Articolo metodologico

Infezione da pneumococco delle cellule primarie endoteliali nel flusso costante

DOI:

10.3791/60323

⸱

31 ottobre 2019

 ,  ,  , 
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio descrive il monitoraggio microscopico dell'aderenza allo pneumococco alle stringhe del fattore von Willebrand prodotte sulla superficie di cellule endoteliali primarie umane differenziate sotto stress da taglio in condizioni di flusso definite. Questo protocollo può essere esteso alla visualizzazione dettagliata di specifiche strutture cellulari e alla quantificazione dei batteri applicando procedure di immunostaining differenziale.

Abstract

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L'interazione di Streptococcus pneumoniae con la superficie delle cellule endoteliali è mediata nel flusso sanguigno attraverso proteine meccanosensibili come il Von Willebrand Factor (VWF). Questa glicoproteina cambia la sua conformazione molecolare in risposta allo stress da taglio, esponendo così i siti di legame per un ampio spettro di interazioni ospite-ligando. In generale, la coltura delle cellule endoteliche primarie sotto un flusso di taglio definito è nota per promuovere la differenziazione cellulare specifica e la formazione di uno strato endoteliale stabile e strettamente collegato simile alla fisiologia del rivestimento interno di un vaso sanguigno . Pertanto, l'analisi funzionale delle interazioni tra patogeni batterici e la vascolatura ospite che coinvolge proteine meccanosensibili richiede l'istituzione di sistemi di pompaggio in grado di simulare le forze di flusso fisiologico note per influenzare la superficie cellule vascolari.

Il dispositivo microfluidico utilizzato in questo studio consente un ricircolo continuo e senza impulsi dei fluidi con una portata definita. Il sistema di pompaggio a pressione dell'aria controllato dal computer applica una sollecitazione di taglio definita sulle superfici delle cellule endote generando un flusso medio continuo, unidirezionale e controllato. I cambiamenti morfologici delle cellule e dell'attaccamento batterico possono essere monitorati e quantificati al microscopio nel flusso utilizzando speciali vetrini di canale progettati per la visualizzazione microscopica. A differenza dell'infezione da coltura cellulare statica, che in generale richiede una fissazione del campione prima dell'etichettatura immunitaria e delle analisi microscopiche, i vetrini microfluidici consentono sia il rilevamento basato sulla fluorescenza di proteine, batteri e componenti cellulari dopo la fissazione del campione; colorazione dell'immunofluorescenza seriale; e rilevamento diretto basato sulla fluorescenza in tempo reale. In combinazione con batteri fluorescenti e anticorpi specifici con etichettatura a fluorescenza, questa procedura di infezione fornisce un efficiente sistema di visualizzazione di componenti multipli per un enorme spettro di applicazioni scientifiche relative ai processi vascolari.

Introduzione

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La patogenesi delle infezioni da pneumococco è caratterizzata da un'interazione sfaccettata con una diversità di composti di matrice extracellulare e componenti dell'emostasi umana, come plasminogen e VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. La VWF glicoproteina multidominio funge da regolatore chiave di un'emostasi bilanciata mediando il reclutamento di trombociti e l'incorporazione di fibrina nel sito di formazione di trombosi vascolare9. L'importanza del VWF funzionale e attivo per il controllo delle emorragie e la guarigione delle ferite è dimostrata dalla malattia di von Willebrand, un comune disturbo ereditario del sanguinamento10.

Il VWF globulare circola nel sistema sanguigno umano ad una concentrazione fino a 14,0 g/mL11,10. In risposta alle lesioni vascolari, il rilascio locale di VWF da parte di Weibel Palade Bodies (WBP) endoteliale è notevolmente aumentatodi 11,12. Studi precedenti dimostrano che l'aderenza allo pneumococco alle cellule endoteliali umane e la sua produzione della pneumolysin tossina che formano i pori stimola noannamente la secrezione VWF luminale13. Le forze idrodinamiche del flusso sanguigno inducono un'apertura strutturale dei domini VWF meccanorenti. Con una portata di 10 dyn/cm2 il VWF si multimerisce a lunghe stringhe proteiche fino a diverse centinaia di micrometri di lunghezza che rimangono attaccate al subendotelio10,12.

Per comprendere la funzione delle stringhe VWF multimeriche generate sotto stress da taglio nell'interazione dello pneumococco con la superficie endoteliale, è stato stabilito un approccio di infezione da coltura cellulare basato su microfluidica. È stato utilizzato un dispositivo microfluidico con un sistema di pompa a pressione dell'aria controllato dal software. Ciò ha permesso un continuo, unidirezionale ricircolo del mezzo di coltura cellulare con una portata definita. Di conseguenza, il sistema ha applicato una sollecitazione di taglio definita sulla superficie delle cellule endoteliali, che sono rimaste attaccate all'interno di vetrini di canale specializzati. Questo approccio ha permesso la simulazione della forza di taglio all'interno del flusso sanguigno del sistema vascolare umano, in cui le stringhe VWF vengono generate su cellule endoteliali differenziate in condizioni di flusso costante definite. A tale scopo, le cellule endoteliali sono state coltivate in specifici vetrini di canale (vedi Tabella dei materiali), che sono stati adattati per analisi microscopiche durante il flusso. Il sistema di pompaggio microfluidico ha fornito la situazione di sollecitazione di taglio altamente definita e controllata necessaria per la formazione di corde VWF estese sullo strato di cellule endoteliali confluenti. Dopo la stimolazione della secrezione di VWF delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) coltivate confluentemente dal completamento dell'istamina, la formazione delle corde è stata indotta applicando uno stress da taglio di 10 disiniettorio2. La sollecitazione di taglio è definita come la forza che agisce sul livello della cella. Viene calcolato approssimativamente secondo Cornish et. al.14 con l'equazione 1:
figure-introduction-1

Dove , e lo stress da taglio in dyn/cm2, la viscosità (dyn s)/cm2, h , la metà dell'altezza del canale, la larghezza del canale e la metà della larghezza del canale e la linea di flusso in mL/min.

Il risultato dell'equazione 1 dipende dalle diverse altezze e larghezze delle diverse diapositive utilizzate (vedere Tabella dei materiali). In questo studio è stata utilizzata una diapositiva di canale Luer di 0,4 m risultante in un fattore di scorrimento della camera di 131,6 (vedere la formula 2).
figure-introduction-2

La viscosità del mezzo a 37 gradi centigradi è 0,0072 dynos/cm2 ed è stata utilizzata una sollecitazione di taglio di 10 dini/cm2. Ciò ha comportato una portata di 10,5 mL/min (vedi formula 3).
figure-introduction-3

Qui, l'adattamento e l'avanzamento di una procedura di coltura cellulare microfluidica utilizzando un sistema di flusso laminare unidirezionale per l'indagine e la visualizzazione dei meccanismi di infezione batterica nella vascolatura ospite è descritto in dettaglio. La generazione di stringhe VWF su strati endoteliali può essere stimolata anche utilizzando altri sistemi di pompaggio in grado di applicare una sollecitazione di taglio continua e costante15.

Dopo la coltivazione di cellule endoteliali primarie alla confluenza nel flusso e nella stimolazione della formazione delle corde VWF, gli pneumococci che esprimono la proteina di fluorescenza rossa (RFP)16 sono stati aggiunti allo strato di cellule endoteliali sotto costante controllo microscopico. L'attaccamento dei batteri alle stringhe VWF sulla superficie delle cellule endoteliali è stato visualizzato e monitorato al microscopio per un massimo di tre ore in tempo reale utilizzando anticorpi con etichettafluenza specifica VWF. Con questo approccio, il ruolo del VWF come cofattore di adesione che promuove l'attaccamento batterico all'endotelio vascolare è stato determinato8.

Oltre alla visualizzazione microscopica della secrezione proteica e ai cambiamenti conformazionali, questo metodo potrebbe essere utilizzato per monitorare singoli passaggi dei processi di infezione batterica in tempo reale e per quantificare la quantità di batteri collegati in diversi punti temporali di infezione. Lo specifico sistema di pompe software-controllato offre anche la possibilità di coltura le cellule endoteliali in condizioni di flusso costante definite per un massimo di diversi giorni e consente un'incubazione a flusso medio pulsato definito. Inoltre, questo metodo può essere applicato utilizzando diversi tipi di cella. L'adattamento del protocollo di colorazione consente anche il rilevamento e la visualizzazione di batteri interiorizzati in cellule eucariotiche.

Questo manoscritto descrive questo protocollo sperimentale avanzato che può essere utilizzato come approccio definito, affidabile e riproducibile per una caratterizzazione efficiente e versatile dei processi patofisiologici.

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Protocollo

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La coltivazione delle cellule microfluidiche è stata eseguita con cellule endoteliali otiliarie primarie commerciali (HUVEC). L'azienda ha isolato le cellule con il consenso informato del donatore. Questo studio è stato approvato dalla Camera etica dei medici del Baden-Wuerttemberg dello Stato federale con il numero di referenza 219-04.

NOT: Vedere Tabella dei materiali per le forniture di protocollo.

1. Precoltivazione delle cellule primarie

  1. Scongelare una fiala glicerol congelata contenente 1 x 105 HUVEC primario da tre donatori diversi delicatamente a 37 s e seminare le cellule in 7 mL di mezzo di crescita delle cellule endoteliali preriscaldate (ECGM, pronto per l'uso con integratori) in un flacone di 25 cme 2.
    NOT: Le cellule endoteliali primarie perdono capacità di differenziazione dopo più di 5 cicli di proliferazione. Pertanto, solo le cellule con meno di 5 passaggi possono essere utilizzate se sono necessari alti gradi di differenziazione cellulare.
  2. Coltivare le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera di CO2 del 5% per 60 min per consentire l'attaccamento superficiale e scambiare il mezzo di coltura cellulare ECGM per eliminare i residui della crioconservazione.
  3. Continuare a coltivare le cellule a 37 gradi centigradi nell'atmosfera di CO2 del 5% fino a formare uno strato di cellule subconfluenti.
    NOT: L'HUVEC non deve crescere fino a diventare uno strato confluente poiché i contatti cellulari stretti impediscono la formazione di uno strato cellulare stabile in seguito nel flusso.

2. Precoltivazione di Streptococcus pneumoniae

AVVISO: Streptococcus pneumoniae è un agente di livello 2 di biosicurezza e può essere coltivato solo nei laboratori di livello 2 di biosicurezza. Utilizzare una panca pulita classificata per il livello di sicurezza 2 per tutti i trattamenti batterici, evitare rigorosamente la formazione di aerosol e utilizzare una centrifuga con protezione dagli aerosol per la sedimentazione dei batteri.

  1. Inoculare una piastra di agar di sangue Columbia con Streptococcus pneumoniae clinica isolaATCC11733 derivata da uno stock di glicerolo costantemente conservato a -80 gradi centigradi e coltivare la piastra di agar durante la notte a 37 e 5% CO2.
  2. Preparare 40 mL di brodo liquido Todd Hewitt integrato con 1% di estratto di lievito (THY) e 15 mL di sterile fosfato-buffered (PBS) pH 7.4, per la coltivazione batterica e passaggi di lavaggio.
  3. Utilizzare un tubo sterile per la coltivazione batterica e inoculare il brodo di coltura liquida con massa batterica. Controllare la quantità di inoculazione mediante misurazione fotometrica di 1 mL aliquote a 600 nm rispetto al brodo liquido non inoculato come riferimento. Riempire la massa batterica nel brodo liquido fino a raggiungere una densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,15.
  4. Incubare il brodo liquido inoculato senza agitare a 37 e 5% di CO2 e determinare l'OD600 ogni 30 min misurando 1 mL di aliquote con cuvette di plastica.
  5. Non appena la coltura batterica ha raggiunto un OD600 di 0,4, che corrisponde alla fase di crescita esponenziale, centrifugare la sospensione della coltura batterica per 10 min a 1.000 x g a temperatura ambiente (RT).
    NOT: Non permettere a una coltura di pneumococco di raggiungere un OD600 di più di 1,0, perché un'alta densità di coltura dello pneumococco è noto per innescare l'autolisi batterica, che potrebbe influenzare la forma fisica batterica complessiva.
  6. Risospendere delicatamente i sedimenti batterici con PBS da 10 mL e di nuovo i sedimenti per 10 min a 1.000 x g a RT.
  7. Risospendere delicatamente i sedimenti batterici lavati in PBS da 1 mL e determinare l'OD600 di 10 -L della sospensione batterica utilizzando 1 mL di PBS come riferimento.
  8. Regolare la quantità di batteri in PBS in base a un OD600 di 2.0. Secondo il conteggio batterico precedentemente determinato, un OD600 di 2.0 corrisponde a 2 x 109 unità formanti colonia (CFU). Procedere immediatamente con la procedura di infezione per prevenire l'autolisi batterica.

3. Coltivazione di cellule endoteliali di HUVEC in condizioni microfluidiche

  1. Staccare le cellule endoteliali primarie dal pallone di coltura cellulare mediante proteolisi controllata. Eseguire i seguenti passaggi in un ambiente sterile utilizzando un banco pulito. Preparare un volume di 15 mL di PBS sterile per le fasi di lavaggio.
    1. Rimuovere l'ECGM da uno strato HUVEC coltivato in modo subconfluente e lavare lo strato cellulare con 10 mL PBS utilizzando una pipetta sierologica per sbarazzarsi del mezzo di coltura cellulare.
    2. Incubare l'HUVEC lavato con 3 mL di 37 gradi centigradi, soluzione di dissociazione cellulare preriscaldata per il distacco cellulare per 5 min a 37 gradi centigradi. Osservare il distacco delle cellule proteolitiche monitorando microscopico ogni minuto.
    3. Pipetta la sospensione cellulare staccata in un tubo contenente 7 mL di ECGM integrato con 2% siero di vitello fetale (FCS) per fermare la proteolisi e sedimentare le cellule per 3 min a 220 x g a RT.
    4. Rimuovere il supernatante e risospendere l'HUVEC in 250 gradi l di ECGM integrato con 5% FCS e 1 mM MgSO4. Utilizzare 10 volte la sospensione cellulare per il conteggio cellulare utilizzando una camera di conteggio delle celle Neubauer e regolare il numero di celle a 4 x 106 celle/mL ECGM integrato con 5% FCS e 1 mM MgSO4.
      NOT: Per ogni esperimento di flusso saranno necessari 30 mL di mezzo ECGM integrati con 5% FCS e 1 mM MgSO4. Da qui in questo medio composizionino si chiama ECGMS-medium. L'aumento della concentrazione di FCS nel mezzo di coltura dal 2% al 5% supporta l'attaccamento cellulare e la vitalità cellulare delle semi HUVEC nella diapositiva del canale. Il mezzo integratori FCS e MgSO4 sostanzialmente stabilizzare l'attaccamento cellulare di HUVEC in condizioni di stress taglio.
  2. Seme e coltivare l'HUVEC in uno scivolo di canale. Lavorare in un ambiente sterile utilizzando un banco pulito. Le cellule saranno coltivate sotto stress da taglio per 2 giorni seguite da infezione da batteri e monitoraggio microscopico per altri 2 h.
    1. E' uno scivolo a canale, un set di perfusione di 1,6 mm di diametro e 50 cm di lunghezza, un'aliquota del mezzo ECGMS e un canale di Luer di 0,4 m di altezza, per 24 h in un'incubatrice con 5% di CO2 atmosfera a 37 gradi centigradi per ridurre il numero di bolle d'aria.
      NOT: Questa procedura è consigliata per degas l'apparecchiatura plastica e per preriscaldare il mezzo, i tubi di perfusione, ei serbatoi. Se materiali o liquidi sono stati immagazzinati in RT o in frigorifero, i gas disciolti nella plastica e i liquidi saranno rilasciati quando vengono riscaldati nell'incubatrice durante l'esperimento. Appariranno poi le bolle di gas. Degassare tutti i componenti in plastica prima dell'esperimento eliminerà questo effetto. Ogni volta che il sistema viene estratto dall'incubatrice, il processo di assorbimento del gas ricomincia. Pertanto, lavorare rapidamente alla RT e non lasciare mai l'unità fluida al di fuori dell'incubatrice per periodi di tempo più lunghi.
    2. Utilizzare una pipetta per iniettare 100 -L di una soluzione di gelatina di porcivi filtrata sterile del 2% in soluzione PBS in uno dei serbatoi di uno scivolo di canale equilibrato a temperatura. Incubare la soluzione di gelatina per 1 h a 37 gradi centigradi e sciacquare il canale del vetrino con 1 mL di PBS in condizioni sterili utilizzando una siringa Luer da 1 mL.
    3. Posizionare il vetrino a canale rivestito di gelatina su una sottile piastra di polistirolo o polistirolo per evitare un calo della temperatura della diapositiva. Aggiungere 100 l of the 4 x 106/mL SUSPENSION HUVEC con una siringa Luer da 1 mL nello scivolo.
      NOT: Posizionare il vicolo di canale sulla superficie metallica fredda del banco pulito potrebbe diminuire la temperatura del fondo di scorrimento, generando così stress da freddo alle cellule endoteliali. Durante la pertintura cellulare tenere la diapositiva un po 'verso l'alto per consentire bolle d'aria salire e scomparire dall'interno della diapositiva.
    4. Incubare il vetrino del canale con l'HUVEC per 60 min a 37 e 5% di CO2 e riempire i serbatoi medi ad entrambe le estremità del vetrino del canale con 60 ECGMS-medium ciascuno. Incubare per 1 h a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
  3. Regolare la pompa microfluidica e le impostazioni del software.
    1. Collegare il set di perfusione equilibrata all'unità pompa, riempire con 13,6 mL di ECGMS-medio, e avviare il software di controllo della pompa. Selezionare il set di perfusione adeguato e il tipo di diapositiva della camera utilizzando le finestre scorrevoli verso il basso nel menu dell'unità fluidica impostata. Scegliete 0,007 (dyn s/cm2) nel software per una viscosità media. (Fare riferimento alle impostazioni del software della pompa di pressione contrassegnate con frecce rosse nella figura 1 supplementare).
    2. Al di fuori dell'incubatrice, collegare una bottiglia di vetro riempita con perline di silice essiccanti al tubo di pressione dell'aria (fare riferimento alla Figura 1, Inset 3). L'aria della pompa di pressione circola tra i serbatoi di perfusione e la pompa e deve essere asciutta prima di rientrare nel dispositivo di pompaggio. Selezionare Parametri di flusso nel menu del software, impostare la pressione a 40 mbar e lavare i tubi della pompa con il mezzo liquido avviando il flusso medio continuo. (Queste impostazioni sono indicate anche da frecce rosse nella figura supplementare 1).
    3. Programmare i cicli di sollecitazione di taglio desiderati di coltivazione del flusso. Iniziare con 5 dyn/cm2, controllare pompaggio serbatoio bilanciato e assicurare che nessuna bolla d'aria circolano nel sistema di pompaggio.
      NOT: La sollecitazione di taglio a parete in una diapositiva di canale dipende dalla portata e dalla viscosità del mezzo perfusione. Se si utilizza un altro sistema di pompaggio, fare riferimento alle equazioni descritte nell'introduzione per impostare una portata che genera il livello di sollecitazione di taglio desiderato. Le impostazioni descritte corrispondono a una portata di 5,42 mL/min. (una schermata esemplare che mostra le impostazioni appropriate dei parametri di flusso nel software della pompa di pressione è mostrata nella figura supplementare 2).
    4. Arrestare la circolazione del flusso nel software di controllo della pompa e mantenere il flusso medio nel tubo di perfusione bloccando i tubi vicino ai collegamenti Luer. Collegare lo scivolo del canale, evitando così le bolle d'aria, e posizionare l'unità fluida con la diapositiva di canale collegata in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi e 5% di CO2. Iniziare la sollecitazione di taglio a 5 dyn/cm2 per 30 min per adattare agevolmente le cellule alle forze generate dallo stress di taglio prima di accelerare il livello di sollecitazione di taglio (vedere Figura supplementare 3).
      NOT: Fare attenzione che nessuna bolla d'aria rimanga nel sistema di tubi o nel vetrino dopo il collegamento al sistema di tubi perché il movimento delle bolle d'aria nel flusso potrebbe portare al distacco delle cellule.
    5. Accelerare lo stress di taglio a 10 dyn/cm2 (che corrispondono a 10,86 mL/min in questa impostazione di flusso) e incubare il flusso del canale in sollecitazione di taglio continua per 48 h in una piccola incubatrice di CO2 a 37 e 5% CO2 per consentire la differenziazione cellulare ( i rispettivi settinngs software sono indicati con frecce rosse nella Figura 4 supplementare).
      NOT: Le cellule HUVEC tendono a staccarsi dalla superficie del canale se la coltivazione del flusso viene avviata direttamente a 10 dyn/cm2. Le cellule rimangono attaccate alla superficie della camera se la coltivazione del flusso viene avviata con meno sollecitazione di taglio utilizzando 5 dyn/cm2 per un minimo di 30 min seguito aumentando lentamente lo stress di taglio fino al desiderato 10 dyn/cm2. Una sollecitazione di taglio di 10 dyn/cm2 è il valore minimo in questa impostazione di perfusione necessaria per la formazione di stringhe VWF.
    6. Dopo 24 h di coltivazione cellulare microfluidica, arrestare il flusso medio con il software di controllo della pompa esattamente quando viene raggiunto un livello medio bilanciato in entrambi i serbatoi medi. Mettere l'unità fluidica in un panca pulito e rimuovere 10 mL del mezzo di coltivazione circolato dei serbatoi di perfusione utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Aggiungere 10 mL di ECGMS-medium nei serbatoi per rinnovare il mezzo, rimettere l'unità fluida nell'incubatrice di CO2 a 37 e 5% di CO2e riavviare la coltivazione fluidica utilizzando il software di controllo della pompa.
      NOT: La funzione della pompa di pressione può essere improvvisamente interrotta da macchine di laboratorio come grandi centrifughe, che potrebbero creare un forte disturbo del campo magnetico. Questa improvvisa interruzione potrebbe portare al distacco delle cellule. Fare attenzione che tali macchine non siano attive vicino alla pompa di pressione durante l'esperimento.
    7. Iniziare il preriscaldamento della camera di incubazione della temperatura che copre lo stadio del microscopio a fluorescenza a 37 gradi centigradi per l'equilibratura della temperatura 24 h prima della visualizzazione microscopica. Dopo aver preriscaldato il microscopio, avviare il controllo software del microscopio e regolare le impostazioni principali per il monitoraggio microscopico a fluorescenza selezionando le impostazioni di filtro appropriate (540 nm/590 nm per il rilevamento dei batteri che esprimono RFP e 470 nm/515 nm per il rilevamento dell'emissione di fluoresceina degli anticorpi specifici di VWF coniugati FITC). Preriscaldare una camera di riscaldamento supplementare per l'incubazione dell'unità fluidica a 37 gradi centigradi.
      NOT: Durante l'infezione analisi e monitoraggio microscopico la temperatura del vetrino del canale e il mezzo circolante non dovrebbe diminuire in modo sostanziale, perché questo genererebbe stress da freddo sulle cellule. In generale, la dimensione delle camere di temperatura che coprono lo stadio del microscopio non è sufficiente a coprire l'intera unità fluidica. Pertanto, si raccomanda l'uso di una camera di riscaldamento supplementare preriscaldata a 37 gradi centigradi.
    8. Per la visualizzazione microscopica, posizionare l'unità fluida nella camera di riscaldamento preriscaldata da 37 gradi centigradi e posizionare lo scivolo del canale su uno stadio del microscopio preriscaldato a 37 gradi centigradi.
      NOT: Per la visualizzazione microscopica, l'unità fluidica e lo scivolo canale dovevano essere rimossi dall'incubatrice di CO2 a causa della lunghezza limitata del tubo perfusione. Se i tempi di infezione e il monitoraggio microscopico superiore a 180 min sono necessari al di fuori dell'atmosfera di CO2 del 5% per il buffering del pH, è necessario utilizzare un mezzo tamponato per il pH per la coltivazione microfluidica.
    9. Controllare la morfologia cellulare e l'integrità dello strato HUVEC prima dell'iniezione di istamina e batteri alla circolazione del flusso durante il tempo dell'esperimento di flusso e dopo aver terminato l'esperimento di flusso utilizzando la modalità campo luminoso del microscopio.

4. Induzione del rilascio VWF e visualizzazione di stringhe VWF multimerizzate

  1. Mantenere l'impostazione del flusso, poiché è necessaria una sollecitazione di taglio di 10 dyn/cm2 per attivare la multimerizzazione di VWF a stringhe lunghe fino a 200 MDa. Indurre il rilascio di VWF da WPB endoteliale iniettando 136 -L di una soluzione di stock di istamina da 100 mM nel mezzo ECGMS circolante nel tubo di perfusione utilizzando una porta di iniezione. La concentrazione finale di istamina nel mezzo di flusso sarà di 1 mM. Se non è disponibile alcuna porta di iniezione, l'istamina può essere aggiunta alternativamente pipettando nel mezzo dei serbatoi di pompaggio.
  2. Per il rilevamento immunofluorescenza di stringhe VWF multimerizzate, arrestare il flusso quando viene raggiunto un livello medio bilanciato nei serbatoi e iniettare 20 g di un anticorpo coniugato specifico di VWF in un volume di 200L PBS (pH 7.4) nel ECGMS-medium utilizzando una porta di iniezione. Se non è disponibile alcuna porta di iniezione, l'anticorpo può essere aggiunto alternativamente pipetting nel mezzo dei serbatoi di pompa. Ciò si traduce in una concentrazione finale di anticorpi di 1,3 g/mL.
  3. Per la scansione microscopica di diversi campi visivi in breve tempo, utilizzare l'unità di fluorescenza del microscopio con un dispositivo di fluorescenza Xenon al 30% di potenza e una fotocamera a epiorescenza. Monitorare la forma e la morfologia del livello HUVEC con la modalità campo luminoso per selezionare le celle rappresentative adatte per la visualizzazione delle stringhe VWF.
  4. Per la visualizzazione delle stringhe VWF fluorescenti verdi, selezionare un obiettivo di olio 63x/1.40 e un filtro di rilevamento di 470 nm nel menu dell'unità di fluorescenza del software al microscopio (LasX). Creare istantanee di stack z di almeno 50 viste di campo rappresentative, ognuna contenente circa 10 HUVEC morfologicamente intatto. Per la quantificazione delle stringhe VWF fluorescenti verdi in punti temporali diversi, eseguire la scansione di diversi campi visivi.

5. Valutazione microscopica dell'attaccamento batterico alle stringhe VWF in flusso in tempo reale

  1. Quantificare l'attaccamento pneumococcico alle stringhe VWF generate sulle superfici cellulari HUVEC tramite il rilevamento dell'immunofluorescenza.
    1. Tenere il flusso e iniettare pneumococci di 1,35 x 108 CFU/mL RFP in un volume massimo di 1 mL nel mezzo ECGMS utilizzando la porta di iniezione. In alternativa, pipette i batteri nel mezzo nel serbatoio della pompa. Riavviare lo stress di taglio a 10 dyn/cm2 per far circolare i batteri all'interno del sistema di pompaggio.
    2. Selezionare un obiettivo di immersione dell'olio 63x per l'ingrandimento del microscopio e regolare le impostazioni del filtro a fluorescenza nel software del microscopio sul canale RFP (filtro di rilevamento 540 nm) per il rilevamento di pneumococci che esprime RFP.
    3. Per la quantificazione dell'attaccamento batterico alle stringhe VWF, arrestare il flusso e creare istantanee di stack z di almeno 30 viste di campo rappresentative, ognuna contenente circa 10 HUVEC morfologicamente intatti, e contare la quantità di pneumococci.
    4. Utilizzare l'algoritmo delle statistiche unfattoriali ANOVA per valutare i dati, seguito da un test di campione non accoppiato a due code post hoc per un confronto statistico dettagliato. I valori P di <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

6. Valutazione microscopica dell'attaccamento batterico alle corde VWF dopo la fissazione del campione

  1. Campionare la fissazione prima della colorazione dell'immunofluorescenza.
    1. Arrestare il flusso, rimuovere 10 mL di ECGMS-medio dai serbatoi di pompaggio, e aggiungere 10 mL di PBS integrato con 5% paraformaldeide (PFA). Lasciare circolare la soluzione PFA per 10 min ad uno stress di taglio di 10 dyn/cm2.
    2. Scollegare lo scivolo del canale dall'unità di pompa.
  2. Bloccare siti di legame non specifici sulla superficie cellulare ed eseguire il rilevamento immuno-rilevamento delle stringhe VWF e dei batteri collegati.
    1. Preparare 4 mL di una soluzione di lavaggio contenente 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) integrata con il 4% di saccarosio per tutte le fasi di lavaggio. Preparare 1 mL di una soluzione di blocco contenente 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) integrata con il 4% di saccarosio e il 2% di albumina di siero bovino (BSA) per il blocco di siti di legame non specifici.
    2. Lavare lo scivolo a canale 3x incubato pFA utilizzando una siringa Luer da 1 mL per iniettare 200 l della soluzione di lavaggio e incubare lo scivolo per 120 min a RT con soluzione di blocco di 200 .L.
    3. Preparare 4 mL di un'altra soluzione di blocco contenente 100 mM Na2CO3, (pH 9.2) integrata con il 4% di saccarosio e lo 0,5% di BSA per la diluizione degli anticorpi. Utilizzare 200 - L di questa soluzione di blocco per diluire l'antisiero di coniglio specifico per lo pneumococco 1:100. Utilizzare 200 l di questa soluzione di blocco per diluire l'anticorpo del mouse specifico di VWF 1:50 per creare una concentrazione di anticorpi specifica di VWF pari a 4 g/mL. Diluire l'anticorpo secondario coniugato AlexaFluor488 da una soluzione di riserva da 2 mg/mL 1:100 in 200 -L di PBS (pH 7.4) per generare una concentrazione finale di 20g/mL.
      NOT: Nelle impostazioni di immunofluorescenza descritte, il rilevamento degli anticorpi ha fornito risultati ottimali quando gli anticorpi sono stati diluiti nel suddetto buffer di carbonato alcalino. Sulla base dei risultati precedenti, le soluzioni di blocco consigliate e la quantità di anticorpi sono adatte per molte applicazioni. Tuttavia, diversi esperimenti potrebbero richiedere l'ottimizzazione individuale della combinazione di anticorpi, concentrazione di anticorpi, tempo di incubazione e costituzione del buffer di blocco. In alternativa, un sistema con buffer di fosfato con un intervallo di pH neutro potrebbe essere adatto o addirittura preferito come buffer di incubazione. In caso di deboli segnali di fluorescenza, la concentrazione di anticorpi secondari dovrebbe essere aumentata. Se viene rilevato troppo rumore di fondo a fluorescenza non specifica, la quantità di sostanze bloccanti deve essere aumentata.
    4. Per la colorazione VWF-immunofluorescence, lavare la diapositiva del canale utilizzando una siringa Luer da 1 mL iniettando 200 l della soluzione di lavaggio 3x e incubare il vetrino con l'anticorpo specifico VWF diluito 1:50 per 30 min a RT. In seguito, lavare nuovamente il canale 3x con 200 Ll della soluzione di lavaggio e incubare lo scivolo con l'anticorpo diluito AlexaFluor488-formigò specifico del mouse per 30 min a RT. Infine, lavare di nuovo lo scivolo del canale 3x con 200 l della soluzione di lavaggio.
      NOT: Gli AlexaFluor-fluorofori sono sensibili allo sbiancamento. Pertanto, il vetrino deve essere protetto tenendolo in una camera oscura durante le fasi di incubazione con gli anticorpi coniugati a fluoroforo.
    5. Per l'immunorilevamento degli pneumococchi, incubare lo scivolo con un anticorpo di coniglio specifico per pneumococcus diluito per 30 min a RT. Successivamente, lavare la diapositiva del canale 3x con 200 L della soluzione di lavaggio e incubare lo scivolo con 1:100 diluito Anticorpo specifico per coniglio coniugato AlexaFluor568 per 30 min a RT. Lavare nuovamente lo scivolo del canale 3x con 200 l della soluzione di lavaggio.
    6. Per macchiare il citoscheletro di actina cellulare con phalloidina fluorescente, permeabilizzare l'HUVEC per incubazione con 120 gradi L dello 0,1% Triton X-100 per 5 min a RT. Lavare lo scivolo del canale 3x con 200 gradi l della soluzione di lavaggio e incubare lo scivolo con 120 . Phalloidingiugone alfaficata AlexaFluor350. Questa fase di incubazione visualizzerà il citoscheletro actina polimerizzato e permetterà il monitoraggio della forma cellulare e dei possibili cambiamenti morfologici indotti dallo stress.
    7. Lavare lo scivolo del canale 3x con 200 l della soluzione di lavaggio. Infine, lavare la diapositiva 4x con 200 s L ddH2O e visualizzare le corde VWF fluorescenti verdi, i batteri fluorescenti rossi e il citoscheletro afluorescente blu utilizzando le impostazioni di filtro appropriate al microscopio a fluorescenza.

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Risultati

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La culminazione dell'HUVEC primario in un flusso unidirezionale costante comporta la formazione di uno strato cellulare confluente e strettamente imballato che promuove la generazione di MDB cellulari riempiti con il VWF meccanosensibile13,14. Questo protocollo descrive l'uso di un sistema di ricircolo senza impulsi basato sulla pressione dell'aria per l'analisi delle infezioni che richiede di imitare la situazione di stress da taglio nel flusso sanguigno umano.<...

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Discussione

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La simulazione dell'interazione batterica con proteine ospiti meccanosensibili come VWF richiede un sistema di coltura cellulare perffubile che consente la generazione di un flusso definito, unidirezionale e continuo di liquidi, generando così uno stress di taglio affidabile . Sono già stati descritti diversi sistemi di pompe microfluidiche. Una revisione completa di Bergmann et al. riassume gli aspetti chiave dei diversi modelli di coltura cellulare bidimensionali e tridimensionali17.

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il progetto è stato finanziato dal DFG (BE 4570/4-1) a S.B.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa Luer da 1 mLScientific10303002con volume di 1 mL per l'iniezione di gelatina utilizzando la connessione luer dei vetrini
Siringa Luer da 2 mLSarstedt9077136Per il pietting/iniezione di fluidi nelle connessioni luer dei vetrini della camera del canale
AccutaseeBioscience ora thermo fisher00-4555-56miscela di proteasi utilizzata per il distacco delicato delle cellule endoteliali
AlexaFluor350-falloidina coniugataAbcamab176751nessuna concentrazione disponibile dal produttore, la soluzione madre è sufficiente per 300 tets, l'azienda consiglia di utilizzare 100 µ L di diluizione 1:1.000, fluorescenza blu (impostazioni del filtro DAPI)
AlexaFluor488-coniugato anticorpo di capra derivato dal topoThermo Fisher SientificA11001concentrazione di riserva: 2 mg/mL per l'immunocolorazione del VWF umano in vetrino microfluidico dopo fissazione di PFA, fluorescenza verde
AlexaFluor568-coniugato anticorpo di capra ThermoFisher ScientificA-11011Concentrazione madre: 2 mg/mL per l'immunocolorazione degli pneumococchi in vetrini microfluidici dopo fissazione con pFA, fluorescenza rossa
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210terreno di coltura batterica complessa
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma AldrichA2153-25Gsolubilizzata, per la preparazione di tampone bloccante
Fiasche per colture cellulari con filtroTPP90026sottocoltura di HUVEC in fiasche di coltura cellulare non rivestite da 25 cm2
superficie Centrifuga Allegra X-12RBeckman Coulter Life Sciences392304la centrifuga dei batteri (volumi di >2mL)
Centrifuga Allegra X-30Beckman Coulter Life SciencesB06314la centrifuga delle cellule eucariotiche
Centrifuga Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 Mspin-down di batteri (volumi inferiori a 2 mL)
CloramfenicoloCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3886.2utilizzato in una concentrazione di 0,2 mg/mL per la coltivazione di pneumococchi trasformati con costrutto genetico che trasporta la proteina fluorescente rossa e cassetta di resistenza al cloramfenicolo
Morsetto per tubo di perfusioneibidi10821per trattenere il liquido nel tubo prima di collegare il vetrino al sistema di pompaggio
CO2-incubatoreFisher ScientificMIDI 40si adattano perfettamente alle dimensioni dell'unità fluidica con scivolo a canale collegato ed è stato utilizzato per la coltivazione a flusso a 37 ° C e 5% CO2
CO2-incubatoreSanyoMCO-18 AICper l'incubazione di batteri e cellule in atmosfera definita al 5% di CO2 e 37 ° C
Piastre di agar sangue ColombiaBecton Dickinson GmbHPA-254005.06Terreno di coltura complesso a base di agar per S. pneumoniae integrato con sangue di pecora al 7%
ComputerDellLatitude 3440Comuter con software per pompa a pressione
Microscopio a scansione laser confocale (CLSM)LeicaDMi8Un microscopio inverso con un tavolino coperto da una camera riscaldabile e con un'unità di fluorescenza dotata di filtro a fluorescenza, sorgente di luce allo xeno (SP8, DMi8) e DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1,4 Megapixel)
Di Potassio idrogeno fosfato (KH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3904.1utilizzato per tampone PBS
Materiale di essiccazioneMerck101969perle di silice arancioni per l'essiccazione utilizzate in una bottiglia di vetro con un adattatore per tubi
Integratore ECGM MixPromocellC-39215miscela di integratori per ECGM -medium, necessaria per la precoltivazione di cellule endoteliali: 0,02 mL/mL Siero fetale di vitello, 0,004 mL/mL integratore per la crescita delle cellule endoteliali, 0,1 ng/mL fattore di crescita epidermico, 1 ng/mL di fattore di crescita basico dei fibroblasti, 90 µ g/mL di eparina, 1 µ g/mL ECGM con idrocortisone
PromocellC-22010ECGM integrato con il 5% [p/p] di FCS e 1 mM di MgSO4 per aumentare l'adesione cellulare
Terreno di crescita delle cellule endoteliali (ECGM, pronto all'uso)PromocellC-22010di HUVECs, già integrato con tutti i componenti del mix di integratori
Fetal Calf Serum (FCS)biochrome ora MerckS 0415integratore per colture cellulari, utilizzato per analisi delle infezioni
anticorpo VWF di capra coniugato con FIT Anticorpo umanoAbcamab8822Concentrazione madre: 10 mg/mL, per l'immunorilevazione di VWF globulare e multimerizzato in flusso
Unità fluidicaibidi10903unità fluidica per la coltivazione a flusso
Gelatina (suina)Sigma AldrichG-1890-100gper il prerivestimento della superficie del canale del microscivolo
Istamina dicloridratoSigma AldrichH-7250-10MGper l'induzione della secrezione di VWF da corpi endoteliali Weibel Palade
Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-Nr. 396Z042cellule endoteliali primarie da donatore aggregato, conservate cripcoconservate in azoto liquido
Anticorpo umano specifico per VWF derivato da topo (monoclonale)Santa Cruzsc73268Concentrazione di riserva: 200 &Micro; g/mL per l'immunocolorazione del VWF in vetrino microfluidico dopo la fissazione con PFA
Portadi iniezione ibidi10820per l'iniezione di istamina o batteri nel tubo del serbatoio durante la circolazione del flusso
Microscopio otticoZeissAxiovert 35Mmicroscopio a luce inversa per il controllo del distacco di cellule eucariotiche e del conteggio delle cellule utilizzando un obiettivo ad acqua 40x che consente un ingrandimento
400xVetrini Luer I0.4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176vetrini modificati fisicamente per la coltivazione fludica (μ – Slitta I0,4Luer con un'altezza del canale di 0,4 mm, un volume del canale di 100 μ l, un'area di crescita di 2,5 cm e un'area di rivestimento di 25,4 cm2) adatto a tutti i tipi di test a flusso, il trattamento fisico genera una superficie idrofila e adesiva.
Solfato di magnesio (MgSO4, non idratato)Sigma AldrichM7506-500GPer la preparazione di ECGMS medium
Pompa microfluidicaibidi10905pompa a pressione d'aria
Neubauer camera di conteggio cellulareKarl Hecht GmbH& Co KG40442002camera di conteggio microscopica per HUVECs
Paraformaldeide 16% (PFA)Microscopia elettronica Sciences15710-Sper la reticolazione dei campioni
Perfusion Setibidi10964Perfusion Set Yellow/Green ha un diametro del tubo di 1,6 mm, una lunghezza del tubo di 50 cm, un volume di lavoro totale di 13,6 mL, un volume del tubo morto di 2,8 mL e una dimensione del serbatoio di 10 mL. combinato con il µ-slide L0.4Luer, a 37 ° C e una viscosità di 0,0072 dyn x s/cm2 si può raggiungere un intervallo di portata da 3,8 mL/min fino a 33,9 mL/min e uno sforzo di taglio compreso tra 3,5 dyn/cm2 e 31,2 dyn/cm2. con una lunghezza di 50 cm per
soluzione salina tamponata con fosfato microfluidico (PBS),la soluzione è stata preparata utilizzando le seguenti sostanze chimiche: 0,2 g/L di KCl, 1,44 g/L di Na2HPO4, 0,24 g/L di KH2PO4 , pH 7,4
Cuvette in plasticaSarstedt67.741(2 x ottiche) per la misurazione di OD a 600 nm
Antisiero specifico per lo pneumococcoPinedaallevato in coniglio utilizzando Streptococcus pneumoniae NCTC10319 e D39 inattivati termicamente, purificati con colonna di proteina-sefarosio.
polistirene o polistirolo:questa è una precauzione per evitare stress da freddo sulle cellule seminate nei vetrini del canale. È possibile utilizzare qualsiasi tipo di polistirolo, come il materiale della scatola di imballaggio. Il piatto può avere uno spessore di 0,5 cm e dovrebbe avere una dimensione di 20 cm2.
Cloruro di potassio (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe6781.1utilizzato per il tampone PBS
Software di controllo della pompa (PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4Software per computer per il controllo della pompa a pressione, l'impostazione delle condizioni di flusso e l'avvio/fine del flusso
Provette di reazione 1,5/2,0 mLSarstedt72.706/ 72.695.500necessarie per le diluizioni degli anticorpi
Provette di reazione da 50 mL volumeSarstedt6,25,48,004
pneumococchi che esprimono RFPNational Collection of Type Cultures, Public Health England10,319Streptococcus pneumoniae sierotipo 47 che esprime RFP fuso con una proteina simile all'aistono integrata nel genoma
Pipette sierologiche 5, 10 mLSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025per il pipettaggio di volumi maggiori
Carbonato di sodio (Na2CO3, senza acqua)Sigma Aldrich451614-25Gper la preparazione di 100 mM di tampone carbonato di sodio
Diidrogeno fosfato (NaH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2utilizzato per il tampone PBS
Fotometro spettrale Libra S22Biochrom80-2115-20misura della densità ottica (OD) della sospensione batterica a 600 nm
SaccarosioSigma AldrichS0389-500Gper la preparazione del tampone bloccante
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLUtilizzato in concentrazione finale dello 0,1% diluito in dH20 per la permeabilizzazione delle cellule eucariotiche dopo la fissazione con PFA
Estratto di lievitoossoideLP0021i batteri sono coltivati in THB integratore con l'1% [p/p] di estratto di lievito = terreno di coltura batterico completo THY
Fisher Le dimensioni dell'incubatore Terreno di coltura Piastra in

Riferimenti

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