano la piastra a 37 gradi centigradi. Ripetere fino a quando le colture batteriche sono pure.
NOT: Gli isolati batterici possono essere identificati attraverso la morfologia della colonia, la colorazione del grammo, il sequenziamento genico di rRNA 16S o un altro metodo. Tuttavia, conoscere l'identità dell'isolato non è necessario per continuare il protocollo. - Criopreserve tutti i batteri isolaa a -80 gradi centigradi dopo aver combinato 1 mL di 50% glicerolo con 1 mL di coltura batterica durante la notte (vedi sezione 3) in criotubi.
2. Francobolli di stampa 3D
NOT: Il policarbonato è stato selezionato come materiale di stampaggio a causa dell'elevata temperatura di transizione del vetro (147 gradi centigradi) che supera le temperature standard dell'autoclave (121 gradi centigradi), il che riduce al minimo il rischio di deformazione dopo ripetuti utilizzi.
- Caricare la stampante 3D con filamento in policarbonato.
- Applicare la colla bianca della scuola (acetato di polivinil) al letto di stampa per facilitare l'adesione e ridurre al minimo la deformazione del timbro di inoculazione durante la stampa.
- Caricare il file . File di modello STL (Supplementary Data File) per il timbro di inoculazione (Figura 1) nel software della stampante 3D.
- Stampare il timbro di inoculazione a una temperatura dell'ugello di 290 c, a 60 gradi centigradi e a un'altezza dello strato di 0,38 mm.
- Avvolgere il timbro nel foglio di alluminio e sterilizzare autoclaving per 1,5 h su un ciclo di gravità con 15 min di essiccazione.
NOT: Anche se il policarbonato è igroscopico, i francobolli mantengono solo circa lo 0,5% di peso dell'acqua dopo l'autoclaving.
3. Preparazione delle culture notturne
- Utilizzando una pipetta sierologica, pipetta 3 mL di brodo BHI sterile in tubi di coltura 14 mL.
- Usando un ciclo inoculante sterile di 1 LL, inoculare una colonia batterica nel brodo. Swirl l'anello per garantire che il grumo si disperda nel brodo. Vortice i tubi di coltura brevemente prima dell'incubazione.
- Incubare i tubi di coltura a 37 gradi durante la notte su uno shaker a 250 giri/min.
- Vortice per rompere i grumi di cellule una volta che le colture batteriche raggiungono sufficiente torbidità (OD600 x 1).
4. Preparazione delle piastre di bioasta
NOT: Le piastre di bioasche vengono preparate in una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità.
- Preparare i supporti BHI con l'1,5% di agar e sterilizzare autoclaving secondo le istruzioni del produttore.
- Dopo l'autoclaving, raffreddare il supporto BHI a 55 gradi centigradi in un bagno d'acqua a temperatura controllata.
- Utilizzando una pipetta sierologica, pipetta 3 mL di supporti BHI fusi in ciascuno dei 12 pozzi su un pozzo 12. Assicurarsi che i pozzi siano il più esatti e anche possibile. Un litro di media produrrà piastre di bioforsay da 27 dollari.
- Lasciare che l'agar si metta durante la notte.
5. Inoculazione del bioassay Piastre con l'organismo di prova
NOT: Un organismo di prova si riferisce all'organismo per il quale viene determinata la produzione di attività inibitoria (ad esempio, produzione di antibiotici) utilizzando il saggio di interazione co-culturale. Per questo esperimento, gli organismi di prova sono Actinobacteria isolati da campioni di lavanda nasali.
- Inoculare l'organismo di prova su una piastra di bioanalisi inserendo un anello sterile di 10 -L inoculante nella coltura durante la notte e strizzando una goccia di coltura sopra il terzo sinistro di un pozzo di piastra.
NOT: Si raccomanda di strisciare solo un terzo del pozzo, come la crescita eccessiva del pozzo vieta l'inoculazione successiva degli organismi bersaglio. - Ripetere fino a quando tutti i 12 pozze sulla piastra sono stati inoculati con l'organismo di prova.
- Incubare piastre a testa in giù alla temperatura appropriata per 7 giorni. A temperature più elevate o in climi più secchi, conservare le piastre in un contenitore umido per evitare che le piastre si prosciughino.
6. Preparazione degli organismi bersaglio
NOT: Un organismo bersaglio si riferisce all'organismo il cui stato di inibizione è determinato utilizzando l'effetto di interazione co-culturale. Per questo esperimento, gli organismi bersaglio sono lo Staphylococcus spp. isolato dai campioni di lavaggi nasali.
- Dopo aver incubato le lastre di bio-test per 6 giorni, preparare le colture notturne degli organismi bersaglio specificati, come fatto sopra (vedi sezione 3).
7. Inoculazione dell'organismo bersaglio
NOT: Dopo l'incubazione durante la notte, assicurarsi che le colture siano torbidi (OD600 x 1). Alcune colture batteriche possono flocculate nella parte inferiore del tubo di coltura. Vortice i tubi di coltura per disperdere i grumi e valutare la torbidità di coltura.
- Preparare la piastra bersaglio riempiendo ogni pozzetto di un pozzo vuoto di 12 pozzetto con 1,8 mL di BHI e 200 l della coltura di destinazione durante la notte.
- Srotolare e posizionare un timbro di inoculazione sterile nella piastra di destinazione. Ruotare delicatamente le culture intorno nei pozzi, facendo attenzione a garantire che le culture non attraversino i pozzi vicini.
- Sollevare il timbro di inoculazione e assicurarsi che ci sia una goccia di cultura bersaglio diluita su ogni punta del francobollo.
-
Preparare una piastra di controllo monocoltura ponendo il timbro di inoculazione su una piastra di bio-modello non inoculato e scuotere delicatamente il timbro in modo che una cultura goccia inocula ogni pozzo. Una volta rimosso il timbro di inoculazione, una goccia di coltura dovrebbe essere visibile nei pozze della piastra di bioassaggio.
- Se alcuni pozzi non vengono inoculati con il timbro di inoculazione a causa di livelli irregolari di media, spot 3 - L di cultura diluita durante la notte sul lato destro dei pozzi utilizzando una pipetta.
- Inoculare le piastre di bioassay come fatto sopra (vedere il passo 7.4.1), ma allineare il timbro in modo che le punte si allineino con il lato destro del pozzo 12. Assicurarsi che il timbro non contatti la colonia batterica esistente durante l'inoculazione dei pozzi.
- Rimuovere con attenzione il timbro e riposizionarlo nella piastra di destinazione.
- Ripetere l'inoculazione per ogni piastra di bioassaggio fino a quando tutte le piastre sono inoculate.
- Incubare piaspe di bioassay a testa in giù alla temperatura appropriata per 7 giorni.
8. Punteggio
-
Dopo aver co-cullato il test e il target di organismi per 1 settimana, segnare le interazioni in base alla seguente valutazione visiva:
- Punteggiare i pozzi con crescita dell'organismo target che mostra una crescita che è indistinguibile dal controllo della monocoltura come "0" (nessuna inibizione) (Figura 2A,B).
- Punteggiare i pozzi con organismo bersaglio che mostra una crescita diminuita rispetto al controllo come "1" (inibizione debole) (Figura 2C).
- Segnare i pozzi in cui l'organismo bersaglio non è cresciuto come "2" (forte inibizione) (Figura 2D).
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Risultati
I saggi di interazione co-culturale possono essere utilizzati per comprendere le interazioni microbiche, identificare modelli di interesse e scoprire isolati microbici con attività intriganti. In questi saggi, un organismo di prova è monocolto su un lato di una piastra di agar 12 pozzo e incubato per 7 giorni. Successivamente, un organismo bersaglio viene avvistato accanto all'organismo di prova e i due microbi sono stati co-coltivati per 7 giorni prima di segnare per il fenotipo di cresc...
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Discussione
Gli antibiotici e altri metaboliti secondari che mediano le interazioni microbiche sono utili per una moltitudine di applicazioni, tra cui la scoperta di farmaci. Qui viene presentato un protocollo per i saggi di co-cultura per valutare un gran numero di interazioni microbiche. Questi saggi di interazione co-cultura sono un mezzo semplice, conveniente, scalabile e ad alta produttività per studiare molte combinazioni a coppie di microrganismi in tandem. Gli organismi bersaglio sono avvistati accanto a organismi di prova i...
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Daniel May, Marc Chevrette e Don Hoang per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro, compresi gli sforzi di Cameron R. Currie, è stato sostenuto dall'Università del Wisconsin-Madison, Ufficio del Vice Cancelliere per la Ricerca e l'Educazione AlPrimo Laurea con il finanziamento della Wisconsin Alumni Research Foundation, finanziamenti forniti anche dal National Institutes of Health Centers for Excellence for Translational Research (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck è stato sostenuto da una sovvenzione di formazione della National Library of Medicine per il Computations and Informatics in Biology and Medicine Training Program (NLM 5T15LM007359). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'interpretazione dei dati o nella decisione di presentare il lavoro per la pubblicazione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 μ L anse monouso in polistirene per inoculazione, blu | VWR | 12000-806 | |
| 10 μ L anse monouso per l'inoculazione in polistirene, gialla | VWR | 12000-810 | |
| Piastra per coltura cellulare a 12 pozzetti, sterile con coperchio | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL in polistirene provetta a fondo tondo, 17 x 100 mm 2style, apirogene, sterili | Falcon | 352057 | |
| 2.0 con tappo a vite autoportante, sterili | USA scientific | 1420-9710 | |
| Pipetta sierologica da 25 ml | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, batteriologico | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Brodo | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Filamento in policarbonato, bianco, diametro 3 mm | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| Colla scolastica | Elmer's | EPIE304 | |
| Stampante 3D Taz 6 | Lulzbot |
Riferimenti
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234(2016).
- Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).
- Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226(1929).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11 (12), e1005722(2015).
- Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).
- Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, Pennsylvania. (2012).
- Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).
- Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
- Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).
- Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).
- Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).
- Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).
- Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10 (1), 516(2019).
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