Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere matrici 3D derivate dal fibroblasto come scaffold naturale per i successivi saggi cellulari. I fibroblasti vengono semiizzati in una piastra di coltura pretrattata e stimolati con acido ascorbico per la generazione di matrici. Le matrici vengono decellularizzate e bloccate alle cellule rilevanti di coltura (ad esempio, cellule endoteliali).
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Articolo metodologico
Sistema a matrice 3D derivato da fibroblasti applicabile al saggio di formazione di tubi endoteliali
In questo articolo
Sommario
Abstract
La matrice extracellulare (ECM) è uno scaffold tridimensionale che funge da supporto principale per le cellule nei tessuti. Oltre alla sua funzione strutturale, l'ECM partecipa anche alla migrazione cellulare, alla proliferazione e alla differenziazione. I fibroblasti sono il principale tipo di cellule che modificano la disposizione e la produzione della fibra ECM. Nel cancro, i CAF (fibroblasti associati al cancro) sono in stato di attivazione permanente, partecipano al rimodellamento eCM, facilitano la migrazione delle cellule tumorali e stimolano l'angiogenesi associata al tumore, tra gli altri ruoli pro-tumorale. L'obiettivo di questo metodo è quello di creare una matrice tridimensionale con una composizione in fibra simile a matrici in vivo, utilizzando fibroblasti immortalati o CAF primari umani. I fibroblasti sono coltivati in placche di coltura cellulare pre-trattate e coltivati sotto stimolazione acida ascorbica. Quindi, i fibroblasti vengono rimossi e le matrici vengono bloccate per un ulteriore seeding cellulare. In questo modello ECM, i fibroblasti possono essere attivati o modificati per generare diversi tipi di matrice, i cui effetti possono essere studiati nella coltura cellulare. Le matrici 3D sono modellate anche da segnali cellulari, come la degradazione o gli enzimi che collegano estrai che potrebbero modificare la distribuzione della fibra. In questo contesto, l'angiogenesi può essere studiata, insieme ad altri tipi di cellule come le cellule tumorali epiteliali.
Introduzione
La matrice extracellulare (ECM) è una struttura dinamica presente in tutti i tipi di tessuto. È costituito da proteine e polisaccauri che creano una rete di fibre cruciali per l'adesione cellulare, la migrazione e la comunicazione1. La composizione ECM varia a seconda del tessuto. Mentre il collagene di tipo I è la proteina strutturale più diffusa, i tipi di collagene II, III, V e XI possono anche essere trovati in vari tessuti2. La fibronectina generata dai fibroblasti è necessaria per l'adesione cellulare2. Inoltre, ci sono altre molecole strutturali come l'elastina, laminina e i recettori super....
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Protocollo
I campioni di tessuto umano sono stati ottenuti con l'approvazione del Research Ethics Board dell'Ospedale Ramàn y Cajal, Madrid.
1. Preparazione delle soluzioni
- Preparare la soluzione di gelatina 0,2%: aggiungere 1 g di gelatina a 500 mL di PBS. Autoclave la soluzione e tenere a 4 gradi centigradi. Filtrare con un filtro di 0,22 m prima dell'uso.
- Preparare 1% glutaraldeide: Aggiungere 1 mL del 25% soluzione di brodo di glutaraldeide a 24 mL di PBS. Filtrare con un filtro di 0,22 m prima dell'uso.
- Preparare 1 M di etanolamina: preparare la soluzione di etanolamina con filtro sterile H2O. con un filtr....
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Risultati
I fibroblasti stimolati PDGF-BB creano un ECM più spesso. Herrera ealtri hanno mostrato come i fibroblasti stimolati da PDGF hanno generato una matrice più spessa e un maggiore orientamento della fibra7. I fibroblasti BJ-hTERT sono stati incubati con o senza PDGF e le aree rappresentative osservate hanno mostrato una distribuzione cellulare più allineata nelle matrici prodotte dal fibroblasto stimolato da PDGF (Figura 1a
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Discussione
Le matrici possono essere generate con fibroblasti immortalati o colture fibroblaste primarie. I fibroblasti sono facili da mantenere nella cultura in vitro con un alto tasso di crescita e resistenza allo stress. Possono anche essere isolati dal tessuto post-mortem3, anche se la contaminazione potrebbe essere una restrizione, a seconda dell'origine del tessuto.
Il modello a matrice 3D offre un nuovo ed efficace sistema per studiare con successo la composizione ECM e l'o.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Lo sviluppo di questo protocollo è stato supportato da PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 e RD12/0036/0041 dell'Instituto de Salud Carlos III; dalla Fondo europeo de Desarrollo Regional (FEDER); da parte di "CIBER de Càncer", CB16/12/00273 e CB16/12/00446, dall'Instituto de Salud Carlos III-FEDER; e dal Fundaciàn Cient-fica AECC (un approccio multiforme al cancro al pancreas bersaglio). Cristina Pea è stata insignita di un contratto Miguel Servet dell'Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude ha aiutato con il testo inglese. Ringraziamo i membri del laboratorio per l'aiuto e i consigli durante questa ricerca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Idrossido di ammonio (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amfotericina-B | Corning | 30-003-CF | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endoteliale Basale Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | aggiungere integratori prima dell'uso |
| Cellule endoteliali Integratori di terreno basale (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Biowest | S181B-500 | inattivato a caldo prima dell'uso |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | aggiungere integratori prima dell'uso |
| Integratori di terreno di crescita dei fibroblasti e fattori di crescita (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatina da pelle bovina | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldeide | Sigma | g5882 | |
| Acido L-ascorbico | Sigma | A92902-100G | sensibile alla luce |
| L-Glutammina | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Matita/Streptomicina (Pen/Streptomyc) | Gibco | 15140122 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Fibroblasti del prepuzio umano immortalizzati trasfettati con telomerasi ricombinante (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Vena ombelicale umana cellule endoteliali (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
Riferimenti
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, comp....
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Ristampe e permessi
