Articolo metodologico

Trasformazione della radice di pomodoro seguita da inoculazione con Ralstonia Solanacearum per un'analisi genetica diretta della malattia batterica di Wilt

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DOI:

10.3791/60302

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11 marzo 2020

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1Shanghai Center for Plant Stress Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Shanghai Institutes of Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences, 3Department of Soil Microbiology and Symbiotic Systems, Estación Experimental del Zaidín (CSIC)

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un metodo versatile per la trasformazione della radice di pomodoro seguito da inoculazione con Ralstonia solanacearum per eseguire un'analisi genetica semplice per lo studio della malattia dell'avvizzimento batterico.

Abstract

Ralstonia solanacearum è un devastante patogeno vascolare portato sul suolo che può infettare una vasta gamma di specie vegetali, causando un'importante minaccia per l'agricoltura. Tuttavia, il modello ralstonia è notevolmente sottoesplorato rispetto ad altri modelli che coinvolgono patogeni vegetali batterici, come le siringhe Pseudomonas in Arabidopsis. La ricerca mirata a comprendere l'interazione tra Ralstonia e piante da coltura è essenziale per sviluppare soluzioni sostenibili per combattere le malattie dell'avvistamento batterico, ma è attualmente ostacolata dalla mancanza di semplici analisi sperimentali per caratterizzare i diversi componenti dell'interazione nelle piante ospiti native. In questo scenario, abbiamo sviluppato un metodo per eseguire l'analisi genetica dell'infezione da Ralstonia del pomodoro, un ospite naturale di Ralstonia. Questo metodo si basa sulla trasformazione mediata di radici di pomodoro agrobacterium rhizogenes,seguita dall'inoculazione del suolo ralstonia delle piante risultanti, contenente radici trasformate che esprimono il costrutto di interesse. La versatilità dell'analisi della trasformazione della radice consente di eseguire la sovraespressione genica o il silenziamento genico mediato dall'RNAi. Come prova di concetto, abbiamo usato questo metodo per dimostrare che il silenziamento mediato dall'RNAi di SlCESA6 nelle radici di pomodoro ha conferito resistenza a Ralstonia. Qui, descriviamo questo metodo in dettaglio, consentendo agli approcci genetici di comprendere la malattia dell'avvizzimento batterico in un tempo relativamente breve e con piccoli requisiti di attrezzature e spazio di crescita delle piante.

Introduzione

Ralstonia solanacearum, l'agente causale della malattia dell'avvistamento batterico, è un devastante patogeno vascolare del suolo con una distribuzione mondiale che può infettare una vasta gamma di specie vegetali, tra cui patate, pomodoro, tabacco, banana, pepe e melanzane, tra gli altri1,2. Le perdite di rendimento causate da Ralstonia possono raggiungere l'80-90% della produzione di pomodoro, patate o banane, a seconda della cultivar, del clima, del suolo e di altri fattori3. Tuttavia, il modello Ralstonia è notevolmente poco esplorato rispetto ad altri modelli che coinvolgono patogeni vegetali batterici, come Pseudomonas siringae o Xanthomonas spp. Inoltre, la maggior parte degli studi sulle interazioni pianta-microbo si concentra sulla pianta modello Arabidopsis thaliana. Anche se la ricerca che utilizza questi modelli ha ampiamente contribuito alla nostra comprensione delle interazioni piante-batteri, non affrontano l'attuale necessità di comprendere queste interazioni nelle piante da coltura. La ricerca mirata a comprendere l'interazione tra Ralstonia e piante da coltura è essenziale per sviluppare soluzioni sostenibili per combattere le malattie dell'avvistamento batterico, ma è attualmente ostacolata dalla mancanza di semplici analisi sperimentali per caratterizzare i diversi componenti dell'interazione. In particolare, il pomodoro, un ospite naturale per Ralstonia, è la seconda coltura vegetale più importante al mondo ed è colpita da una pletora di malattie4, tra cui la malattia di avvizzimento batterico. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un metodo semplice per eseguire l'analisi genetica dell'infezione da Ralstonia del pomodoro. Questo metodo si basa sulla trasformazione mediata agrobacterium rhizogenesdelle radici di pomodoro, utilizzando la fluorescenza DsRed come marcatore di selezione5, seguita dall'inoculazione del suolo di Ralstonia delle piante risultanti, contenente radici trasformate che esprimono il costrutto di interesse. La versatilità dell'analisi della trasformazione della radice consente di eseguire la sovraespressione genica o il silenziamento genico mediato dall'RNAi.

Una potenziale limitazione di questo metodo consiste nella crescita residua di radici non trasformate. Ciò è particolarmente importante nei casi in cui il plasmico usato manca di un gene reporter che consenta la selezione delle radici trasformate. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo alternativo basato sulla selezione degli antibiotici, che inibisce la crescita di radici non trasformate, consentendo la crescita di radici trasformate sane resistenti agli antibiotici. Poiché A. i rizogeni non inducono la trasformazione dei germogli, sono suscettibili all'antibiotico e, pertanto, dovrebbero essere tenuti separati dal mezzo contenente antibiotici.

Anche se la resistenza alle piante contro Ralstonia non è ben compresa, diversi rapporti hanno associato alterazioni della parete cellulare a una maggiore resistenza all'appassimento batterico6,7,8,9.9 È stato suggerito che queste alterazioni della parete cellulare influenzano lo sviluppo vascolare, un aspetto essenziale per lo stile di vita di Ralstonia all'interno della pianta10. Le mutazioni nei geni che codificano la cellulosa sintetizzano CESA4, CESA7 e CESA8 in Arabidopsis thaliana hanno dimostrato di compromettere l'integrità della parete cellulare secondaria, causando una maggiore resistenza a Ralstonia, che sembra essere collegato alla segnalazione ABA8. Therefore, as a proof of concept for our method, we performed RNAi-mediated gene silencing of SlCESA6 (Solyc02g072240), a secondary cell-wall cellulose synthase, and ortholog of AtCESA8 (At4g18780). La successiva inoculazione del suolo con Ralstonia ha mostrato che il silenziamento di SlCESA6 ha migliorato la resistenza di SlCESA6 ai sintomi dell'avvizzimento batterico, suggerendo che la resistenza mediata dalla parete cellulare a Ralstonia è probabilmente conservata nel pomodoro e convalidando il nostro metodo per effettuare analisi genetiche della resistenza batterica delle wilt nelle radici del pomodoro. Qui, descriviamo questo metodo in dettaglio, consentendo agli approcci genetici di comprendere la malattia dell'avvizzimento batterico in un tempo relativamente breve e con piccoli requisiti di attrezzature e spazio di crescita delle piante.

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Protocollo

NOTA: Parti importanti di questo metodo riguardano la movimentazione di materiali vegetali in vitro, e quindi è importante mantenere le condizioni sterili durante tutte queste procedure, compresa la visualizzazione della fluorescenza DsRed. Durante tutto il processo di trasformazione, le piantine di pomodoro crescono a 25-28 gradi centigradi e 16 h/8 h luce/scuro (130 fotoni mol m-2s-1 luce). Le piastre sono sigillate con nastro microporo per facilitare lo scambio di gas e la traspirazione.

1. Preparazione di piante di pomodoro e agrobacterium rhizogenes

  1. Sterilizzare i semi di pomodoro (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Tomato Genetics Resource Center, TGRC) con 5% (v/v) ipoclorito di sodio per 5 min. Lavare 4-5 volte con acqua distillata sterile e mantenere i semi che tremano lentamente in acqua sterile durante la notte per facilitare la germinazione.
  2. Trasferire i semi di pomodoro su mezzi a mezza resistenza Murashige e Skoog (1/2 MS) senza saccarosio (2,21 g/L MS, 8% w/v agar). Mantenere i semi al buio a 25-28 gradi centigradi per tre giorni(Figura 1A).
    NOTA: Per ogni costrutto sono di solito necessari circa 40 semi.
  3. Autoclave 8,5 cm2 fogli filtro quadrati. Posizionare le carte filtro quadrate all'interno di 9 cm2 piatti di petri quadrati contenenti 1/2 MS medio (posizionare la carta sulla parte superiore dell'agar) e posizionare sei semi di pomodoro germinati su ogni piatto (Figura 1B). Sigillare la piastra con il nastro microporo e incubare i semi germinati a 25-28 gradi centigradi per 3-4 giorni.
  4. Coltivare l'Agrobacterium rhizogenes MSU440 in solido LB medio (con antibiotici appropriati) a 28 s C due giorni prima della trasformazione dell'impianto.
    NOTA: A. rhizogenes è fornito dal Dr. Juan Antonio L'pez Rèez, EE-CSIC, Granada, Spagna. Nell'esperimento descritto in questo articolo, sono stati utilizzati A. rhizogenes contenenti pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6 o un vettore vuoto, come controllo. pK7GWIWG2_II-RedRoot contiene un gene reporter, DsRed, guidato dal promotore dell'Arabidopsis thaliana ubiquitin (pAtUBQ10) e conferisce resistenza alla spettronomina (50 g/mL). È possibile utilizzare altri vettori per la sovraespressione genica, come riportato primadi 5. In questo lavoro, l'amplificazione del frammento specifico per il silenziamento SlCESA6 è stata ottenuta mediante la trascrizione inversa (RT) PCR utilizzando L'RNA isolato dal pomodoro (S. lycopersicum cv. Moneymaker) e migate nel vettore p-ENTR/D-TOPO (Tabella 1). Successivamente, il frammento SlCESA6-RNAi è stato clonato nel vettore binario pK7GWIWG2_II-RedRoot.

2. Trasformazione e selezione delle piante

  1. Utilizzando un bisturi sterile, tagliare il radicle e il fondo dell'ipocotil delle piantine di pomodoro (Figura 1C,D).
  2. Raccogliere la biomassa di A. rhizogenes dalla superficie del mezzo LB utilizzando punte di plastica o una lama del bisturi e immergere con cura le piantine di pomodoro tagliate nella biomassa batterica (Figura 1E).
  3. Dopo l'inoculazione con A. rhizogenes, coprire le piantine di pomodoro con una carta filtrante semi-circolare di 2 cm x 4 cm (Figura 1F), al fine di mantenere un'elevata umidità e facilitare la sopravvivenza e il nuovo sviluppo delle radici.
  4. Conservare le piantine di pomodoro trasformate per 6-7 giorni. Quindi, utilizzare un bisturi sterile per tagliare le nuove radici pelose emergenti (Figura 1G,H; a questo passo, le radici non sono ancora trasformate) e consentire alle piantine di produrre nuove radici pelose.
  5. Una volta che la seconda generazione di nuove radici pelose appaiono (Figura 1I), rimuovere la carta da filtro sulla parte superiore delle piantine, e sigillare la piastra con nastro remarica.
    NOTA: A questo punto, la presenza del marcatore fluorescente DsRed nel vettore di trasformazione consente di visualizzare l'efficienza di trasformazione nelle nuove radici.
  6. Per visualizzare la fluorescenza DsRed, utilizzare uno stereomicroscopio o qualsiasi altra apparecchiatura per l'imaging in vivo dell'impianto (Figura 1J). Contrassegnare le radici trasformate (fluorescenza rossa) positive e rimuovere le radici negative non trasformate (nessuna fluorescenza rossa) utilizzando un bisturi sterile.
  7. Trasferire le piantine che mostrano la fluorescenza rossa su una nuova piastra contenente un mezzo 1/2 MS, al fine di facilitare lo sviluppo della radice trasformata come radice principale (Figura 1K). Mantenere le piantine che non mostrano fluorescenza rossa nella stessa piastra per controllare l'emergere di radici fluorescenti (Figura 1L) nei punti temporali successivi.
  8. Metodo alternativo basato sulla selezione degli antibiotici
    1. Alternativa al passaggio 2.5, preparare piatti quadrati riempiti a metà cm2 contenenti mezzo 1/2 MS con l'antibiotico appropriato. Inclinare le piastre di circa 5 gradi durante il processo di preparazione per generare uno spazio vuoto senza mezzo (Figura 2A ), permettendo ai germoglidicrescere evitando il contatto con l'antibiotico.
    2. Alternativa al passaggio 2.6, dopo aver tagliato le prime radici pelose non trasformate (passaggio 2.4), trasferire le piantine senza radici nelle piastre semipiene utilizzando carta filtrante con le dimensioni appropriate (Figura 2B).
      NOTA: Come controllo positivo, si raccomanda di trasformare diverse piantine con un plasmide contenente la stessa resistenza agli antibiotici e un gene reporter (in questo protocollo, pK7GWIWG2_II-RedRoot; kanamycin 50 g/mL).
    3. In alternativa al passaggio 2.7, lascia che le piantine sviluppino nuove radici pelose e taglino quelle radici che non sono a diretto contatto con la superficie delle carte sandwich del filtro, poiché queste radici possono evitare la selezione antibiotica.
      NOTA: A causa dell'effetto antibiotico, lo sviluppo delle radici può essere più lento rispetto alle piastre senza antibiotici. Nuove radici pelose trasformate appaiono entro 14-18 giorni dopo il trasferimento delle piantine senza radici alle piastre semi-piene (passaggio 2.8.2) (Figura 2C-E).
  9. Coprire le piantine con una carta filtrante semicerchio di 2 cm x 4 cm, sigillare la piastra e incubare le piantine per farle sviluppare nuove radici pelose.
    NOTA: Non è necessario eliminare l'A. rhizogenes usando antibiotici. La carta filtrante sopra il mezzo MS e la mancanza di saccarosio inibiscono la diffusione degli A. rhizogenes sulla piastra5.
  10. Da cinque a sette giorni dopo la prima selezione radice, ripetere il processo di selezione per selezionare nuove radici trasformate e rimuovere le radici non trasformate. Trasferire le piantine contenenti radici trasformate in una nuova piastra contenente un mezzo MS 1/2.

3. Trasferire in vasi di inoculazione

  1. Preparare i vasi di inoculazione dove la superficie delle radici sarà esposta all'inoculum batterico: immergere i vasi di inoculazione con acqua, versare l'acqua in eccesso e metterli in un vassoio di piantagione di plastica. Trasferire le piantine selezionate con radici trasformate in vasi di inoculazione utilizzando una pinzetta (Figura 3A).
  2. Coprire il vassoio con un involucro di plastica o un coperchio trasparente e tenerli a 25-28 gradi centigradi e 65% di umidità (16 h/8 h luce/scuro; 130 fotoni mol m-2s-1 luce), per mantenere un alto livello di umidità Figura 3B). Rimuovere il coperchio dopo cinque o sei giorni.
    NOTA: Le piante di pomodoro trasformate sono pronte per l'inoculazione da due a tre settimane dopo il trasferimento a suolo (Figura 3C). Durante la crescita del suolo, le piante di pomodoro possono produrre nuove radici che non vengono trasformate. Per determinare l'estensione di questo fenomeno, la fluorescenza rossa è stata visualizzata nelle radici delle piante di pomodoro trasformate di 3 settimane. La maggior parte delle radici (80%-100%) ha mostrato fluorescenza rossa, indicando che sono effettivamente trasformati (Figura 3D,E).

4. Inoculazione inzuppata del suolo

  1. Coltivare R. solancearum (ceppo GMI1000 in questo protocollo) in phi mezzo liquido (Tabella 211) in uno shaker orbitale (200 rpm) a 28 gradi centigradi fino alla fase stazionaria.
  2. Determinare i numeri batterici misurando la densità ottica della coltura batterica a 600 nm (OD600). Diluire la coltura batterica con acqua a un OD600 di 0,1 (in condizioni utilizzate qui, questo corrisponde a circa 108 unità formanti colonie [CFU]/mL).
  3. Mettere in un vassoio di inoculazione i vasi di inoculazione di 16-20 contenenti piante di pomodoro trasformate in un vassoio di inoculazione (29 cm x 20 cm; Figura 4A).
  4. Versare nel vassoio contenente i vasi di inoculazione di 300 mL (15 mL per pianta) di inoculo batterico (OD600 di 0,1). Lasciarli in ammollo nell'inoculum per 20 min (Figura 4B).
  5. Preparare un nuovo vassoio con uno strato di terriccio da vaso. Spostate i vasi inoculati nel nuovo vassoio (Figura 4C) e collocate i vassoi in una camera di crescita con un'umidità del 75%, 26-28 gradi centigradi e un fotoperiodo di 12 h luce e 12 h di oscurità (130 - fotoni m-2s-1 luce).

5. Determinazione dei parametri di infezione e analisi statistica

  1. Punteggio sintomi della malattia come descritto in precedenza12,13, utilizzando una scala che va da 0 (nessun sintomo) a 4 (completa appassimento) (Figura 4D-H), ogni giorno dopo l'inoculazione di Ralstonia per due settimane.
    NOTA: i dati dell'indice della malattia vengono raccolti dalla stessa unità sperimentale (ogni pianta) nel tempo.

6. Analisi dell'espressione genica

NOTA: l'espressione del transgene o del silenziamento del gene bersaglio può essere determinata da RT-PCR o da RT-PCR quantitativo (qRT-PCR).

  1. Raccogliere campioni ed estrarre L'RNA da una parte rappresentativa del sistema radicale trasformato (per valutare l'effetto sul gene bersaglio) e foglie (come controllo interno).
  2. Sintetizzare cDNA utilizzando 1 g di RNA totale trattato con DNase.
  3. Analizzare l'espressione genica dei geni bersaglio da qRT-PCR. Calcolare i livelli di trascrizione relativi utilizzando il metodo 2-zCT 14, utilizzando SlEF-1 come gene di pulizia15.
    NOTA: le sequenze di primer sono elencate nella Tabella 1.

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Risultati

La figura 5 mostra lo sviluppo dei sintomi della malattia delle piante di pomodoro con radici trasformate con un vettore vuoto (EV) e di piante con radici trasformate con un costrutto RNAi destinato a SlCESA6 (Solyc02g072240). I dati dell'indice della malattia (Figura 5A) vengono raccolti dalla stessa unità sperimentale (ogni impianto) nel tempo secondo una scala arbitraria da 0 a 4 e non seguon...

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Discussione

Il Ralstonia solanacearum rappresenta una minaccia importante per l'agricoltura; tuttavia, la sua interazione con ospiti naturali di importanza agricola è ancora poco compresa rispetto ad altri patogeni batterici, specialmente nelle specie vegetali delle colture. Nella maggior parte dei casi, l'analisi genetica è ostacolata dal tempo e dalle spese necessarie per modificare geneticamente le piante ospiti. Per risolvere questo problema e facilitare l'analisi genetica dell'infezione da R. solanacearum nel ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Macho per le discussioni utili, Alvaro Lopez-Garcoa per la consulenza statistica e Xinyu Jian per l'assistenza tecnica e amministrativa durante questo lavoro. Ringraziamo la struttura centrale di PSC Cell Biology per assistenza con l'imaging a fluorescenza Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca Sulla Priorità Strategica dell'Accademia Cinese delle Scienze (grant XDB27040204), lo Shanghai Center for Plant Stress Biology (Cinese Academy of Sciences) e il programma cinese 1000 Talents.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
di Petri quadrate da 90 mm
Polvere di agarSigma-Aldrich
Bacto peptoneBD (Becton e Dickinson)
Acidi CasaminoSigma-Aldrich
Carta
Sistema di imaging vegetale in vivo NightShade LB 985Berthold Technologies
Vasi JiffyJiffy Products International A.S.
Nastro microporoso3M
Murashige e Skoog medium (M519)Phytotechlab
Pindstrup substratoPindstrup Mosebrug A/S
Bisturi e lama
Ipoclorito di sodioSigma-Aldrich
Banco
Pinzetta
Wahtman cartaWahtman International Ltd. Maldstone
Estratto di lievitoOXOID
Piastre da filtro pulito sterile

Riferimenti

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