Questo articolo descrive un metodo per coltivare e analizzare le escrescenze glomeriane delle cellule epiteliali glomeriali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare i percorsi coinvolti nella proliferazione e migrazione delle cellule epiteliali parietali.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Escrescenza glomerare come un'analisi di Ex Vivo per analizzare i percorsi coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali Parietali
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'attivazione delle cellule epiteliali parietali (PEC) è uno dei fattori chiave coinvolti nello sviluppo e nella progressione della glorulosclerosi. L'inibizione delle vie coinvolte nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali potrebbe quindi essere uno strumento per attenuare la progressione delle malattie glomerari. Questo articolo descrive un metodo per coltura e analizzare la crescita delle cellule epiteliali parietali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Dopo aver sezionato i reni di topo isolati, il tessuto viene macinato e i glomeruli vengono isolati dalla setacciatura. I glomeruli incapsulati vengono raccolti e i glomeruli singoli vengono coltivati per 6 giorni per ottenere la crescita glomerare delle cellule epiteliali parietali. Durante questo periodo, la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali parietali possono essere analizzate determinando il numero di cellule o la superficie delle cellule in crescita in emigrazione. Questo saggio può quindi essere utilizzato come strumento per studiare gli effetti di un'espressione genica alterata nei topi transgenici o knockout o gli effetti delle condizioni di coltura sulle caratteristiche e la segnalazione della crescita delle cellule epiteliali parietali. Utilizzando questo metodo, è possibile studiare importanti vie coinvolte nel processo di attivazione delle cellule epiteliali parietali e, di conseguenza, nella glomerulosclerosi.
Introduzione
Le malattie glomeriari sono un importante gruppo di disturbi renali e rappresentano una delle principali cause della malattia renale allo stadio finale (ESRD). Sfortunatamente, le opzioni di trattamento specifiche sono limitate e la progressione verso l'ESRD è inevitabile. Le malattie glomerari sono definite dalla presenza di lesioni glomeriule e possono essere raggruppate in malattie infiammatorie e non infiammatorie. Anche se l'insulto iniziale è diverso, studi recenti hanno dimostrato che un meccanismo cellulare comune porta a iperplasia delle cellule epiteliali glomerale e, infine, alla glomerulosclerosi in tutte le malattie glomerari, indipendentemente dalla causa sottostante1,2,3,4.
In particolare, è stato dimostrato che le lesioni glomerulosclerotice sono composte principalmente da cellule epiteliali parietali attivate5,6. In condizioni fisiologiche, le cellule epiteliali parietali sono cellule epiteliali quiescenti piatte che riallineano la capsula del Bowman del glomerulus. Tuttavia, qualsiasi lesione glomerare dovuta a mutazioni genetiche (ad esempio, citopatie specifiche di podociti o mitocondriali), infiammazione o iperfiltrazione (ad esempio, causata da ridotta massa renale, ipertensione, obesità o mellito diabetico) può innescare l'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Le cellule epiteliali parietali attive proliferano e depositano matrice extracellulare che si traduce nella formazione di mezzalune cellulari o lesioni sclerotiche5,7,8. La progressione di questi processi comporta la perdita della funzione renale9. Pertanto, l'attivazione delle cellule epiteliali parietali è un fattore chiave nello sviluppo e nella progressione della glomerulosclerosi nelle malattie glomerari sia infiammatorie che non infiammatorie1,2,3,4,10.
I processi molecolari che mediano l'attivazione delle cellule epiteliali parietali sono ancora in gran parte sconosciuti. Recenti studi dimostrano che le cellule epiteliali parietali attivate de novo esprimono CD44, un recettore importante per l'attivazione di diversi percorsi coinvolti nella proliferazione cellulare e nella migrazione. Inoltre, l'inibizione del CD44 ha dimostrato di inibire l'attivazione delle cellule epiteliali parietali e attenuare la progressione della formazione della mezzaluna e della glomerulosclerosi nei modelli animali di malattie glomerari e infiammatorie11,12.
Poiché l'attivazione delle cellule epiteliali parietali è un attore chiave per lo sviluppo della glomerulsclerosi e della formazione della mezzaluna, l'inibizione di queste cellule potrebbe rallentare la progressione delle malattie glomerari. La chiarificazione delle vie molecolari che determinano l'attivazione delle cellule epiteliali parietali può portare allo sviluppo di interventi terapeutici specifici che attenuano la formazione delle lesioni iperplastiche e glomerulosclerotice nella malattia glomerare.
Nei modelli animali sperimentali, è spesso difficile fornire prove di un effetto diretto di un'espressione genica alterata (modelli di eliminazione o modelli murini transgenici) o di un trattamento farmacologico sulle cellule epiteliali parietali. In un topo knock-out convenzionale i cambiamenti osservati in vivo potrebbero essere spiegati da cambiamenti diretti nelle cellule epiteliali parietali. Tuttavia, poiché l'espressione genica è alterata anche in altri tipi di cellule all'interno del mouse, non si possono escludere gli effetti indiretti mediati da altri tipi di cellule. Lo sviluppo di topi condizionati cre-lox guidati da promotori attivi principalmente in cellule epiteliali parietali ha fornito una soluzione in alcuni casi13. Tuttavia, i modelli transgenici condizionali sono complessi e, anche se diventano disponibili linee più condizionali, per molte delle linee di topo convenzionali knock-out o transgeniche non esiste ancora un sostituto condizionale.
Per studiare gli effetti diretti sulle cellule epiteliali parietali, il nostro gruppo ha sviluppato un saggio ex vivo utilizzando glomeruli singoli incapsulati isolati dai reni dei topi per misurare e analizzare la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali parietali. Questo metodo ci permetterà di determinare gli effetti specifici delle cellule epiteliali parietali e di trovare vie responsabili per l'attivazione delle cellule epiteliali parietali e testare le opzioni di trattamento per inibire questa attivazione.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida del Comitato Etico Animale della Radboud University Nijmegen.
NOTA: i topi di tipo selvaggio non trattati (WT) (n - 4) e i topi cd44-/- (n - 4) sono stati sacrificati all'età di 12-16 settimane. Sono stati usati sia topi maschi che femmine. Tutti i topi erano sullo sfondo C57Bl/6.
1. Dissezione renale del topo
- Sacrifica topi WT sani o topi geneticamente alterati dalla lussazione cervicale.
- Dissect interi reni di topo direttamente dopo aver sacrificato i topi. Per questo, eseguire una laparotomia mediana utilizzando forbici addominali, tagliando la pelle e poi i muscoli addominali. Rimuovere l'intestino e posizionarlo accanto al mouse.
- Liberare i reni dal tessuto di collegamento e tirare fuori il rene con pinze chirurgiche, tagliando l'arteria renale, vena renale e ureter con le forbici.
- Rimuovere le capsule renali dai reni tenendo il rene con pinze chirurgiche ed estrarre la capsula utilizzando un altro paio di pinze.
- Mettere i reni in una piastra di coltura a 6 cellule (2 reni/bene) preparata con 2 mL di soluzione di sale equilibrato di Hanks (HBSS) per pozzo e posto su ghiaccio.
2. Isolamento del glomeruli dal rene di topo
- Trasferire i reni in un piatto Petri da 100 mm e tritare i reni in piccoli pezzi di 1/2 mm usando due bisturi. Mantenere i pezzi di rene macinati bagnati usando 1-2 mL di HBSS.
- Posizionare i pezzi di rene macinati sopra un setaccio di metallo di 300 m e premere il rene attraverso il setaccio utilizzando uno stantuffo di una siringa da 20 mL. Sciacquare ripetutamente il setaccio con HBSS in mezzo e raccogliere il flusso attraverso in una piastra Petri pulita utilizzando un pipet sierologico. Raccogliere anche tutto ciò che rimane / si attacca al lato inferiore del setaccio raschiando via con il bisturi e trasferirlo al flusso-attraverso raccolto (omogeneo renale).
- Sciacquare l'omogenea renale attraverso un setaccio di 75 m con HBSS. Raccogliere il flusso attraverso e successivamente sciacquare questo flusso attraverso un setaccio di 53 m. Lavare entrambi i setacci utilizzando HBSS per rimuovere tutte le strutture più piccole.
NOTA: In questa fase il flusso, ma non viene sciacquato solo attraverso il setaccio di 75 m e 53 m. Lavaggio con HBSS è necessario rimuovere detriti e strutture più piccole sui setacci. Pertanto normalmente vengono utilizzati in totale 200-300 mL di HBSS. - Raccogliere le strutture/materiali renali che rimangono sul setaccio 75 m e 53 m lavando la superficie superiore dei setacci con il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 20% di siero di vitello fetale (FCS) e trasferire il materiale in una micropiastra di fissaggio ultra-basso a 6 bassissimi.
NOTA: Per lavare la superficie superiore del setaccio, sciacquare il setaccio in posizione inclinata (>45) e raccogliere il materiale renale sul bordo del setaccio. Il materiale raccolto è arricchito per glomeruli incapsulati e incapsulati, mostrando solo pochi frammenti tubolari. I glomeruli incapsulati sono molto appiccicosi. Per raccogliere singoli glomeruli, è quindi importante evitare che i glomeruli aderiscano alla superficie di un piatto Petri o di un piatto di pozzo. Per evitare l'aderenza, utilizzare il supporto con 20% FCS e utilizzare piastre di fissaggio ultra-basse per questo passaggio.
3. Coltura di escrescenza glomerare
- Portare la microplacca di fissaggio ultra-bassa in un microscopio luminoso invertito e raccogliere singoli glomeruli incapsulati e/o incapsulati con una pipetta da 20 l. Evitare di pipettare altre strutture e detriti. Dopo aver raccolto un singolo glomerulus nella punta della pipetta, aggiungere il nuovo supporto DMEM senza materiale renale raccolto nella stessa punta di pipetta per un volume di 20 .
- Trasferire il singolo glomerulus con il mezzo DMEM da 20 gradi al centro di un pozzo di una piastra di coltura cellulare a 24 pozze e incubare per 3 h a 37 oC e 5% (v/v) CO2 per consentire l'attaccamento del glomerulus al centro del pozzo. Spostare con attenzione la piastra per evitare di galleggiare del glomerulus ai bordodel.
- Dopo 3 h incubazione, il glomerulus è attaccato al centro del pozzo. Aggiungere con attenzione 500 l di mezzo basale endoteliale (EBM) integrato con un kit per il fattore di crescita contenente idrocortisone, fattore di crescita endoteliale umano, estratto cerebrale bovino e anfido-amphotericina b di gentamicin B (Tabella dei materiali) e ulteriore 5% (v/v) FBS e 1% (v/v) penicillina / s ptomicina (pentre) ogni beh.
- Cultura il singolo glomeruli per 6 giorni a 37 gradi centigradi, 5% (v/v) CO2.
NOTA: Entro 6 giorni si forma la crescita costituita da cellule epiteliali parietali. Se si mira a testare gli effetti di composti specifici o farmaci sulle cellule epiteliali parietali dovrebbe essere aggiunto al mezzo entro questo periodo di sei giorni.
4. Analisi della proliferazione delle cellule epiteliali parietali
- Analizzare l'escrescenza glomerare dopo 6 giorni. Scatta immagini microscopiche utilizzando un microscopio digitale a luce rovesciata.
- Utilizzare un software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ/FIJI) per determinare la superficie e il diametro della crescita glomerare e il numero di cellule in crescita o glomeruli in crescita.
- Per determinare la superficie di escrescenza glomerare, aprire il tif. file della crescita glomerare con barra della scala in ImageJ. Disegnare una linea retta sulla barra della scala e determinare la distanza in pixel facendo clic su analizza e misura (ad esempio, 1 mm e 460 pixel).
- Determinare la scala facendo clic su Analizza, impostare la scala e digitare la distanza nota in pixel (ad esempio, 460), digitare anche la distanza nota (ad esempio, 1) e l'unità di lunghezza (ad esempio, 1 mm). Fare clic su OK.
- Determinare quali risultati verranno visualizzati nella tabella dei risultati facendo clic su Analizza e quindi impostare le misurazioni. Per determinare la superficie della crescita glomerare, attivare l'area delle opzioni e l'etichetta di visualizzazione. Fare clic su OK.
- Per determinare la superficie della crescita glomerare, disegnare una selezione a mano libera intorno alla crescita glomerare. Fare clic su analizza e quindi misurare, verrà visualizzata una tabella dei risultati in ImageJ che mostra la superficie di crescita della superficie nella scala determinata in precedenza (vedere il passaggio 4.4, ad esempio, mm2).
5. Caratterizzazione della crescita della cellula glomerare
NOTA: Per valutare la composizione cellulare della escrescenza, la colorazione dell'immunofluorescenza per i marcatori specifici delle cellule viene eseguita sulle escrescenze glomeriule a t e 6 giorni.
- Rimuovere con attenzione il mezzo e lavare delicatamente la glomeruli due volte utilizzando la salina con buffer fosfato (PBS).
- Fissare per 10 min a temperatura ambiente utilizzando 2% (w/v) paraformaldeide (PFA) integrato con 4% (w/v) di saccarosio in PBS e lavare con attenzione 2x utilizzando PBS.
- Incubare con l'anticorpo primario con adeguata concentrazione (Tabella dei materiali) diluito nell'albumina del siero PBS-ovine (BSA) 1% (v/v) per 1 h a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare con cura 3x con PBS.
- Incubazione con anticorpo secondario (Tabella dei materiali) diluito in PBS-BSA 1% (v/v) al buio per 45 min a temperatura ambiente.
- Lavare con cura 3x con PBS e montare utilizzando 1o2 gocce di supporto di montaggio acquoso con 4,6-diamidino-2-fenilondoma (DAPI) per visualizzare i nuclei e coprire il pozzo con uno slittamento di copertura rotondo.
- Scatta immagini microscopiche usando un microscopio fluorescente.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Un diagramma sistematico del metodo per eseguire l'escrescenza glomerare è illustrato nella Figura 1. Figura 2A-D mostra escrescenze glomeriul di glomeruli incapsulati in diversi punti temporali come osservato utilizzando microscopia leggera. Le escrescenze sono mostrate al giorno 2, 4 e 6 ( Figura 2B-D) nellacolturadopo l'isolamento glomerulus dal rene di topo. Al f...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Utilizzando il protocollo descritto in questo articolo, è possibile utilizzare glomeruli singoli incapsulati per valutare la proliferazione delle cellule epiteliali parietali che è una conseguenza dell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Questo modello ex vivo ci permetterà di studiare in dettaglio i percorsi molecolari, che sono coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Il metodo descritto si basa sul semplice concetto di dissezione renale e setacciatura per isolare e coltura incapsulato...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dalla fondazione rene olandese (sovvenzione 14A3D104) e dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO VIDI grant: 016.156.363).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra per colture cellulari a 24 pozzetti | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Marcatore cellulare endoteliale (concentrazione utilizzata 1:200) | |
| pollo-anti-ratto Alexa 647 | Thermo Fisher | ( concentrazione usata 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mezzo di montaggio contenente DAPI | |
| Microscopio digitale a luce invertita | Westburg, EVOS fl microscopio | ||
| asino-anti-capra Alexa 568 | Thermo Fisher | ( concentrazione usata 1:200) | |
| asino-anti-coniglio Alexa 568 | Thermo Fisher | ( concentrazione usata 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | contenente idrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS e BBE | |
| Siero fetale bovino | Lonza | ||
| Microscopio fluorescente | Leica Microsystems GmbH | ||
| capra-anti-sinaptopodin | Santa Cruz | Marcatore podocita (concentrazione utilizzata 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| Petri dish | Sarstedt | taglia 100 | |
| coniglio-anti-claudina1 | Abcam | Marcatore di cellule epiteliali parietali (concentrazione utilizzata 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, USA | gentilmente fornito dal Dr. E. Gelman, marcatore di cellule epiteliali parietali | |
| Endecotts Ltd | taglia 300 & micro; m, 75 & micro; m, 53 & micro; m, | ||
| BD Plastipak | formato: 20 ml | ||
| Micropiastre ad attacco ultrabasso | Corning Costar | a 6 pozzetti |
Riferimenti
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
