Questo studio descrive il monitoraggio microscopico dell'aderenza allo pneumococco alle stringhe del fattore von Willebrand prodotte sulla superficie di cellule endoteliali primarie umane differenziate sotto stress da taglio in condizioni di flusso definite. Questo protocollo può essere esteso alla visualizzazione dettagliata di specifiche strutture cellulari e alla quantificazione dei batteri applicando procedure di immunostaining differenziale.
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Articolo metodologico
Infezione da pneumococco delle cellule primarie endoteliali nel flusso costante
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'interazione di Streptococcus pneumoniae con la superficie delle cellule endoteliali è mediata nel flusso sanguigno attraverso proteine meccanosensibili come il Von Willebrand Factor (VWF). Questa glicoproteina cambia la sua conformazione molecolare in risposta allo stress da taglio, esponendo così i siti di legame per un ampio spettro di interazioni ospite-ligando. In generale, la coltura delle cellule endoteliche primarie sotto un flusso di taglio definito è nota per promuovere la differenziazione cellulare specifica e la formazione di uno strato endoteliale stabile e strettamente collegato simile alla fisiologia del rivestimento interno di un vaso sanguigno . Pertanto, l'analisi funzionale delle interazioni tra patogeni batterici e la vascolatura ospite che coinvolge proteine meccanosensibili richiede l'istituzione di sistemi di pompaggio in grado di simulare le forze di flusso fisiologico note per influenzare la superficie cellule vascolari.
Il dispositivo microfluidico utilizzato in questo studio consente un ricircolo continuo e senza impulsi dei fluidi con una portata definita. Il sistema di pompaggio a pressione dell'aria controllato dal computer applica una sollecitazione di taglio definita sulle superfici delle cellule endote generando un flusso medio continuo, unidirezionale e controllato. I cambiamenti morfologici delle cellule e dell'attaccamento batterico possono essere monitorati e quantificati al microscopio nel flusso utilizzando speciali vetrini di canale progettati per la visualizzazione microscopica. A differenza dell'infezione da coltura cellulare statica, che in generale richiede una fissazione del campione prima dell'etichettatura immunitaria e delle analisi microscopiche, i vetrini microfluidici consentono sia il rilevamento basato sulla fluorescenza di proteine, batteri e componenti cellulari dopo la fissazione del campione; colorazione dell'immunofluorescenza seriale; e rilevamento diretto basato sulla fluorescenza in tempo reale. In combinazione con batteri fluorescenti e anticorpi specifici con etichettatura a fluorescenza, questa procedura di infezione fornisce un efficiente sistema di visualizzazione di componenti multipli per un enorme spettro di applicazioni scientifiche relative ai processi vascolari.
Introduzione
La patogenesi delle infezioni da pneumococco è caratterizzata da un'interazione sfaccettata con una diversità di composti di matrice extracellulare e componenti dell'emostasi umana, come plasminogen e VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. La VWF glicoproteina multidominio funge da regolatore chiave di un'emostasi bilanciata mediando il reclutamento di trombociti e l'incorporazione di fibrina nel sito di formazione di tr....
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Protocollo
La coltivazione delle cellule microfluidiche è stata eseguita con cellule endoteliali otiliarie primarie commerciali (HUVEC). L'azienda ha isolato le cellule con il consenso informato del donatore. Questo studio è stato approvato dalla Camera etica dei medici del Baden-Wuerttemberg dello Stato federale con il numero di referenza 219-04.
NOT: Vedere Tabella dei materiali per le forniture di protocollo.
1. Precoltivazione delle cellule primarie
- Scongelare una fiala glicerol congelata contenente 1 x 105 HUVEC primario da tre donatori diversi delicatament....
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Risultati
La culminazione dell'HUVEC primario in un flusso unidirezionale costante comporta la formazione di uno strato cellulare confluente e strettamente imballato che promuove la generazione di MDB cellulari riempiti con il VWF meccanosensibile13,14. Questo protocollo descrive l'uso di un sistema di ricircolo senza impulsi basato sulla pressione dell'aria per l'analisi delle infezioni che richiede di imitare la situazione di stress da taglio nel flusso sanguigno umano.<.......
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Discussione
La simulazione dell'interazione batterica con proteine ospiti meccanosensibili come VWF richiede un sistema di coltura cellulare perffubile che consente la generazione di un flusso definito, unidirezionale e continuo di liquidi, generando così uno stress di taglio affidabile . Sono già stati descritti diversi sistemi di pompe microfluidiche. Una revisione completa di Bergmann et al. riassume gli aspetti chiave dei diversi modelli di coltura cellulare bidimensionali e tridimensionali17.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il progetto è stato finanziato dal DFG (BE 4570/4-1) a S.B.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa Luer da 1 mL | Scientific | 10303002 | con volume di 1 mL per l'iniezione di gelatina utilizzando la connessione luer dei vetrini |
| Siringa Luer da 2 mL | Sarstedt | 9077136 | Per il pietting/iniezione di fluidi nelle connessioni luer dei vetrini della camera del canale |
| Accutase | eBioscience ora thermo fisher | 00-4555-56 | miscela di proteasi utilizzata per il distacco delicato delle cellule endoteliali |
| AlexaFluor350-falloidina coniugata | Abcam | ab176751 | nessuna concentrazione disponibile dal produttore, la soluzione madre è sufficiente per 300 tets, l'azienda consiglia di utilizzare 100 µ L di diluizione 1:1.000, fluorescenza blu (impostazioni del filtro DAPI) |
| AlexaFluor488-coniugato anticorpo di capra derivato dal topo | Thermo Fisher Sientific | A11001 | concentrazione di riserva: 2 mg/mL per l'immunocolorazione del VWF umano in vetrino microfluidico dopo fissazione di PFA, fluorescenza verde |
| AlexaFluor568-coniugato anticorpo di capra Thermo | Fisher Scientific | A-11011 | Concentrazione madre: 2 mg/mL per l'immunocolorazione degli pneumococchi in vetrini microfluidici dopo fissazione con pFA, fluorescenza rossa |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | terreno di coltura batterica complessa |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilizzata, per la preparazione di tampone bloccante |
| Fiasche per colture cellulari con filtro | TPP | 90026 | sottocoltura di HUVEC in fiasche di coltura cellulare non rivestite da 25 cm2 |
| superficie Centrifuga Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | la centrifuga dei batteri (volumi di >2mL) |
| Centrifuga Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | la centrifuga delle cellule eucariotiche |
| Centrifuga Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 - Z 216 M | spin-down di batteri (volumi inferiori a 2 mL) |
| Cloramfenicolo | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | utilizzato in una concentrazione di 0,2 mg/mL per la coltivazione di pneumococchi trasformati con costrutto genetico che trasporta la proteina fluorescente rossa e cassetta di resistenza al cloramfenicolo |
| Morsetto per tubo di perfusione | ibidi | 10821 | per trattenere il liquido nel tubo prima di collegare il vetrino al sistema di pompaggio |
| CO2-incubatore | Fisher Scientific | MIDI 40 | si adattano perfettamente alle dimensioni dell'unità fluidica con scivolo a canale collegato ed è stato utilizzato per la coltivazione a flusso a 37 ° C e 5% CO2 |
| CO2-incubatore | Sanyo | MCO-18 AIC | per l'incubazione di batteri e cellule in atmosfera definita al 5% di CO2 e 37 ° C |
| Piastre di agar sangue Colombia | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | Terreno di coltura complesso a base di agar per S. pneumoniae integrato con sangue di pecora al 7% |
| Computer | Dell | Latitude 3440 | Comuter con software per pompa a pressione |
| Microscopio a scansione laser confocale (CLSM) | Leica | DMi8 | Un microscopio inverso con un tavolino coperto da una camera riscaldabile e con un'unità di fluorescenza dotata di filtro a fluorescenza, sorgente di luce allo xeno (SP8, DMi8) e DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1,4 Megapixel) |
| Di Potassio idrogeno fosfato (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | utilizzato per tampone PBS |
| Materiale di essiccazione | Merck | 101969 | perle di silice arancioni per l'essiccazione utilizzate in una bottiglia di vetro con un adattatore per tubi |
| Integratore ECGM Mix | Promocell | C-39215 | miscela di integratori per ECGM -medium, necessaria per la precoltivazione di cellule endoteliali: 0,02 mL/mL Siero fetale di vitello, 0,004 mL/mL integratore per la crescita delle cellule endoteliali, 0,1 ng/mL fattore di crescita epidermico, 1 ng/mL di fattore di crescita basico dei fibroblasti, 90 µ g/mL di eparina, 1 µ g/mL ECGM con idrocortisone |
| Promocell | C-22010 | ECGM integrato con il 5% [p/p] di FCS e 1 mM di MgSO4 per aumentare l'adesione cellulare | |
| Terreno di crescita delle cellule endoteliali (ECGM, pronto all'uso) | Promocell | C-22010 | di HUVECs, già integrato con tutti i componenti del mix di integratori |
| Fetal Calf Serum (FCS) | biochrome ora Merck | S 0415 | integratore per colture cellulari, utilizzato per analisi delle infezioni |
| anticorpo VWF di capra coniugato con FIT Anticorpo umano | Abcam | ab8822 | Concentrazione madre: 10 mg/mL, per l'immunorilevazione di VWF globulare e multimerizzato in flusso |
| Unità fluidica | ibidi | 10903 | unità fluidica per la coltivazione a flusso |
| Gelatina (suina) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | per il prerivestimento della superficie del canale del microscivolo |
| Istamina dicloridrato | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | per l'induzione della secrezione di VWF da corpi endoteliali Weibel Palade |
| Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | cellule endoteliali primarie da donatore aggregato, conservate cripcoconservate in azoto liquido |
| Anticorpo umano specifico per VWF derivato da topo (monoclonale) | Santa Cruz | sc73268 | Concentrazione di riserva: 200 &Micro; g/mL per l'immunocolorazione del VWF in vetrino microfluidico dopo la fissazione con PFA |
| Porta | di iniezione ibidi | 10820 | per l'iniezione di istamina o batteri nel tubo del serbatoio durante la circolazione del flusso |
| Microscopio ottico | Zeiss | Axiovert 35M | microscopio a luce inversa per il controllo del distacco di cellule eucariotiche e del conteggio delle cellule utilizzando un obiettivo ad acqua 40x che consente un ingrandimento |
| 400xVetrini Luer I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | vetrini modificati fisicamente per la coltivazione fludica (μ – Slitta I0,4Luer con un'altezza del canale di 0,4 mm, un volume del canale di 100 μ l, un'area di crescita di 2,5 cm e un'area di rivestimento di 25,4 cm2) adatto a tutti i tipi di test a flusso, il trattamento fisico genera una superficie idrofila e adesiva. |
| Solfato di magnesio (MgSO4, non idratato) | Sigma Aldrich | M7506-500G | Per la preparazione di ECGMS medium |
| Pompa microfluidica | ibidi | 10905 | pompa a pressione d'aria |
| Neubauer camera di conteggio cellulare | Karl Hecht GmbH& Co KG | 40442002 | camera di conteggio microscopica per HUVECs |
| Paraformaldeide 16% (PFA) | Microscopia elettronica Sciences | 15710-S | per la reticolazione dei campioni |
| Perfusion Set | ibidi | 10964 | Perfusion Set Yellow/Green ha un diametro del tubo di 1,6 mm, una lunghezza del tubo di 50 cm, un volume di lavoro totale di 13,6 mL, un volume del tubo morto di 2,8 mL e una dimensione del serbatoio di 10 mL. combinato con il µ-slide L0.4Luer, a 37 ° C e una viscosità di 0,0072 dyn x s/cm2 si può raggiungere un intervallo di portata da 3,8 mL/min fino a 33,9 mL/min e uno sforzo di taglio compreso tra 3,5 dyn/cm2 e 31,2 dyn/cm2. con una lunghezza di 50 cm per |
| soluzione salina tamponata con fosfato microfluidico (PBS), | la soluzione è stata preparata utilizzando le seguenti sostanze chimiche: 0,2 g/L di KCl, 1,44 g/L di Na2HPO4, 0,24 g/L di KH2PO4 , pH 7,4 | ||
| Cuvette in plastica | Sarstedt | 67.741 | (2 x ottiche) per la misurazione di OD a 600 nm |
| Antisiero specifico per lo pneumococco | Pineda | allevato in coniglio utilizzando Streptococcus pneumoniae NCTC10319 e D39 inattivati termicamente, purificati con colonna di proteina-sefarosio. | |
| polistirene o polistirolo: | questa è una precauzione per evitare stress da freddo sulle cellule seminate nei vetrini del canale. È possibile utilizzare qualsiasi tipo di polistirolo, come il materiale della scatola di imballaggio. Il piatto può avere uno spessore di 0,5 cm e dovrebbe avere una dimensione di 20 cm2. | ||
| Cloruro di potassio (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | utilizzato per il tampone PBS |
| Software di controllo della pompa (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Software per computer per il controllo della pompa a pressione, l'impostazione delle condizioni di flusso e l'avvio/fine del flusso |
| Provette di reazione 1,5/2,0 mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | necessarie per le diluizioni degli anticorpi |
| Provette di reazione da 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| pneumococchi che esprimono RFP | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | Streptococcus pneumoniae sierotipo 47 che esprime RFP fuso con una proteina simile all'aistono integrata nel genoma |
| Pipette sierologiche 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | per il pipettaggio di volumi maggiori |
| Carbonato di sodio (Na2CO3, senza acqua) | Sigma Aldrich | 451614-25G | per la preparazione di 100 mM di tampone carbonato di sodio |
| Diidrogeno fosfato (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | utilizzato per il tampone PBS |
| Fotometro spettrale Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | misura della densità ottica (OD) della sospensione batterica a 600 nm |
| Saccarosio | Sigma Aldrich | S0389-500G | per la preparazione del tampone bloccante |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Utilizzato in concentrazione finale dello 0,1% diluito in dH20 per la permeabilizzazione delle cellule eucariotiche dopo la fissazione con PFA |
| Estratto di lievito | ossoide | LP0021 | i batteri sono coltivati in THB integratore con l'1% [p/p] di estratto di lievito = terreno di coltura batterico completo THY |
Riferimenti
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
- Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152
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Ristampe e permessi
