Articolo metodologico

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/60288

⸱

8 ottobre 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Neurobiology of Behavior, University of Göttingen

In questo articolo

Sommario

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Qui presentiamo un protocollo con il quale il calcio pre e/o postsinaptico può essere visualizzato nel contesto dell'apprendimento e della memoria della Drosophila. L'imaging di calcio in vivo che utilizza sensori di calcio localizzati sinapricamente viene combinato con un classico paradigma di condizionamento olfattivo in modo tale che la plasticità sinaptica alla base di questo tipo di apprendimento associativo può essere determinata.

Abstract

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Decenni di ricerca in molti organismi modello hanno portato all'attuale concetto di plasticità sinaptica alla base dell'apprendimento e della formazione della memoria. Cambiamenti indotti dall'apprendimento nella trasmissione sinaptica sono spesso distribuiti tra molti neuroni e livelli di elaborazione nel cervello. Pertanto, sono necessari metodi per visualizzare la plasticità sinaptica dipendente dall'apprendimento tra i neuroni. Il filo della frutta Drosophila melanogaster rappresenta un organismo modello particolarmente favorevole per studiare i circuiti neuronali alla base dell'apprendimento. Il protocollo qui presentato dimostra un modo in cui i processi alla base della formazione di memorie olfattive associative, cioè l'attività sinaptica e i loro cambiamenti, possono essere monitorati in vivo. Utilizzando l'ampia gamma di strumenti genetici disponibili in Drosophila, è possibile esprimere specificamente indicatori di calcio geneticamente codificati in popolazioni cellulari determinate e anche singole cellule. Fissando una mosca in posizione e aprendo la capsula della testa, è possibile visualizzare la dinamica del calcio in queste cellule mentre fornisce stimoli olfattivi. Inoltre, dimostriamo un set-up in cui la mosca può essere sottoposta, contemporaneamente, a scosse elettriche al corpo. Ciò fornisce un sistema in cui le mosche possono sottoporsi a condizionamento olfattivo classico - in base al quale si impara un odore precedentemente ingenuo ad essere associato alla punizione degli scosse elettriche - allo stesso tempo alla rappresentazione di questo odore (e di altri odori non addestrati) è osservata nel cervello attraverso la microscopia a due fotoni. Il nostro laboratorio ha precedentemente riportato la generazione di sensori di calcio localizzati sinaplacamente, che consentono di limitare i segnali fluorescenti di calcio a compartimenti pre o post-sinaptici. La microscopia a due fotoni fornisce un modo per risolvere spazialmente le strutture fini. Esemplificamo questo concentrandoci sui neuroni che integrano le informazioni dal corpo del fungo, un centro di ordine superiore del cervello dell'insetto. Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo per esaminare le connessioni sinaptiche tra neuroni la cui attività è modulata come risultato dell'apprendimento olfattivo.

Introduzione

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Decifrare dove e come le informazioni vengono acquisite nel cervello attraverso l'apprendimento e successivamente memorizzate come memoria costituisce uno dei compiti più impegnativi nelle neuroscienze1. La ricerca neuroscientifica ha portato al concetto di un cambiamento nella trasmissione sinaptica come substrato neuronale che sta alla base dell'apprendimento e della formazione della memoria2,3. Si ipotizza che, durante l'apprendimento, le connessioni sinaptiche tra insiemi neuronali attivi durante la percezione di uno stimolo si modificano in modo tale che il loro modello di attività combinata può essere recuperato durante il richiamo della memoria, istruendo così azione comportamentale futura4. Queste "cellule engramma" e le loro sinapsi sono spesso distribuite tra le regioni del cervello e livelli di elaborazione, il che rende difficile assegnare i cambiamenti osservati nella trasmissione sinaptica all'apprendimento di un compito o di uno stimolo. Per localizzare e visualizzare i cambiamenti sinaptici che sono causalmente legati a una specifica attività di apprendimento è necessario un sistema modello appropriato che permetta di confinare con precisione quelle sinapsi.

Per un tale sforzo, La Drosophila melanogaster è particolarmente adatta perché combina relativa semplicità del cervello, ricchezza comportamentale e accessibilità sperimentale. Tra gli organismi modello ben consolidati, la Drosophila si trova tra il nematode C. elegans e mammiferi geneticamente trattabili come i topi in termini di complessità neuronale. Il numero stereotipato di neuroni (300 dollari) e repertorio comportamentale limitato è osservato in C. elegans. I mammiferi, d'altra parte, hanno milioni di neuroni e una complessità comportamentale impressionante. Il cervello della mosca della frutta è, con i suoi 100.000 dollari, neuroni significativamente più piccoli del cervello della maggior parte dei vertebrati, e molti dei neuroni sono individualmente identificabili5. Eppure, la Drosophila dimostra un ampio spettro di comportamenti complessi, tra cui la capacità di esibire robusto apprendimento olfattivo associativo e formazione della memoria, descritto per la prima volta oltre 40 anni fa6. Nel corso di questa classica procedura di condizionamento, gruppi di mosche sono soggetti a un odore come stimolo condizionato(CS) mentre ricevono una scossa elettrica punitiva come stimolo incondizionato (US). Un secondo odore (CS-) viene quindi presentato senza alcuna punizione. Di conseguenza, gli animali imparano ad evitare l'odore associato alla punizione, che può essere testato in una successiva situazione di scelta tra i due odori, CSe CS-. Il lavoro sulla sezionata del substrato neuronale alla base di questo comportamento nella Drosophila ha identificato i corpi fungini (MB) come sito primario dell'"engramma"7,8,9,10 e, quindi, il circuito di questa regione del cervello è stato ed è oggetto di intensa ricerca al fine di scoprire la logica con cui un engramma di memoria viene acquisito e memorizzato (recentemente rivisto in11,12).

Il MB di Drosophila è costituito da 2.000 neuroni intrinseci (cellule Kenyon) per emisfero, organizzati in proiezioni assonali parallele13. Gli assoni dei neuroni di proiezione olfattiva sono estesi alla protocerebra laterale e ai calyces MB, il principale sito di input dendritico del MB e ricevono input olfattivo dai lobi delle antenne. Il lungo fascio parallelo di assoni di cellule Kenyon costituisce il peduncolo e i lobi. La maggior parte delle cellule di Kenyon biforcate che formano lobi orizzontali di z/z'-lobi estendendo una garanzia verso la linea mediana del cervello, e i lobi verticali di zz'---lobe estendendo la seconda proiezione collaterale nella direzione dorsale-anteriore. L'altro gruppo di cellule Kenyon forma i lobi orizzontali13 del MB in cui il processo di apprendimento e la successiva formazione di memoria a breve termine potrebbero essere localizzati10. I lobi MB ricevono input afferente e forniscono un output efferente, entrambi in genere limitati a sottoregioni compartitali distinte lungo gli assoni della cella Kenyon14,15,16. In particolare, i neuroni di input dopaminergici MB afferenti hanno dimostrato di mediare gli effetti di valore, ad esempio punitivi, rafforzanti nell'apprendimento olfattivo associativo15,17. Stereotipica e singolarmente identificabili neuroni di uscita MB efferente dai lobi del corpo del fungo integrano le informazioni attraverso un gran numero di cellule Kenyon, prendono di mira diverse aree cerebrali e orso comportamento-istruttivo appetitive o informazioni avverse15 . Questa architettura neuronale ha portato ad un concetto di organizzazione dell'engramma associativo. Gli odori sono codificati relativamente precisamente da insiemi scarsamente attivati di cellule Kenyon. L'attività coincidente di questi insiemi di cellule Kenyon e il rilascio di dopamina - evocati da stimoli punitivi - modula la trasmissione dai presynapsi delle cellule Kenyon su neuroni di uscita MB in modo tale che gli animali eviteranno successivamente questo particolare odore10 ,12. Usiamo questo engramma piuttosto definito e localizzato come un caso paradigmatico per illustrare come questi cambiamenti dipendenti dall'apprendimento nell'attività sinaptica possono essere determinati e monitorati.

Il valore della Drosophila come sistema modello si basa fortemente sulla cassetta degli attrezzi genetica senza pari che permette di esprimere transgeni per identificare, monitorare e controllare singoli neuroni all'interno di circuiti complessi18. L'avvento di tecniche per il monitoraggio dell'attività neuronale - come l'imaging del calcio, discusso qui - ha permesso la determinazione dei modelli di attività neuronale in risposta a uno stimolo specifico. Combinando l'espressione specifica guidata da Gal4 di indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) con la stimolazione olfattiva, si può visualizzare la dinamica di calcio evocata dagli odori dei neuroni di interesse19. In questo protocollo, è dimostrato che accolando ulteriormente questa tecnica con un paradigma di condizionamento classico, è possibile esaminare queste risposte olfattive nel contesto dell'apprendimento. La plasticità indotta dall'apprendimento può essere ulteriormente sezionata utilizzando GECI che non solo sono localizzate in un singolo neurone specifico, ma anche a specifici sottocomparti di un neurone. Pech et al.20 ha stabilito una selezione di strumenti che consentono esattamente questo. Mirando a GCaMP321 al pre o al postynapse - tramite collegamento con il vertebrato Synaptophysin o dHomer, rispettivamente20- la modulazione differenziale di questi siti può essere distinta. Questa localizzazione conferisce, in questo contesto, un vantaggio rispetto alla maggior parte delle GECI che sono onnipresenti presenti in tutto il citosol - ad esempio, GCaMP22, GCaMP321, o GCaMP623 - perché significa che i transitori pre e post-naptici possono essere distinto dall'afflusso complessivo di calcio integrato che si verifica a seguito dell'attivazione del neurone. Questo può fornire indizi circa la posizione e tipi di plasticità che si verificano a seguito di o che causano l'apprendimento e la formazione della memoria. Ad esempio, il protocollo qui fornito mostra il valore di questo strumento per decifrare la modulazione dei neuroni di output MB durante l'apprendimento associativo olfattivo prendendo di mira l'espressione del sensore di calcio per solo il post-sinapsi. Monitorando, all'interno di una singola mosca, l'attività evocata dagli odori prima e dopo il condizionamento olfattivo può essere tracciata tra una risposta all'odore ingenua e una risposta all'odore appresa. Mentre fissate nella stessa camera di imaging, le mosche sono esposte a una selezione di odori. Poi, ricevono un protocollo di condizionamento associativo avverso in cui uno di questi odori è accoppiato con scossa elettrica (diventando il CS)e un altro odore viene presentato senza rinforzo (diventando il CS-). Infine, le mosche sono nuovamente esposte agli stessi odori del primo passo. La dinamica del calcio viene osservata mediante microscopia a due fotoni.

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Protocollo

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1. Moscerini della frutta transgenica, Drosophila melanogaster

  1. Attraversare le mosche vergini femmine e maschili (allevate a 25 gradi centigradi in 60% di umidità relativa su un ciclo di 12 h luce/buio) che trasportano i costrutti Gal4 e UAS desiderati25, rispettivamente, per produrre mosche in cui specifici neuroni di interesse esprimono un sistema geneticamente codificato indicatore di calcio.
  2. Età la progenie femminile della croce di cui sopra fino a quando non sono nella gamma di 3-6 giorni dopo l'eclosione. Le mosche femminili sono preferibili a causa delle loro dimensioni leggermente più grandi.

2. Preparazione della mosca della frutta per l'imaging del calcio in vivo

  1. Selezionare una singola mosca femminile e anantizzare sul ghiaccio per non più di 5 min.
  2. Utilizzando le pinze fini, posizionare la mosca nella camera di imaging (illustrata nella Figura 1c). Assicurarsi che il torace e le gambe siano a contatto con i fili elettrici nella parte inferiore della camera e che la testa sia piatta. Fissare la posizione della mosca utilizzando un adesivo trasparente.
    NOTA: Questo protocollo richiede una camera su misura in cui le mosche sono fisse, con la capsula della testa accessibile per l'apertura, e le mosche in grado di ricevere sia stimolazioni dell'odore alle antenne che scosse elettriche al torace e alle gambe (Figura 1).
  3. Utilizzando una lama chirurgica del bisturi fissata alla maniglia del bisturi (vedi Tabella dei materiali),tagliare una finestra nel nastro intorno alla testa della mosca, lasciando le antenne coperte e solo la parte più anteriore del torace esposto.
  4. Circonda i lati e la parte posteriore della testa con colla di polimerità blu-luce, accuratamente manipolata usando un perno di insetto tenuto da mascelle concave-convesse. Impostare la colla utilizzando una lampada a LED blu a emissione luminosa.
  5. Controllare che la colla sia completamente impostata e cancellare qualsiasi colla residua non indurita dalla superficie dorsale della testa di mosca.
  6. Applicare una goccia della soluzione Ringer24 (vedi Tabella dei materiali)per coprire la cuticola esposta della testa.
  7. Usando un coltello a pugnalata a lama molto fine, tagliare la cuticola. Per la rimozione più efficiente della cuticola, prima tagliare attraverso la parte posteriore della testa utilizzando gli ocelli come punto di partenza. Quindi, tagliare ogni lato, mediale agli occhi, per formare un lembo della cuticola che può essere facilmente strappato con pinze.
  8. Rimuovere qualsiasi cuticola in eccesso che può bloccare la regione di interesse del cervello.
  9. Cancellare con attenzione la superficie dorsale di qualsiasi trachea utilizzando pinze sottili, evitando la rottura del tessuto cerebrale stesso. Rimuovere e aggiornare la soluzione ringer24 (vedere Tabella dei materiali) come richiesto per eliminare l'area dei detriti dei tessuti.
  10. Posizionare l'ago di consegna dell'odore ipodermico in posizione, a circa 1 cm dalla testa della mosca. Assicurarsi che non vi sia nulla che possa ostacolare la consegna degli odori alle antenne.
  11. Al microscopio, collegare la camera di imaging al sistema di erogazione degli odori tramite l'ago di erogazione degli odori ipodermico.
  12. Per consentire alla mosca di riprendersi completamente dall'anestesia e dalla chirurgia e adattarsi al flusso d'aria, implementare un periodo di riposo di 10 min in questa fase.

3. Imaging al calcio in vivo

  1. Utilizzare un microscopio multifotone dotato di laser a infrarossi e un obiettivo di immersione in acqua (vedi Tabella dei materiali),installato su un tavolo isolato di vibrazioni. Per la visualizzazione degli indicatori di calcio basati su GFP, regolare il laser su una lunghezza d'onda di eccitazione di 920 nm e installare un filtro passa-banda GFP.
  2. Utilizzando la manopola grossolana di regolazione z, eseguire la scansione attraverso l'asse z del cervello e individuare la regione del cervello di interesse. Utilizzare la funzione di ritaglio per mettere a fuoco la scansione solo su quest'area per ridurre al minimo il tempo di scansione e per ruotare la vista di scansione in modo che la parte anteriore della testa sia rivolta verso il basso.
  3. Regolare la dimensione del fotogramma a 512 x 512 px, la velocità di scansione a > 4 Hz e la regione di scansione (nella dimensione Y) in modo che i neuroni di interesse siano coperti.

4. Visualizzazione di transitori di calcio evocati dall'odore attraverso condizionamenti olfattivi

  1. Utilizzare un sistema di erogazione degli odori19,26 che può fornire diversi stimoli di odore in modo temporalmente preciso.
    1. Utilizzare un computer aggiuntivo per controllare il dispositivo e per comunicare con il software del microscopio di imaging per coordinare la stimolazione degli odori con l'acquisizione di immagini durante gli esperimenti.
    2. Avviare un pacchetto macro pre-programmato in grado di collegare il software di acquisizione di immagini e il programma di distribuzione degli odori (ad esempio, un pacchetto macro VBA installato nel software di controllo del microscopio, vedere Tabella dei materiali) che risponde a un ingresso esterno dall'avvio di un protocollo di consegna degli odori in un programma separato).
  2. Iniziare la misurazione monitorando i transitori di calcio "pre-allenamento"/ingenuo con l'odore evocato con odore a una risoluzione di 512 x 512 px e una frame rate di 4 Hz. Fornire uno stimolo di odore di 2,5 s affiancato da un'acquisizione di immagini aggiuntive per l'insorgenza precedente di 6,25 s (per stabilire un 0 valore di base) e 12,5 s dopo l'offset dell'odore. Ripetere l'operazione con un secondo odorante e poi con un terzo odorante.
  3. Continuare 3 min dopo questa misurazione con il condizionamento classico ("allenamento") la mosca.
    1. Selezionare uno degli odori presentati nella fase di "pre-allenamento" per diventare l'odore DI CS- e un altro per diventare l'odore CS-. Presentare l'odore CSutilizzando il sistema di fornitura degli odori controllato al computer per 60 s insieme a dodici scosse elettriche da 90 V.
    2. Dopo una pausa di 60 s, presentare l'odore CS- da solo per 60 s. Utilizzare come odori 4-metilcyclohexanol e 3-octanol. Non presentare il terzo odorante (ad esempio, 1-octen-3-ol) durante questo allenamento in quanto viene utilizzato come controllo solo prima (passaggio 4.2.) e dopo (passaggio 4.4) la fase di allenamento.
  4. Misurare nuovamente i transitori di calcio evocati dall'odore "post-allenamento" ripetendo il protocollo di stimolazione dell'odore "pre-allenamento" (passaggio 4.2.) 3 min dopo aver terminato la fase di allenamento (passaggio 4.3).
    NOTA: La tempistica di questo passaggio dovrebbe riflettere il tempo di interesse dopo la formazione della memoria (ad esempio, eseguire questo passaggio 3-4 min dopo la fase di condizionamento per studiare la memoria a breve termine). Tipicamente, le mosche possono sopravvivere per diverse ore in questa preparazione.
  5. Salvare i file di imaging in un formato appropriato (ad esempio, Tiff) per un'successiva analisi delle immagini.

5. Analisi delle immagini

  1. Per analizzare le immagini, aprire i file Tiff (o simili) nel software di analisi delle immagini come Fiji27.
  2. Allineare le pile utilizzando un algoritmo di correzione del movimento per garantire un movimento minimo nelle direzioni X e Y. Eliminare tutte le registrazioni che mostrano un forte movimento nell'asse .
  3. Selezionare lo strumento del software utilizzato per contrassegnare una regione di interesse (ROI) intorno all'area da esaminare. Questo dovrebbe essere il più preciso possibile per limitare l'influenza della fluorescenza di fondo.
  4. Utilizzare il rispettivo strumento del software per estrarre i dati di intensità di fluorescenza temporale come file di dati dal ROI selezionato, in modo che venga generato un valore per ogni fotogramma della registrazione.
  5. Aprire i dati utilizzando un programma di analisi dei dati per calcolare i valori di F/F0 per ogni traccia di odore. F0 - fluorescenza media nei 2 s prima dell'insorgenza dell'odore. -F- la differenza tra la fluorescenza grezza in un dato fotogramma e F0. Da questi valori, calcolare un valore F/F0 per ogni fotogramma che può essere tracciato rispetto al tempo per riflettere la fluorescenza relativa durante tutto il periodo di stimolo dell'odore.

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Risultati

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Un esempio di immagini acquisite con il protocollo precedente può essere visto in Figura 2. d Homer-GCaMP3 è espresso in un neurone di uscita MB i cui dendriti innervano il compartimento 1 del lobo MB (il neurone è chiamato MVP228,29) ed è geneticamente mirato utilizzando la linea split-Gal4 MB112C16. Inoltre, è dimostrata la differenza nella localizzazione subcellular...

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Discussione

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La dissezione dei circuiti neurali alla base dell'apprendimento e della memoria è un obiettivo importante nel campo delle neuroscienze. L'accessibilità genetica della Drosophila e l'ampiezza e la facilità dei test comportamentali lo rendono uno strumento ideale per studiare tali fenomeni. Qui, viene presentato un metodo con cui è possibile visualizzare, all'interno di singole mosche, la modulazione che si verifica a livello subcellulare a causa del condizionamento olfattivo. Effettuando sia la visualizzazione pr...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio tedesco della ricerca attraverso il Centro di ricerca collaborativa SFB 889 "Meccanismi di elaborazione sensoriale" e l'unità di ricerca PER 2705 "Dissezione di un circuito cerebrale: struttura, plasticità e funzione comportamentale del Corpo del fungo di Drosophila".

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-Octen-3-olSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAO5284Chimico usato come odorante
3-OctanolSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA218405Chimico usato come odorante
4-MethylcyclohexanolSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA153095Chimico usato come odorante
Filtro passa-banda per EGFP (525/50 nm)Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Nastro adesivo trasparenteTesa SE, Norderstedt, GermaniaNastro adesivo trasparente standard
Ganasce concave-convesseFine Science Tools, North Vancouver, Canada10053-09Portalama con ganasce concave-convesse Pinze
fini FineScience Tools, North Vancouver, Canada11412-11Pinze con punta 0,1 x 0,06 mm
AgoipodermicoSterican - B. Braun, Melsungenk, Germania46651201,20x40 mm
Perni minuzia per insettiFine Science Tools, North Vancouver, Canada26002-10Diametro 0,1 mm, punta 0,0125 mm
KentoflowKent Express Dental Supplies, Gillingham, Regno Unito953683Colla fotopolimerizzabile blu
Vetrino per microscopioCarl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germania0656.1Obiettivo standard vetrino 76 x 26 mm
Olio mineraleSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAM8410Utilizzato come diluente per odorizzanti
Laser Ti-Sapphire mode-locked Chameleon Vision 2Coherent Inc., Santa Clara, CA, USALaser a femtosecondi a infrarossi sintonizzabile
Microscopio multifotone LSM 7MP dotato di rivelatori BiGCarl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, GermaniaMicroscopio multifotone, più aziende forniscono dispositivi simili.
Obiettivo ad immersione in acqua Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0)Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germania421452-9900-000Obiettivo W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Soluzione di RingerKCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM saccarosio, pH = 7,4
Coltello da taglioSharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA72-15515,0 mm Profondità della lama diritta limitata
Lama del bisturi chirurgicoSwann-Morton, Sheffield, Regno Unito0303N. prodotto 11
Manico del bisturi chirurgicoSwann-Morton, Sheffield, Regno Unito0907N. prodotto 7S/S
Software Visual Basics of Applicatons (VBA) per ricevere un trigger
dal dispositivo di erogazione degli odori e dal dispositivo di applicazione della scossa elettrica
(alimentatore) per interagire con il software ZEN
di Zeiss che controlla il microscopio.		Scritto su misura e disponibile su richiestan.a.n.a.
n.a.n.a.5mM

Riferimenti

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