Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse

Michael Vilkhovoy; David Dai; Sandra Vadhin; Abhinav Adhikari; Jeffrey D. Varner

doi:10.3791/60329

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Articolo metodologico

Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse

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DOI:

10.3791/60329

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25 ottobre 2019

Michael Vilkhovoy¹ , David Dai¹ , Sandra Vadhin^*¹ , Abhinav Adhikari^*¹ , Jeffrey D. Varner¹

¹Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule. La miscela di sintesi senza cellule viene derivata con un'anilina per una separazione efficace utilizzando la cromatografia liquida a fase invertita e quindi quantificata dalla spettrometria di massa utilizzando standard interni etichettati isotopicamente.

Abstract

La sintesi delle proteine prive di cellule (CFPS) è una tecnologia emergente nei sistemi e nella biologia sintetica per la produzione in vitro di proteine. Tuttavia, se CFPS sta per andare oltre il laboratorio e diventare una tecnologia di produzione diffusa e standard just in time, dobbiamo capire i limiti di prestazioni di questi sistemi. A questa domanda, abbiamo sviluppato un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nella glicolisi, la via del fosfato della pentosi, il ciclo dell'acido tricarboxillico, il metabolismo energetico e la rigenerazione del cofattore nelle reazioni CFPS. Il metodo utilizza standard interni contrassegnati con ¹³C-anilina, mentre i composti nel campione vengono derivati con ¹²C-anilina. Gli standard e il campione interni sono stati miscelati e analizzati mediante spettrometria cromatografia-massa liquida in fase invertita (LC/MS). La co-eluzione dei composti ha eliminato la soppressione degli ioni, consentendo la quantificazione accurata delle concentrazioni di metaboliti su 2-3 ordini di grandezza dove il coefficiente di correlazione medio era 0,988. Cinque dei quaranta composti sono stati senza tag con anilina, tuttavia, sono stati ancora rilevati nel campione CFPS e quantificati con un metodo di curva standard. La corsa cromatica richiede circa 10 minuti per essere completata. Nel loro insieme, abbiamo sviluppato un metodo veloce e robusto per separare e quantificare con precisione 40 composti coinvolti nella CFPS in un'unica corsa LC/MS. Il metodo è un approccio completo e preciso per caratterizzare il metabolismo privo di cellule, in modo che in ultima analisi, possiamo comprendere e migliorare la resa, la produttività e l'efficienza energetica dei sistemi senza cellule.

Introduzione

La sintesi delle proteine prive di cellule (CFPS) è una piattaforma promettente per la produzione di proteine e sostanze chimiche, un'applicazione tradizionalmente riservata alle cellule viventi. I sistemi senza cellule sono derivati da estratti di cellule grezze ed eliminano le complicazioni associate alla crescita cellulare¹. Inoltre, CFPS consente l'accesso diretto ai metaboliti e ai macchinari biosintetici senza l'interferenza di una parete cellulare. Tuttavia, è stata carente una comprensione fondamentale dei limiti di prestazioni dei processi senza cellule. I metodi ad alta produttività per la quantificazione dei metaboliti sono preziosi ....