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Articolo metodologico

Approccio sperimentale per esaminare la segnalazione di Leptina nei corpi carotidi e i suoi effetti sul controllo della respirazione

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DOI:

10.3791/60298

⸱

25 ottobre 2019

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Johns Hopkins University, 2Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Hospital Universitario Virgen del Rocío/Universidad de Sevilla

In questo articolo

Sommario

Il nostro studio si concentra sugli effetti della segnalazione della leptina nel corpo carotide (CB) sulla risposta di ventilazione ipossica (HVR). Abbiamo effettuato esperimenti di "perdita di funzione" che misurano l'effetto della leptina sull'HVR dopo la denervazione della CB e gli esperimenti di "guadagno di funzione" che misurano l'HVR dopo la sovraespressione del recettore della leptina nel CB.

Abstract

Un ormone prodotto da adipociti leptina è un potente stimolante respiratorio, che può svolgere un ruolo importante nella difesa della funzione respiratoria nell'obesità. I corpi carotidi (CB), un organo chiave di sensibilità ipossica periferica, esprimono la lunga isoformazione funzionale del recettore leptina (LepRb), ma il ruolo della segnalazione della leptina nel controllo della respirazione non è stato completamente chiarito. Abbiamo esaminato la risposta di ventilazione ipossica (HVR) (1) nei topi C57BL/6J prima e dopo l'infusione di leptina al basale e dopo la denervazione CB; (2) in mouse LepRb-deficienti db/db obesi al basale e dopo la sovraespressione LepRb in CB. Nei topi C57BL/6J, la leptina ha aumentato l'HVR e gli effetti della leptina sull'HVR sono stati aboliti dalla denervazione della CB. Nei mouse db/db, l'espressione LepRb in CB ha aumentato l'HVR. Pertanto, concludiamo che la leptina agisce in CB per aumentare le risposte all'ipossia.

Introduzione

Un adipocito prodotto ormone leptina agisce nell'ipotalamo per sopprimere l'assunzione di cibo e aumentare il tasso metabolico. Studi condotti nel nostro laboratorio1,2 e da altri ricercatori3,4 hanno mostrato che la leptina aumenta la risposta ventilatoria ipercapnica (HVR) prevenendo l'ipoventilazione dell'obesità nella leptina obesità carente. Tuttavia, la maggior parte degli individui obesi hanno alti livelli di leptina plasmatica e dimostrano resistenza agli effetti metabolici e respiratori dell'ormone5,6,7,8. La resistenza alla leptina è multifattoriale, ma la permeabilità limitata della barriera emato-encefalica (BBB) alla leptina svolge un ruolo importante. Proponiamo che la leptina agisca al di sotto della BBB in un organo chiave di sensibilità ipossica periferica, i corpi carotidi (CB), per difendere la respirazione in individui obesi. Le CB esprimono la lunga isoformazione funzionale del recettore della lepina, LepRb, ma il ruolo della CB negli effetti respiratori della leptina non è stato sufficientemente chiarito9,10.

L'obiettivo del nostro metodo era quello di esaminare l'effetto della segnalazione di leptina nel CB sull'HVR. La nostra logica era quella di eseguire (a) esperimenti di perdita di funzione infondendo leptina nei topi con corpi carotidi intatti e corpi carotidi denervati seguiti da misurazioni HVR; (b) guadagno di esperimenti di funzione in topi db/db privi di LepRb, in cui abbiamo misurato l'HVR al basale e dopo l'espressione di LepRb esclusivamente in CB. Il vantaggio delle nostre tecniche era che abbiamo eseguito tutti i nostri esperimenti su topi non adeguatamente svincolati durante la sonnoenza e la veglia. I ricercatori precedenti hanno eseguito i loro esperimenti in anestesia9 o non hanno misurato gli effetti della leptina durante il sonno10. Inoltre, il nostro studio è il primo a utilizzare un approccio unico di guadagno di funzione con espressione LepRb selettiva in CB descritto sopra.

In generale, il nostro approccio può essere generalizzato ad altri recettori espressi in CB e il loro ruolo nella sensibilità ipossica. I ricercatori possono infondere un ligando a un recettore di interesse e misurare l'HVR al basale e dopo la denervazione CB. Come approccio complementare, un recettore di interesse può essere sovraespresso nelle misurazioni CB e HVR può essere eseguito prima e dopo la sovraespressione utilizzando la nostra tecnologia descritta in questo manoscritto.

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Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (MO18M211).

1. Infusione di Leptina

NOT: Al fine di esaminare l'effetto della leptina sulla respirazione, abbiamo infuso leptina sottocutaneamente in topi magri C57BL/6J da una pompa osmotica per aumentare i livelli di leptina circolante a quelli osservati nei topi obesi.

  1. Preparazione della pompa osmotica
    1. Pesare la pompa vuota per verificare il peso netto della soluzione caricata.
    2. Aggiungere la leptina (5 mg/mL) alla pompa osmotica (1 l/h per 3 giorni). Riempire la pompa con una piccola siringa (1 mL). Dopo il riempimento, chiudere la pompa con il tubo di riempimento con smussato fornito a 27 calibro.
      NOT: La siringa e il tubo collegato devono essere privi di bolle d'aria.
    3. Dopo il riempimento, pesare nuovamente la pompa per verificare il peso netto della soluzione.
    4. Inserire la pompa di leptina sottocutaneamente nell'area interscapulare.
      NOTA:       Se si desidera avviare immediatamente l'infusione, incubare la pompa pre-riempita nella salina sterile a 37 gradi centigradi per almeno 4-6 h (preferibilmente durante la notte).

2. Risposta Ventilatoria ipossica (HVR)

NOT: Le condizioni termoneutrali eliminano i fattori stressanti imposti dalla temperatura ambiente fredda e modificano significativamente il metabolismo nei topi. Pertanto, tutte le misurazioni respiratorie devono essere eseguite in condizioni termoneutrali (t - 30 gradi centigradi) utilizzando un'incubatrice neooatale12 (Figura 1A). La camera di pletismografia di tutto il corpo (WBP) è stata utilizzata per tutte le misurazioni. Tutti gli animali devono essere acclimatati alla camera di pletismografia barometrica e a un collare finto per la successiva registrazione dell'ossimetria dell'impulso per 3-5 giorni prima delle misurazioni dell'HVR. HVR viene registrato tra 10 AM e 5 PM. HVR viene soppresso durante il sonno, quindi può essere misurato separatamente durante il sonno e la veglia tranquilla13. Per garantire lo specifico stadio sonno-veglia dell'animale durante la misurazione HVR, gli elettrodi EEG/EMG devono essere impiantati come un headmount EEG/EMG come descritto in precedenza14. Gli animali devono essere autorizzati a recuperare per almeno 72 h dopo il headmount. La messa in scena del sonno deve essere eseguita in epoche 5 s. Il sonno NREM è riconosciuto dall'attività EEG a onde lente che occupa più del 50% dell'epoca. La veglia tranquilla si manifesta con l'attività alfa EEG in assenza di movimenti. Il sonno REM è identificato dall'attività alfa e theta EEG predominante in presenza di tono muscolare ridotto su EMG. Tipicamente, il sonno REM non viene osservato durante le sfide del gas HVR.

  1. Il protocollo di registrazione HVR
    1. Utilizzare la camera WBP delle seguenti dimensioni: diametro interno di 80 mm, altezza di 50,5 mm e volume di 0,4 L. La camera WBP è composta da due camere, camere sigillate e di riferimento, e una piattaforma circolare per posizionare il mouse14 (Figura 1B). L'afflusso e il deflusso all'interno della camera sono controllati da fonti di pressione positive e negative che mantengono la pressione atmosferica. Questo controllo crea un flusso di distorsione costante nella camera e previene la ritenzione di CO2. Per ulteriori informazioni sull'impostazione WBP, vedere Hernandez e i colleghi15.
    2. Misurare la temperatura all'interno della camera e l'umidità relativa nella stanza prima di posizionare il mouse nel WBP.
    3. Misurare il peso corporeo e la temperatura rettale.
    4. Posizionare il collare ossidato intorno al collo del mouse (l'area deve essere precedentemente rasata).
    5. Posizionare il mouse all'interno del WBP e assicurarsi che la camera sia completamente sigillata per evitare perdite d'aria.
    6. Attendere circa 30 min fino a quando il mouse è silenzioso e la camera è ad un volume costante.
    7. Normoxia: dopo 30 min, se il mouse è silenzioso, iniziare a registrare i segnali respiratori e la saturazione dell'ossigeno periferico (SpO2)alla fase normossia (21% FiO2 a 1 atm di pressione) per 20 min, utilizzando LabChart 7 Pro (versione 7.2).
    8. Ipossia: dopo 20 min di nodi di nodia di nodia di normsione, iniziare a registrare il primo ciclo di ipossia acuta e SpO2. Per la fase di ipossia, esporre gli animali a un flusso costante di gas misto composto da 10% O2 e 3% CO2 per 5 min.
      1. Durante i primi 30 secondi di ipossia, il gas misto scorre attraverso la camera attraverso 2 piccoli porti laterali alla base permettendo al FiO2 di scendere dal 21% (a 1 atm di pressione) al 10%.
      2. Dopo i 30 s iniziali, chiudere uno dei piccoli porti laterali della camera WBP e continuare a registrare presso l'ipossia costante al 10% FiO2 per 5 min.
        NOTA: La miscela di 10% O2 e 3% CO2 a ipossia viene utilizzata al fine di mantenere eucapnea11.
    9. Dopo i 5 min di ipossia, esporre nuovamente il mouse all'aria ambiente (21% FiO2 a 1 atm di pressione) commutando la sorgente di afflusso.
    10. Attendere almeno 30 min fino alla successiva registrazione della normsia per recuperare dalla precedente esposizione ipossica per evitare il fenomeno del roll-off del ventilatore (cioè la soppressione centrale della respirazione durante l'ipossia16).
      NOT: Ripetere i cicli di normossia/ipossia tre volte in ogni topo per assicurare la riproducibilità delle misurazioni. Secondo la nostra esperienza, ulteriori (più di 3 volte in un dato giorno) esposizioni ipossiche dovrebbero essere evitate, a causa dell'adattamento ventilatorio (il fenomeno del roll-off).
    11. Alla fine dell'esperimento, calibrare la camera WBP (con il mouse è ancora all'interno) iniettando 1 mL di aria ambiente 3 volte con una siringa collegata a una delle piccole porte laterali alla base della camera.
    12. Misurare nuovamente la temperatura nella camera con l'animale al suo interno.
    13. Aprire la camera e misurare la temperatura rettale del mouse prima di riposizionarlo nella sua gabbia di casa.
  2. Calcolo HVR
    1. Digitalizza tutti i segnali per il calcolo HVR a 1.000 Hz (frequenza di campionamento per canale).
      NOT: L'analisi del volume delle maree WBP viene eseguita nel grafico di laboratorio 7 sulla base dell'equazione di Drorbaugh e Fenn17. Le variabili richieste comprendono la temperatura rettale del topo e la temperatura della camera (prima e dopo la misurazione dell'HVR), l'umidità relativa e la costante del gas camera. Questa costante risulta dalla deflessione della pressione WBP dopo le iniezioni di 1 mL dell'aria nella fase di calibrazione. Per ulteriori dettagli, vedere Hernandez e colleghi15.
    2. Dopo aver calcolato l'equazione Drorbaugh e Fenn, moltiplicare il canale della camera del volume di marea (Vt) per la costante.
    3. Selezione delle registrazioni per l'analisi
      1. Normoxia: selezionare solo le sezioni di respirazione costante con volume di marea costante. Evitare le sezioni in prossimità dei movimenti del mouse.
      2. Ipossia: scartare i primi 30 s quando i livelli di O2 sono in calo dal 21% al 10%, selezionare le sezioni da 30 s a 2 min di 10% O2 esposizione (un intervallo di 90 s). All'interno di questo intervallo, selezionare solo le sezioni con respirazione costante con volume di marea costante. Evitare le sezioni in prossimità dei movimenti del mouse. L'analisi è affidabile se almeno 10 s di ipossia è selezionata in ogni ciclo.
        NOT: La componente periferica di chemoreflex governata da CB predomina durante i primi 1-2 min di esposizione16,18,19. Durante la seconda fase, tra 2 min e 5 min di esposizione ipossica, sia la periferica che la componente centrale svolgono un ruolo. Infine, la terza fase, > 5 min, è caratterizzata da ipoventilazione (il fenomeno del roll-off) governata prevalentemente da chemorecettori centrali. La nostra esperienza dimostra che i topi sono spesso svegli durante l'esposizione ipossica a causa degli interruttori manuali nella fonte del flusso d'aria.
    4. Dopo la selezione, calcolare la ventilazione media minuto (VE) in condizioni di normossiche e ipossiche utilizzando la formula VE : frequenza respiratoria X volume di marea.
    5. Calcolare lo SpO2 medio a condizioni di normossia e ipossia.
    6. Calcolare manualmente l'HVR utilizzando la formula HVR (VE (10% O2) - VE (21%O2)) / (SpO2 (10% O2) – SpO2 (21% O2)).
      NOT: Nei topi C57BL/6J, la pompa osmotica per l'infusione di leptina può compromettere l'accurata rilevazione del segnale SpO2 da parte del collare del collo. In questo caso, l'HVR viene calcolato in base ai valori fiO2 in condizioni di normossiche e ipossiche come HVR , che è il valoreDi V , E / FiO211.

3. Denervazione del corpo Carotide o dissezione del nervo del sinus carotide (CSND)

NOT: Abbiamo eseguito la denervazione chirurgica e chimica combinata una settimana a parte, perché la denervazione chirurgica da sola non abolisce il chemoreflex ipossico.

  1. Preparazione chirurgica
    1. Eseguire tutte le procedure su topi adulti maschi C57BL/6J. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici. Utilizzare guanti chirurgici sterili, siringhe e applicatori con punta di cotone.
    2. Anestesizzare i topi maschi C57BL/6J con 1-2% isoflurane utilizzando un cono naso e posizionare una coperta calda per prevenire l'ipotermia. L'Isoflurane è attentamente titolato per mantenere la frequenza respiratoria a 1 Hz (60 respiri/min). L'adeguatezza dell'anestesia prima dell'inizio degli interventi chirurgici sarà valutata dalla frequenza respiratoria, dall'assenza di movimenti e rumori udibili, dall'assenza di risposta agli stimoli tattili e dal riflesso del pedale dell'arto anteriore o dell'arto posteriore.
    3. Somministrare buprenorfine (0,05 mg/kg) intraperitonealmente per prevenire il disagio da dolore. Rimuovere i capelli nella regione ventrale del collo e disinfettare l'area con betadine e alcol.
    4. Per prevenire l'desiccazione corneale, lubrificare gli occhi dei topi con unguento oftalmico sterile durante l'anestesia.
  2. Procedure CSND
    Fase 1: denervazione chirurgica
    1. Dopo l'incisione della linea mediana, esporre la biforcazione delle arterie carotidecomuni comuni rimuovendo i tessuti connettivi e il tessuto adiposo.
    2. Identificare il nervo ipoglossale, che di solito è molto prominente, e poi sollevarlo per esporre il nervo glossofangeal immediatamente sotto. I nervi del peccato carotideti seziosto si legano bilateralmente utilizzando forbici a micro molla.
    3. Chiudere l'incisione con una sutura di seta 6-0.
    4. Somministrare 1 mL di normale solista salina sottocutaneamente per prevenire la disidratazione.
    5. Casa i topi in una camera di recupero e monitorare il loro comportamento ogni 15 min per iniziale 1 h fino a quando i topi riacquistano coscienza per mantenere la recumbency sternale. Riportare i topi alle gabbie di casa dopo che sono stati completamente recuperati. Continuare a monitorare i topi due volte al giorno per i prossimi 3 giorni. Dare ulteriore buprenorfina se i topi mostrano segni di dolore (ad esempio, ridotto appetito, irrequietezza).
      Fase 2: denervazione chimica
    6. Una settimana dopo l'intervento, dipingere l'arteria carotide con una soluzione del 2% fenolo diluito in etanolo nei punti di ramificazione dal nervo glossofagiongeale al polo cranico del CB. La stessa cura post-operatoria deve essere fornita dopo la denervazione chimica come descritto sopra nella sezione di denervazione chirurgica.
      NOTA: Per un gruppo di chirurgia fittizia, vengono eseguite le stesse procedure ad eccezione della dissezione del nervo carotidese del seno.
    7. Lasciare che gli animali si riprendano per 5-7 giorni prima delle misurazioni HVR.

4. Espressione di LepRb nel CB utilizzando un vettore adenovirale (Ad-LepRb) vs controllo (Ad-Lac)

  1. Sospensioni Ad-LepRb e Ad-Lac
    1. Trasfecare i topi con adenovirus (Ad-LepRb-GFP, 2-5x1010 pfu/mL per la sovraespressione, Ad-Lacz, 1 x 1010 pfu/mL per il controllo) all'area CB.
    2. Scongelare la matrice Matrigel immergendo la fiala nel ghiaccio in un frigorifero a 4 gradi durante la notte.
    3. Sospendere delicatamente l'adenovirus nella matrice di Matrigel liquido a 1:5 (1 -L di matrice Di Matrigel e 4 -L di adenovirus applicato bilateralmente).
    4. Mantenere sempre la sospensione virale sul ghiaccio fino a quando non viene applicato nel CB.
  2. Preparazione chirurgica
    1. Utilizzare gli stessi strumenti chirurgici del protocollo CSND.
    2. Anestetizza resthetico LepRb-deficient db/db topi con 2-2,5% isoflurane utilizzando un cono naso e posizionare gli animali su una coperta calda per prevenire l'ipotermia. L'Isoflurane è attentamente titolato per mantenere la frequenza respiratoria a 1 Hz (60 respiri/min). L'adeguatezza dell'anestesia sarà valutata dalla frequenza respiratoria, dall'assenza di movimenti e rumori udibili, dall'assenza di risposta agli stimoli tattili e dal riflesso del ritiro del pedale dell'arto anteriore o posteriore.
    3. Somministrare buprenorfine (0,05 mg/kg) per via intraperitonele.
    4. Rimuovere i capelli nella regione ventrale del collo e disinfettare l'area con betadine e alcol come nel protocollo CSND.
    5. Per prevenire l'desiccazione corneale, lubrificare gli occhi dei topi con unguento oftalmico sterile durante l'anestesia.
  3. Trattamento dell'adenovirus del CB
    1. Esporre i CB come descritto nel protocollo CSND e applicare 5 ll della sospensione virale all'area CB bilateralmente.
    2. Attendere 2-3 min fino a quando la matrice liquido Matrigel diventa un gel. Dopo aver confermato che la sospensione virale è stata congealed, chiudere l'incisione con 6.0 sutura di seta.
  4. Dopo l'intervento chirurgico
    1. Casa i topi in una camera di recupero e monitorare il loro comportamento ogni 15 min per iniziale 1 h fino a quando i topi riacquistano coscienza per mantenere la recumbency sternale. Riportare i topi alle gabbie di casa dopo che sono stati completamente recuperati. Continuare a monitorare i topi due volte al giorno per i prossimi 3 giorni. Dare ulteriore buprenorfina se i topi mostrano segni di dolore (ad esempio, ridotto appetito, irrequietezza).
    2. Somministrare Buprenorfina (0,05 mg/kg) intraperitonealmente come necessario per prevenire il disagio del dolore durante il periodo post-operatorio.
    3. Misurare l'HVR 9 giorni dopo la trafezione dell'adenovirus.

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Risultati

L'infusione continua di leptina ha aumentato significativamente l'HVR nei topi magri C57BL/6J da 0,23 a 0,31 mL/min/g/SFiO2 (P < 0.001, Figura 2)11. Il CSND ha abolito l'aumento indotto dalla leptina dell'HVR (Figura 2), mentre non sono stati osservati effetti attenuanti della CSND sull'HVR in finto gruppo di chirurgia dopo l'infusione di leptina.

L'espressione LepRb nei topi LepR

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Discussione

L'obiettivo principale del nostro studio è stato quello di esaminare gli effetti respiratori della segnalazione della leptina nel CB. Diversi protocolli sono stati sviluppati per valutare il ruolo della leptina in modo meccanicistico. In primo luogo, il contributo specifico di CB all'HVR è stato analizzato da un'attenta quantificazione dell'HVR durante i primi 2 min di esposizione ipossica. In secondo luogo, la rilevanza della CB nell'up-regolazione del controllo della respirazione mediata dalla leptina è stata esaminata...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi o divulgazioni contrastanti.

Ringraziamenti

R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 mL Siringhe da insulinaBD Biosciences309311
1x PBS (pH 7,4)Gibco10010-023500 ml
Ad-LaczDr. Christopher Rhodes (Università di Chicago)1 x 1010 pfu/mL
Ad-LepRb-GFPVector BiolabsADV-2633802-5 x 1010 pfu/mL
Carrello per anestesiaAtlantic Biomedical
BetadinePurdue Products Ltd.12496-0757-5
Buprenorfina (Buprenex)Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.12496-0757-50,3 mg/mL
C57Bl/6JJackson laboratory000664Tope Strain
Cotton Garza SpugneFisherbrand22-362-178
db/dbJackson laboratory000697Tope
Strain EthanolPharmco-AAPER111000200
IsofluranoVetone502017
Lab GraficoData Science International (DSI)Software
Matrigel MatrixBD Biosciences356234
Micro Spring ScissorsWorld Precision Instruments (WPI)14124
Mouse Ox PlusSTARR Life Sciences Corp.Software
Mouse Ox Plus Collare SensoreSTARR Life Sciences Corp.015022-2Clip per colletto medio Special 7"
Camera di pletismografia per tutto il corpo del topoData Science International (DSI)PLY3211
Ohio Care Plus IncubatoreOhmedaHCHD000173
Forbici operativeWorld Precision Instruments (WPI)501753-Gdiritta
Alzet1003D1 μ L/h, 3 giorni
FenoloSigma-AldrichP4557
Proteina di leptina di topo ricombinanteR & D systems498-OB-05M5 mg
soluzione salinaRICCA Chemical7210-16Cloruro di sodio allo 0,9%
Sutura chirurgica sterileDemeTechDT-639-1Seta, misura 6-0
TermometroSoluzioni di calibrazione innovative (INNOCAL)EW 20250-91
Pompa osmotica

Riferimenti

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