Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule. La miscela di sintesi senza cellule viene derivata con un'anilina per una separazione efficace utilizzando la cromatografia liquida a fase invertita e quindi quantificata dalla spettrometria di massa utilizzando standard interni etichettati isotopicamente.

Abstract

La sintesi delle proteine prive di cellule (CFPS) è una tecnologia emergente nei sistemi e nella biologia sintetica per la produzione in vitro di proteine. Tuttavia, se CFPS sta per andare oltre il laboratorio e diventare una tecnologia di produzione diffusa e standard just in time, dobbiamo capire i limiti di prestazioni di questi sistemi. A questa domanda, abbiamo sviluppato un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nella glicolisi, la via del fosfato della pentosi, il ciclo dell'acido tricarboxillico, il metabolismo energetico e la rigenerazione del cofattore nelle reazioni CFPS. Il metodo utilizza standard interni contrassegnati con ¹³C-anilina, mentre i composti nel campione vengono derivati con ¹²C-anilina. Gli standard e il campione interni sono stati miscelati e analizzati mediante spettrometria cromatografia-massa liquida in fase invertita (LC/MS). La co-eluzione dei composti ha eliminato la soppressione degli ioni, consentendo la quantificazione accurata delle concentrazioni di metaboliti su 2-3 ordini di grandezza dove il coefficiente di correlazione medio era 0,988. Cinque dei quaranta composti sono stati senza tag con anilina, tuttavia, sono stati ancora rilevati nel campione CFPS e quantificati con un metodo di curva standard. La corsa cromatica richiede circa 10 minuti per essere completata. Nel loro insieme, abbiamo sviluppato un metodo veloce e robusto per separare e quantificare con precisione 40 composti coinvolti nella CFPS in un'unica corsa LC/MS. Il metodo è un approccio completo e preciso per caratterizzare il metabolismo privo di cellule, in modo che in ultima analisi, possiamo comprendere e migliorare la resa, la produttività e l'efficienza energetica dei sistemi senza cellule.

Introduzione

La sintesi delle proteine prive di cellule (CFPS) è una piattaforma promettente per la produzione di proteine e sostanze chimiche, un'applicazione tradizionalmente riservata alle cellule viventi. I sistemi senza cellule sono derivati da estratti di cellule grezze ed eliminano le complicazioni associate alla crescita cellulare¹. Inoltre, CFPS consente l'accesso diretto ai metaboliti e ai macchinari biosintetici senza l'interferenza di una parete cellulare. Tuttavia, è stata carente una comprensione fondamentale dei limiti di prestazioni dei processi senza cellule. I metodi ad alta produttività per la quantificazione dei metaboliti sono preziosi per la caratterizzazione del metabolismo e sono fondamentali per la costruzione di modelli metabolici computazionali^2,3,4. I metodi più comuni utilizzati per determinare le concentrazioni di metaboliti includono la risonanza magnetica nucleare (NMR), la spettroscopia a infrarossi a infrarossi di Fourier (FT-IR), i saggi basati su enzimi e la spettrometria di massa (MS)^{5,6,7 ,8}. Tuttavia, questi metodi sono spesso limitati dalla loro incapacità di misurare in modo efficiente più composti contemporaneamente e spesso richiedono una dimensione del campione maggiore rispetto alle tipiche reazioni senza cellule. Ad esempio, i saggi basati su enzimi spesso possono essere utilizzati solo per quantificare un singolo composto in una corsa e sono limitati quando la dimensione del campione è piccola, ad esempio nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule (tipicamente eseguite su una scala 10-15). Nel frattempo, NMR richiede un'elevata abbondanza di metaboliti per il rilevamento e la quantificazione⁵.  Verso queste carenze, i metodi di cromatografia in tandem con la spettrometria di massa (LC/MS) offrono diversi vantaggi, tra cui l'elevata sensibilità e la capacità di misurare più specie contemporaneamente⁹; tuttavia, la complessità analitica aumenta considerevolmente con il numero e la diversità delle specie misurate. È quindi importante sviluppare metodi in grado di realizzare appieno il potenziale ad alta produttività dei sistemi LC/MS. I composti in un campione sono separati dalla cromatografia liquida e identificati attraverso la spettrometria di massa. Il segnale del composto dipende dalla sua efficienza di concentrazione e ionizzazione, dove la ionizzazione può variare tra i composti e può anche dipendere dalla matrice del campione.

Raggiungere la stessa efficienza di ionizzazione tra il campione e gli standard è una sfida quando si utilizza LC/MS per quantificare gli analiti. Inoltre, la quantificazione diventa più impegnativa con la diversità dei metaboliti a causa della divisione del segnale e dell'eterogeneità nell'affinità protonica e nella polarità¹⁰. Infine, la matrice di co-eluting del campione può anche influenzare l'efficienza della ionizzazione dei composti. Per risolvere questi problemi, i metaboliti possono essere derivati chimicamente, aumentando la risoluzione di separazione e la sensibilità da parte dei sistemi LC/MS, riducendo contemporaneamente la suddivisione del segnale in alcuni casi^10,11. La derivazione chimica funziona etichettando specifici gruppi funzionali di metaboliti per regolare le loro proprietà fisiche come carica o idrofobicità per aumentare l'efficienza di ionizzazione¹¹. Vari agenti di etichettatura possono essere utilizzati per indirizzare diversi gruppi funzionali (ad esempio, ammine, idrossidi, fosfati, acidi carboxylici, ecc.). Aniline, uno di questi agenti di derivazione, si rivolge a più gruppi funzionali contemporaneamente, e aggiunge un componente idrofobico in molecole idrofile, aumentando così la loro risoluzione di separazione e il segnale¹². Per affrontare l'effetto di soppressione degli ioni a matrice co-elutazione, Yang e i colleghi hanno sviluppato una tecnica basata sull'etichettatura GSIST (Group Specific Internal Standard Technology) in cui gli standard sono contrassegnati con isotopi di anilinea ¹³C e mescolati con il campione ^12,13. Il metabolita e il corrispondente standard interno hanno la stessa efficienza di ionizzazione dal momento che co-eluito, e il loro rapporto di intensità può essere utilizzato per quantificare la concentrazione nel campione sperimentale.

In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo per rilevare e quantificare 40 composti coinvolti nella glicolisi, la via del fosfato pentosi, il ciclo dell'acido tricarboxyillico, il metabolismo energetico e la rigenerazione del cofattore nelle reazioni CFPS. Il metodo si basa sull'approccio GSIST, dove abbiamo usato ¹²C-anilina e ¹³C-anilina per etichettare, rilevare e quantificare i metaboliti utilizzando LC/MS in fase invertita. La gamma lineare di tutti i composti si estendeva su 2-3 ordini di grandezza con un coefficiente di correlazione medio di 0,988. Così, il metodo è un approccio robusto e preciso per interrogare il metabolismo senza cellule, e possibilmente estratti interi cellulari.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti per l'etichettatura di anilina

1. Preparare una soluzione di anilina da 6 M a pH 4.5. Lavorando in una cappa, unire 550 l di anilina con 337,5 l di acqua di grado LCMS e 112,5 -L di acido cloridrico 12 M (HCl) in un tubo centrifuga. Vortice bene e conservare a 4 gradi centigradi.
   NOTA: Aniline può essere conservato a 4 gradi centigradi per 2 mesi.
   AVVISO: L'anilina è altamente tossica e deve essere lavorata in un cofano di fumi. L'acido cloridrico è altamente corrosivo
2. Preparare una soluzione di anilina 6 M ¹³C a pH 4.5. Unire 250 mg di ¹³C₆-anilina con 132 gradi centigradi d'acqua e 44 luna di 12 M HCl. Vorticare bene e conservare a 4 gradi centigradi.
3. Preparare la soluzione EDC (200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrocloride (EDC). Sciogliere 2 mg di EDC in 10 gradi centigradi di acqua per ogni campione da etichettare e vortice bene.
   NOTA: la soluzione EDC deve essere preparata lo stesso giorno della reazione. EDC funge da catalizzatore per la derivazione di composti con anilina¹².

2. Preparazione delle norme

1. Creare soluzioni di stock separate di tutti i composti disciolti nell'acqua di grado LC/MS (tabella 1).
2. Preparazione della soluzione interna per lo stock standard
   1. Combina tutti i composti ad eccezione di dinucleotide adenina nicotinamide (NAD), didenina didenina didenina didenina digastide fosfato (NADP), dinucleotide di flanutta (FAD), coenzima adenilale A (ACA) e glicerolo 3 fosfato (Gly3P), con i volumi appropriati per creare una soluzione di 2 mM di tutti i composti.
3. Combinare NAD, NADP, FAD, ACA e Gly3P con i volumi appropriati per creare una soluzione stock da 2 mM.

3. Preparazione del campione (Figura 1)

1. Quench e precipitare le proteine in una reazione di sintesi proteica priva di cellule aggiungendo un volume uguale di ghiaccio-freddo 100% etanolo alla reazione. Centrifugare il campione a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga.
   NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 gradi centigradi a questo punto e analizzati in un secondo momento

4. Reazione di etichettatura

1. Esempio di etichettatura con soluzione ^{a 12}c-anilina
   1. Trasferire 6 l di l di campione in un nuovo tubo di centrifuga e portare il volume a 50 o L con acqua.
      NOTA: la dimensione del campione di volume può dipendere dalla specifica reazione CFPS.
   2. Aggiungere 5 soluzione EDC da 200 mg/mL.
   3. Aggiungete 5 -L di ¹²C-anilina.
      NOTA: la soluzione anilina si separa in due fasi. Mescolare bene prima di aggiungere alla reazione.
   4. Vortice la reazione con agitazione delicata per 2 h a temperatura ambiente.
   5. Dopo 2 h, togliere i tubi dallo shaker e aggiungere 1,5 l di triethylamine (TEA) alla reazione in un cappuccio fumato.
      NOTA: La trietilamina aumenta il pH della soluzione che ferma la reazione di marcatura dell'anilina e stabilizza i composti.
      AGGIORNAMENTO: La trietilmia è tossica e causa irritazione degli occhi e delle vie respiratorie.
   6. Centrifuga a 13.500 x g per 3 min.
2. Etichettatura degli standard interni con ¹³soluzione C-anilina
   1. Diluire la soluzione interna a 80 M con un volume finale di 50 .L.
      NOTA: la concentrazione degli standard interni può essere regolata a livelli vicini al campione sperimentale.
   2. Aggiungere 5 soluzione EDC da 200 mg/mL.
   3. Aggiungete 5 -L di ¹³c-anilina.
   4. Vortice la reazione con agitazione delicata per 2 h a temperatura ambiente.
   5. Dopo 2 h, togliere i tubi dallo shaker e aggiungere 1,5 l di TEA alla reazione in un cappuccio fumatore.
   6. Centrifuga a 13.500 x g per 3 min.
3. Combinazione di standard interni con tag e esempio con tag
   1. Mescolare 25 l di ¹²campioni con etichetta a C con 25 luna di ¹³standard con etichetta C-anilina.
   2. Trasferire a una fiala auto-campionatore e analizzare dalla procedura LC/MS.
4. Creazione di una curva standard per metaboliti senza tag
   1. Soluzione di stock diluito di metaboliti senza tag (NAD, NADP, FAD, ACA e Gly3P) a concentrazioni finali di 320 M, 80 M, 20 M e 5 M con un volume di 50 L.
   2. Aggiungere 5 soluzione EDC da 200 mg/mL.
   3. Aggiungete 5 -L di ¹²C-anilina.
   4. Vortice la reazione con agitazione delicata per 2 h a temperatura ambiente.
   5. Dopo 2 h, togliere i tubi dallo shaker e aggiungere 1,5 l di TEA alla reazione in un cappuccio fumatore.
   6. Centrifuga a 13.500 x g per 3 min.
   7. Trasferire supernatante a una fiala auto-campionatore e analizzare con la procedura LC/MS.
      NOTA: I metaboliti senza tag seguono la stessa procedura del campione per replicare la matrice del campione al fine di mantenere un'efficienza di ionizzazione simile.

5. Configurazione della procedura LC/MS

1. Preparazione dei solventi
   1. Preparare una soluzione acquiuna di 5 mM tri-butylamina (TBA) adattata al pH 4,75 con acido acetico.
      NOTA: TBA nella fase mobile aiuta gli analiti a raggiungere una buona risoluzione e separazione¹⁴.
   2. Preparare 5 mM TBA in acetonitrile (ACN).
   3. Preparare il solvente di lavaggio con 5% di acqua e 95% ACN.
   4. Preparare solvente di spurgo con 95% acqua e 5% ACN.
2. Configurazione delle condizioni MS
   1. Impostare lo spettrometro di massa sulla modalità ione negativo con una temperatura sonda di 520 gradi centigradi, una tensione capillare negativa di -0,8 kV, una tensione capillare positiva di 0,8 kV, e impostare il software per acquisire dati a 5 punti/s.
   2. Impostare le registrazioni ioniche selezionate (SIR) per ogni metabolita con i valori di massa e carica (m/z) specificati. Vedere tabella 1.
3. Inizializzazione LC/MS secondo le istruzioni del produttore
   1. Prime linee solventi nel solvente manager per 3 min.
   2. Prime solvente di lavaggio (5% acqua, 95% ACN) e solvente di spurgo (95% acqua, 5% ACN) per 15 s per 5 cicli.
   3. Impostare il gestore di esempio su 10 .
   4. Installare una colonna C18 (1,7 m, 2,1 mm x 150 mm) e inizializzare la colonna con ACN 100% a 0,3 mL/min per 10 min.
   5. Condizionare la colonna al 95% di acqua e 5% ACN a 0,3 mL/min per 10 min prima di introdurre solventi con buffer.
   6. Condizionare la colonna al 95% solvente A (5mM TBA aqueous, pH 4.75) e 5% solvente B (5 mM TBA in ACN) a 0,3 mL/min per 10 min.
   7. Impostare un protocollo di gradiente con eluizione a partire da 95% solvente A e 5% solvente B, elevato al 70% solvente B in 10 min, portato al 100% solvente B in 2 min e tenuto al 100% solvente B per 3 min. Ritorno alle condizioni iniziali (95% solvente A in 2 min e tenuto al 100% solvente B per 3 min. Ritorno alle condizioni iniziali (95% solvente A in 2 min e tenuto al 100% solvente B per 3 min. Ritorno alle condizioni iniziali (95% solvente A in 2 min , 5% solvente B) su 1 min e tenere premuto per 9 min per ri-colonna equilibrata.
   8. Condizionare la colonna con il protocollo di gradiente 3 volte prima di eventuali iniezioni sulla colonna.
4. Iniezione di campioni e standard
   1. Iniettare 5 l del campione nella colonna e acquisire le intensità ioni m/z appropriate per il campione con etichetta ¹²C-anilina.
   2. Iniettare di nuovo 5 L dello stesso campione, ma questa volta acquisire le intensità degli ioni m/z per gli standard ^{con etichettatura 13}C-anilina.
      NOTA: Il nostro sistema LC/MS non è in grado di acquisire intensità ¹²C e ¹³C m/z ai tempi SIR specificati, poiché si tratta di troppi dati da acquisire nell'intervallo di tempo specificato. Pertanto, iniettiamo lo stesso campione due volte.
   3. Iniettare gli standard di metaboliti senza tag dalla concentrazione più bassa alla più alta e registrare le intensità di ioni m/z appropriate.

6. Quantificazione

1. Creazione del metodo Export
   1. Nel software di acquisizione dati, selezionare File > Nuovo metodo > Metodo di esportazione.
   2. Specificare un nome file, ad esempio AnilineTagging_Date.
   3. Selezionare Esporta file ASCII e scegliere una directory in cui esportare il file di testo.
   4. In Tipo di rapportoselezionare Riepilogo per tutti.
   5. In Delimitatori, per Colonna selezionare un ,. Per Riga, selezionare [cr][se].
   6. In Tabellaselezionare Esporta e quindi Modifica tabella per includere NomeEsempio, Area, Altezza, Quantità e Unità.
   7. Metodo di esportazione di salvataggio.
2. Quantificare i metaboliti con standard interni utilizzando il software di acquisizione dati
   1. Nella scheda Insiemi di campioni, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla conduzione LC/MS corrispondente e selezionare Visualizza come > Canali.
   2. Selezionare tutti i canali SIR per i ¹³standard interni C-anilina di una iniezione, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Revisione.
   3. Se la finestra Layout metodo di elaborazione LC non viene visualizzata automaticamente, passare a Visualizza > Layout metododi elaborazione .
   4. In Processing Method Layout (Layout metodo di elaborazione)passare alla scheda Integration (Integrazione) e impostare ApexTrack come algoritmo.
   5. Vai alla scheda Arrotondamento e imposta il tipo su Mezzo e il livello di levigatura su 13.
      NOTA: è possibile selezionare qualsiasi livello di levigatezza, purché sia coerente in tutti i campioni.
   6. Nella scheda Canale MS, disattivare l'elaborazione MS 3D .
   7. Nella finestra del canale SIR, integrare ogni picco, un canale alla volta. Una volta integrato un picco, vai su Opzioni > Riempi da risultato e i dettagli del picco verranno compilati nella scheda Componenti. Modificare il nome del picco con il nome composto corrispondente.
   8. Una volta valutati tutti i canali SIR, salvare il metodo di elaborazione e chiudere la finestra.
   9. Selezionare tutti i canali SIR del ¹³C-anilina e ¹²C-anilina taggato esempio, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Processo.
   10. Selezionare la casella Processo, selezionare Usa metodo di elaborazione specificatoe scegliere il metodo di elaborazione appena salvato. Selezionare anche la casella Esporta, selezionare Usa il metodo di esportazione specificato e scegliere il metodo di esportazione salvato creato in precedenza. Fare clic su OK.
   11. Aprire il file di testo esportato con Excel e calcolare la concentrazione del composto sconosciuto utilizzando:
       
       dove C_x,i è la concentrazione del campione sconosciuto per metabolita i, A_x,i è l'area integrata del metabolita sconosciuto i, A_std,i è l'area integrata dello standard interno di metabolita i, C_std,i è il concentrazione dello standard interno di metabolita i, e D è il fattore di diluizione.
3. Quantificazione dei metaboliti senza tag con curva standard
   1. Nella scheda Insiemi di campioni, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla conduzione LC/MS corrispondente e selezionare Visualizza come > Canali.
   2. Selezionare tutti i canali SIR per gli standard senza tag di un'iniezione, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Revisione.
   3. Se la finestra Layout metodo di elaborazione LC non viene visualizzata automaticamente, passare a Visualizza > Layout metododi elaborazione .
   4. In Processing Method Layout passare alla scheda Integration e impostare ApexTrack come algoritmo.
   5. Vai alla scheda Arrotondamento e imposta il tipo su Mezzo e il livello di levigatura su 13.
      NOTA: è possibile selezionare qualsiasi livello di levigatezza, purché sia coerente in tutti i campioni.
   6. Nella scheda Canale MS, disattivare l'elaborazione MS 3D .
   7. Nella finestra del canale SIR, integrare ogni picco, un canale alla volta. Una volta integrato un picco, vai su Opzioni > Riempi da risultato e i dettagli del picco verranno compilati nella scheda Componenti. Modificare il nome del picco con il nome composto corrispondente.
   8. Una volta valutati tutti i canali SIR, salvare il metodo di elaborazione e chiudere la finestra.
   9. Nella scheda Insiemi di campioni, fare clic con il pulsante destro del mouse sul set di campioni e selezionare Altera campione.
   10. Selezionare Importo nella nuova finestra.
   11. Selezionare copia dal metodo di processo e scegliere il metodo di processo appena salvato.
   12. Immettere la concentrazione di ciascun metabolita per ciascuna flacone e l'unità come < s per ogni componente (o l'unità corrispondente) e selezionare OK.
   13. Selezionare nuovamente il set di campioni, fare clic con il pulsante destro del mouse su Visualizza come > Canali.
   14. Selezionare tutti i canali SIR dei metaboliti senza tag per gli standard, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Elabora.
   15. Selezionare la casella Processo e scegliere Usa metodo di elaborazione specificato. Selezionare il metodo di elaborazione appropriato e fare clic su OK.
   16. Selezionare i canali SIR per tutti i metaboliti senza tag per i campioni, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Elabora.
   17. Selezionare la casella Processo, selezionare Usa metodo di elaborazione specificato e scegliere il metodo di elaborazione appena salvato. Selezionare anche la casella Esporta, selezionare Usa il metodo di esportazione specificato e scegliere il metodo di esportazione salvato creato in precedenza. Fare clic su OK.
   18. Quantificare i metaboliti senza tag con la curva standard ed esportare i risultati in un file di testo nella directory specificata.

Risultati

Come prova di concetto, abbiamo usato il protocollo per quantificare i metaboliti in un sistema CFPS basato su E. coli che esprimeva proteine fluorescenti verdi (GFP).  La reazione della CFPS (14) è stata spenta e deproteinizzata con etanolo. Il campione CFPS è stato quindi contrassegnato con ¹²C-anilina, mentre gli standard sono stati contrassegnati con ¹³C-anilina. Il campione e gli standard contrassegnati sono stati quindi combinati e iniettati in LC/MS (Figura 1

Discussione

I sistemi privi di cellule non hanno una parete cellulare, quindi c'è accesso diretto ai metaboliti e ai macchinari biosintetici senza la necessità di una complessa preparazione del campione. Tuttavia, è stato fatto molto poco lavoro per sviluppare protocolli approfonditi e robusti per interrogare quantitativamente sistemi di reazione privi di cellule. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo veloce e robusto per quantificare i metaboliti nelle miscele di reazione prive di cellule e potenzialmente in estratti inter...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
12C Anilina	Sigma-Aldrich	242284	Anilina 12C
13C marcato con anilina	Sigma-Aldrich	485797	Anilina 13C6
3-Acido fosfoglicerico	Sigma-Aldrich	P8877	3PG
Acido acetico	FisherScientific	AC222140010
ACE Acetonitrile, LCMS	JT BAKER	9829-03	ACN
Acetil coenzima A	Sigma-Aldrich	A2056	ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μ M, 2,1 x 150 mm Colonna	Acque	186002353	Colonna
Adenosina difosfato	Sigma-Aldrich	A2754	ADP
Adenosina monofosfato	Sigma-Aldrich	A1752	AMP
Adenosina trifosfato	Sigma-Aldrich	A2383	ATP
Alfa-chetoglutarato	Sigma-Aldrich	K1128	aKG
Citrato	Sigma-Aldrich	251275	CIT
Citidina difosfato	Sigma-Aldrich	C9755	CDP
Citidina monofosfato	Sigma-Aldrich	C1006	CMP
Citidina trifosfato	Sigma-Aldrich	C9274	CTP
D-gliceraldeide 3-fosfato	Sigma-Aldrich	39705	GAP
Eritrosio-4-fosfato	Sigma-Aldrich	E0377	E4P
Etanolo	Sigma-Aldrich	EX0276	EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuga	FisherScientific		Flavina
adenina dinucleotide	Sigma-Aldrich	F6625	FAD
Fruttosio 1,6-bisfosfato	Sigma-Aldrich	F6803	F16P
Fruttosio 6-fosfato	Sigma-Aldrich	F3627	F6P
fumarato	Sigma-Aldrich	F8509
FUM gluconato 6-fosfato	Sigma-Aldrich	P7877	6PG
glucosio	Sigma-Aldrich	G8270	GLC
glucosio 6-fosfato	Sigma-Aldrich	G7879	G6P
glicerolo 3-fosfato	Sigma-Aldrich	G7886	Gly3P
Guanosina difosfato	Sigma-Aldrich	G7127	GDP
Guanosina monofosfato	Sigma-Aldrich	G8377	GMP
Guanosina trifosfato	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Acido cloridrico	Sigma-Aldrich	258148	HCl
Isocitrato	Sigma-Aldrich	I1252	ICIT
Lattato	Sigma-Aldrich	L1750	LAC
malato	Sigma-Aldrich	02288	MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit	ArborBiosciences	507024	Sintesi proteica priva di cellule
N-(3-dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridrato	Sigma-Aldrich	03449	EDC
Nicotinamide adenina dinucleotide	Sigma-Aldrich	43410	NAD
Nicotinammide adenina dinucleotide fosfato	Sigma-Aldrich	N5755	NADP
Nicotinammide adenina dinucleotide fosfato ridotto	Sigma-Aldrich	481973	NADPH
Nicotinamide adenina dinucleotide ridotto	Sigma-Aldrich	N8129	NADH
Ossalacetato	Sigma-Aldrich	O4126	OAA
Fosfoenolpiruvato	Sigma-Aldrich	P0564	PEP
Piruvato	Sigma-Aldrich	P5280	PYR
Ribosio 5-fosfato	Sigma-Aldrich	R7750	R5P
Ribulosio 5-fosfato	CarboSynth	MR45852	RL5P
Sedoeptulosio 7-fosfato	CarboSynth	MS07457	S7P
Succinato	Sigma-Aldrich	S3674	SUCC
Tributilammina	Sigma-Aldrich	90780	TBA
Trietilammina	FisherScientific	O4884	TEA
acqua	ultrapura FisherScientific	10977-015	acqua
Uridina difosfato	Sigma-Aldrich	U4125	UDP
Uridina monofosfato	Sigma-Aldrich	U6375	UMP
Uridina trifosfato	Sigma-Aldrich	U6625	UTP
VWR Heavy Duty Vortex	VWR		Vortex
Water, LCMS	JT BAKER	9831-03	WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager	Waters		LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN	Waters		LCMS
Waters Acquity Rivelatore Qda	Waters		LCMS
Waters Empower 3	Waters
Waters LCMS Fiala di recupero totale	Waters	186000384c	Fiala LCMS