Questo articolo descrive un metodo per coltivare e analizzare le escrescenze glomeriane delle cellule epiteliali glomeriali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare i percorsi coinvolti nella proliferazione e migrazione delle cellule epiteliali parietali.
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Articolo metodologico
Escrescenza glomerare come un'analisi di Ex Vivo per analizzare i percorsi coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali Parietali
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'attivazione delle cellule epiteliali parietali (PEC) è uno dei fattori chiave coinvolti nello sviluppo e nella progressione della glorulosclerosi. L'inibizione delle vie coinvolte nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali potrebbe quindi essere uno strumento per attenuare la progressione delle malattie glomerari. Questo articolo descrive un metodo per coltura e analizzare la crescita delle cellule epiteliali parietali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Dopo aver sezionato i reni di topo isolati, il tessuto viene macinato e i glomeruli vengono isolati dalla setacciatura. I glomeruli incapsulati vengono raccolti e i glomeruli singoli vengono coltivati per 6 giorni per ottenere la crescita glomerare delle cellule epiteliali parietali. Durante questo periodo, la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali parietali possono essere analizzate determinando il numero di cellule o la superficie delle cellule in crescita in emigrazione. Questo saggio può quindi essere utilizzato come strumento per studiare gli effetti di un'espressione genica alterata nei topi transgenici o knockout o gli effetti delle condizioni di coltura sulle caratteristiche e la segnalazione della crescita delle cellule epiteliali parietali. Utilizzando questo metodo, è possibile studiare importanti vie coinvolte nel processo di attivazione delle cellule epiteliali parietali e, di conseguenza, nella glomerulosclerosi.
Introduzione
Le malattie glomeriari sono un importante gruppo di disturbi renali e rappresentano una delle principali cause della malattia renale allo stadio finale (ESRD). Sfortunatamente, le opzioni di trattamento specifiche sono limitate e la progressione verso l'ESRD è inevitabile. Le malattie glomerari sono definite dalla presenza di lesioni glomeriule e possono essere raggruppate in malattie infiammatorie e non infiammatorie. Anche se l'insulto iniziale è diverso, studi recenti hanno dimostrato che un meccanismo cellulare comune porta a iperplasia delle cellule epiteliali glomerale e, infine, alla glomerulosclerosi in tutte le malattie glomerari, indipendentemente dalla caus....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida del Comitato Etico Animale della Radboud University Nijmegen.
NOTA: i topi di tipo selvaggio non trattati (WT) (n - 4) e i topi cd44-/- (n - 4) sono stati sacrificati all'età di 12-16 settimane. Sono stati usati sia topi maschi che femmine. Tutti i topi erano sullo sfondo C57Bl/6.
1. Dissezione renale del topo
- Sacrifica topi WT sani o topi geneticamente alterati dalla lussazione cervicale.
- Dissect interi reni di topo direttamente dopo aver sacrificato i topi. Per questo, eseguire una laparotomia mediana uti....
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Risultati
Un diagramma sistematico del metodo per eseguire l'escrescenza glomerare è illustrato nella Figura 1. Figura 2A-D mostra escrescenze glomeriul di glomeruli incapsulati in diversi punti temporali come osservato utilizzando microscopia leggera. Le escrescenze sono mostrate al giorno 2, 4 e 6 ( Figura 2B-D) nellacolturadopo l'isolamento glomerulus dal rene di topo. Al f.......
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Discussione
Utilizzando il protocollo descritto in questo articolo, è possibile utilizzare glomeruli singoli incapsulati per valutare la proliferazione delle cellule epiteliali parietali che è una conseguenza dell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Questo modello ex vivo ci permetterà di studiare in dettaglio i percorsi molecolari, che sono coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Il metodo descritto si basa sul semplice concetto di dissezione renale e setacciatura per isolare e coltura incapsulato.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dalla fondazione rene olandese (sovvenzione 14A3D104) e dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO VIDI grant: 016.156.363).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra per colture cellulari a 24 pozzetti | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Marcatore cellulare endoteliale (concentrazione utilizzata 1:200) | |
| pollo-anti-ratto Alexa 647 | Thermo Fisher | ( concentrazione usata 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mezzo di montaggio contenente DAPI | |
| Microscopio digitale a luce invertita | Westburg, EVOS fl microscopio | ||
| asino-anti-capra Alexa 568 | Thermo Fisher | ( concentrazione usata 1:200) | |
| asino-anti-coniglio Alexa 568 | Thermo Fisher | ( concentrazione usata 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | contenente idrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS e BBE | |
| Siero fetale bovino | Lonza | ||
| Microscopio fluorescente | Leica Microsystems GmbH | ||
| capra-anti-sinaptopodin | Santa Cruz | Marcatore podocita (concentrazione utilizzata 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| Petri dish | Sarstedt | taglia 100 | |
| coniglio-anti-claudina1 | Abcam | Marcatore di cellule epiteliali parietali (concentrazione utilizzata 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, USA | gentilmente fornito dal Dr. E. Gelman, marcatore di cellule epiteliali parietali | |
| Endecotts Ltd | taglia 300 & micro; m, 75 & micro; m, 53 & micro; m, | ||
| BD Plastipak | formato: 20 ml | ||
| Micropiastre ad attacco ultrabasso | Corning Costar | a 6 pozzetti |
Riferimenti
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al.
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Ristampe e permessi
