Le colture organoide della prostata come strumenti per tradurre genotipi e profili mutazionali in risposte farmacologiche

Sommario

Presentato qui è un protocollo per studiare le risposte farmacologiche negli organoidi epiteliali prostatici. Gli organiidi assomigliano molto alla biologia in vivo e riassumono la genetica dei pazienti, rendendoli interessanti sistemi modello. Gli organoidi della prostata possono essere stabiliti da prostati wildtype, modelli murini geneticamente ingegnerizzati, tessuto umano benigno e cancro avanzato alla prostata.

Abstract

Presentato qui è un protocollo per studiare la farmacodinamica, il potenziale delle cellule staminali e la differenziazione del cancro negli organoidi epiteliali della prostata. Gli organoidi della prostata sono culture tridimensionali (3D) androgeni coltivate in un mezzo definito che assomiglia all'epitelio prostatico. Gli organoidi della prostata possono essere stabiliti da modelli murini di tipo selvaggio e geneticamente ingegnerizzati, tessuto umano benigno e cancro avanzato alla prostata. È importante sottolineare che gli organoidi derivati dal paziente assomigliano molto ai tumori in genetica e nella biologia del tumore in vivo. Inoltre, gli organoidi possono essere geneticamente manipolati utilizzando sistemi CRISPR/Cas9 e shRNA. Queste genetiche controllate rendono la coltura organoide attraente come piattaforma per testare rapidamente gli effetti dei genotipi e dei profili mutazionali sulle risposte farmacologiche. Tuttavia, i protocolli sperimentali devono essere specificamente adattati alla natura 3D delle colture organoidi per ottenere risultati riproducibili. Di seguito sono descritti protocolli dettagliati per l'esecuzione di saggi di seeding per determinare la capacità di formazione degli organiidi. Successivamente, questo rapporto mostra come eseguire trattamenti farmacologici e analizzare la risposta farmacologica attraverso misurazioni di vitalità, isolamento proteico e isolamento dell'RNA. Infine, il protocollo descrive come preparare gli organoidi per lo xenotrapianto e i successivi saggi di crescita in vivo utilizzando l'innesto sottocutaneo. Questi protocolli producono dati altamente riproducibili e sono ampiamente applicabili ai sistemi di coltura 3D.

Introduzione

La resistenza ai farmaci è uno dei principali problemi clinici nel trattamento del cancro. Il trattamento del cancro della prostata metastatico (PCa) è diretto principalmente all'asse di segnalazione degli androgeni. Le terapie anti-androgeni di nuova generazione (ad esempio enzalutamide e abiraterone) hanno mostrato un grande successo clinico, ma praticamente tutte le PCa alla fine progrediscono verso uno stato indipendente dagli androgeni, o il cancro alla prostata resistente alla castrazione (CRPC).

Recenti profilazioni genomiche e trascrittomiche di CRPC hanno rivelato che esistono tre meccanismi generali di resistenza nel cancro alla p....

Protocollo

Tutto il lavoro descritto in questo protocollo è stato eseguito con organoidi murini e organoidi murini già stabiliti in precedenza. Tutto il lavoro sugli animali è stato eseguito in conformità con le linee guida del Research Animal Resource Center of Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Tutti i tessuti derivati dai pazienti sono stati raccolti nel rispetto delle regole e dei regolamenti del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001).

1. Preparazione media e tampone

1. Scongelare la matrice della membrana del seminterrato (ad esempio, Matrigel) a 4 gradi centigradi durante la notte prima di iniziare l'e....

Risultati

Efficienza di seeding
La capacità di formazione degli organiidi è determinata dal fenotipo e dal genotipo. Le cellule basali della prostata di tipo selvaggio (WT) hanno mostrato una capacità di formazione organoide superiore (30%-40%) rispetto alle cellule luminali (3%) (Figura 1A). Dopo l'istituzione degli organiidi, la capacità di formazione aumentò drasticamente. In genere, il 25%-30% delle cellule derivate da un organo.......

Discussione

Comprendere i meccanismi molecolari alla base della resistenza anti-androgeni e scoprire potenziali vulnerabilità terapeutiche richiede il test delle risposte farmacologiche nei sistemi modello che imitano il cancro alla prostata. Di seguito è descritto un protocollo dettagliato per l'analisi affidabile delle risposte farmacologiche negli organoidi della prostata derivati dal paziente e geneticamente ingegnerizzati e la preparazione di questi campioni organoidi per applicazioni a valle.

Esisto.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
A83-01	Tocris	2939	Componente del terreno dell'organoide: Concentrazione finale 200 nM
ADMEM/F12	Tecnologie Gibco/Life	12634028	Componente del terreno dell'organoide
B27	Tecnologie Gibco/Life	17504-044	Componente del terreno dell'organoide
Piastre per colture cellulari	Fisher	657185
Cell Titer Glo	Promega	G7571
DHT	Sigma-Aldrich	D-073	Componente del mezzo dell'organoide: Concentrazione finale 1 nM
DMSO	Fisher	BP231-100
EGF	Peprotech	315-09	Componente del mezzo dell'organoide: Concentrazione finale 50 ng/ml per il topo, 5 ng/nl per l'FGF10
	umano Peprotech	100-26	Componente del mezzo dell'organoide specifico per l'uomo: Concentrazione finale 10 ng/ ml
FGF2	Peprotech	100-18B	Componente del mezzo organoide specifico per l'uomo: Concentrazione finale 5 ng/ml
Glutamax	Gibco/Life technologies	35050079	Componente del mezzo
organoide HEPES	MADE IN-HOUSE	N/A	Componente del mezzo organoide: Concentrazione finale 10 mM
Matrigel (fattore di crescita ridotto e Corning		CB-40230C	Componente medio organoide
N-acetilcisteina	Sigma-Aldrich	A9165	Componente medio organoide: Concentrazione finale 1,25 mM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Componente medio organoide specifico umano: Concentrazione finale 10 mM
NOGGIN	Peprotech o cellule 293t trasfettate stabili con costrutto Noggin (Karthaus et al. 2014)	120-10C	Componente del mezzo dell'organoide: Concentrazione finale 10% del terreno condizionato o 100 ng/ml
Penicillina/streptavidina	Gemini Bio-Products	400-109	Componente medio dell'organoide
Inibitori della fospatasi	Merck Millipore	524629
Prostaglandina E2	Tocris	3632464
Inibitori della proteasi	Merck Millipore	539131
R-SPONDIN	Peprotech o cellule 293t trasfettate stabili con costrutto R-spondin1 (Karthaus et al. 2014)	120-38	Componente del mezzo organoide: Concentrazione finale 10% terreno condizionato o tampone RIPA da 500 ng/ml
	Merck	20-188
minikit RNA-easy	Qiagen	74104
SB202190	Sigma-Aldrich	152121-30-7	Componente del mezzo organoide specifico umano: Concentrazione finale 10 μ M
TryplE	ThermoFisher	12605036
Y-27632	Selleckchem	S1049	Organoide medio componente: Concentrazione finale 10 μ M