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Articolo metodologico

Le colture organoide della prostata come strumenti per tradurre genotipi e profili mutazionali in risposte farmacologiche

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DOI:

10.3791/60346

⸱

24 ottobre 2019

 ,  ,  , 
1Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Howard Hughes Medical Institute

In questo articolo

Sommario

Presentato qui è un protocollo per studiare le risposte farmacologiche negli organoidi epiteliali prostatici. Gli organiidi assomigliano molto alla biologia in vivo e riassumono la genetica dei pazienti, rendendoli interessanti sistemi modello. Gli organoidi della prostata possono essere stabiliti da prostati wildtype, modelli murini geneticamente ingegnerizzati, tessuto umano benigno e cancro avanzato alla prostata.

Abstract

Presentato qui è un protocollo per studiare la farmacodinamica, il potenziale delle cellule staminali e la differenziazione del cancro negli organoidi epiteliali della prostata. Gli organoidi della prostata sono culture tridimensionali (3D) androgeni coltivate in un mezzo definito che assomiglia all'epitelio prostatico. Gli organoidi della prostata possono essere stabiliti da modelli murini di tipo selvaggio e geneticamente ingegnerizzati, tessuto umano benigno e cancro avanzato alla prostata. È importante sottolineare che gli organoidi derivati dal paziente assomigliano molto ai tumori in genetica e nella biologia del tumore in vivo. Inoltre, gli organoidi possono essere geneticamente manipolati utilizzando sistemi CRISPR/Cas9 e shRNA. Queste genetiche controllate rendono la coltura organoide attraente come piattaforma per testare rapidamente gli effetti dei genotipi e dei profili mutazionali sulle risposte farmacologiche. Tuttavia, i protocolli sperimentali devono essere specificamente adattati alla natura 3D delle colture organoidi per ottenere risultati riproducibili. Di seguito sono descritti protocolli dettagliati per l'esecuzione di saggi di seeding per determinare la capacità di formazione degli organiidi. Successivamente, questo rapporto mostra come eseguire trattamenti farmacologici e analizzare la risposta farmacologica attraverso misurazioni di vitalità, isolamento proteico e isolamento dell'RNA. Infine, il protocollo descrive come preparare gli organoidi per lo xenotrapianto e i successivi saggi di crescita in vivo utilizzando l'innesto sottocutaneo. Questi protocolli producono dati altamente riproducibili e sono ampiamente applicabili ai sistemi di coltura 3D.

Introduzione

La resistenza ai farmaci è uno dei principali problemi clinici nel trattamento del cancro. Il trattamento del cancro della prostata metastatico (PCa) è diretto principalmente all'asse di segnalazione degli androgeni. Le terapie anti-androgeni di nuova generazione (ad esempio enzalutamide e abiraterone) hanno mostrato un grande successo clinico, ma praticamente tutte le PCa alla fine progrediscono verso uno stato indipendente dagli androgeni, o il cancro alla prostata resistente alla castrazione (CRPC).

Recenti profilazioni genomiche e trascrittomiche di CRPC hanno rivelato che esistono tre meccanismi generali di resistenza nel cancro alla prostata: 1) l'attivazione di mutazioni con conseguente ripristino della segnalazione del recettore degli androgeni (AR)1; 2) attivazione della segnalazione di bypass, come esemplificato in un modello preclinico per la resistenza alla terapia anti-androgena di nuova generazione in cui l'attivazione del recettore glucocorticoide (GR) può compensare la perdita disegnalazioneAR 2 ; e 3) il processo recentemente identificato di plasticità lignaggio, in cui le cellule tumorali acquisiscono resistenza passando le linee da un tipo di cellula dipendente dal bersaglio del farmaco a un altro tipo di cellula che non dipende da questo (che, in PCa, è rappresentato come AR-negativo e/o malattia neuroendocrina [NEPC])3,4. Tuttavia, i meccanismi molecolari che causano la resistenza ai farmaci non sono compresi. Inoltre, acquisita resistenza anti-androgeno può portare a vulnerabilità terapeutiche che possono essere sfruttate. Pertanto, è essenziale valutare le risposte ai farmaci nei sistemi modello che imitano fenotipi e genotipi dei pazienti.

Gli organoidi della prostata sono colture organotipiche coltivate in una matrice proteica 3D con un mezzo definito. È importante sottolineare che gli organoidi della prostata possono essere stabiliti dal tessuto benigno e canceroso di origine murina o umana, e mantengono caratteristiche fenotipiche e genotypic trovate in vivo5,6. È importante sottolineare che entrambe le celle PCa e CRPC sensibili agli androgeni sono rappresentate nell'attuale compendio degli organoidi. Inoltre, gli organoidi della prostata sono facilmente geneticamente manipolati utilizzando CRISPR/Cas9 e shRNA5. Pertanto, gli organoidi della prostata sono un sistema modello adatto per testare le risposte ai farmaci e chiarire i meccanismi di resistenza. Qui, viene descritto un protocollo dettagliato per eseguire test antidroga e analizzare le risposte farmacologiche utilizzando organoidi della prostata.

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Protocollo

Tutto il lavoro descritto in questo protocollo è stato eseguito con organoidi murini e organoidi murini già stabiliti in precedenza. Tutto il lavoro sugli animali è stato eseguito in conformità con le linee guida del Research Animal Resource Center of Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Tutti i tessuti derivati dai pazienti sono stati raccolti nel rispetto delle regole e dei regolamenti del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001).

1. Preparazione media e tampone

  1. Scongelare la matrice della membrana del seminterrato (ad esempio, Matrigel) a 4 gradi centigradi durante la notte prima di iniziare l'esperimento. Tenerlo sul ghiaccio durante l'uso.
  2. Posizionare le lastre di coltura a 37 gradi centigradi per 24 ore prima degli esperimenti. Questo aiuterà la cupola della matrice della membrana seminterrato (in seguito chiamata cupola a matrice) a polimerizzare. Gli organoidi placcatura sono descritti nel passaggio 2.1.2.
  3. Preparare il mezzo organoide secondo il protocollo stabilito5.
  4. Preparare il mezzo organoide senza l'aggiunta del fattore di crescita epidermico (EGF; vedi Tabella dei materiali per i componenti). EGF sopprime l'uscita trascrizionale AR e conferisce resistenza anti-androgene5.
  5. Preparare il supporto DMEM (Modified Eagle) di Dulbecco con il 10% di siero bovino fetale (FBS).
    NOTA: Questo supporto viene utilizzato per inibire la digestione ezimatica con la sostituzione della trypsin nelle sezioni 2-4.
  6. Preparare soluzioni farmacologiche secondo il protocollo del produttore. Per enzalutamide/mdv3100 (in seguito indicato come anti-androgeno di seconda generazione), preparare una soluzione di riserva di 100 m in zolfo dimetilo (DMSO). Le scorte possono essere immagazzinate a -20 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi e non devono essere rese fresche.

2. Isolamento, digestione enzimatica e creazione di organoidi

  1. Isolare gli organoidi della prostata dal tessuto umano o del topo secondo i protocolli stabiliti in precedenza5,7. Di seguito è riportata una breve descrizione.
    1. Mito e tessuto prostatico ezimaticamente digest per produrre una singola sospensione cellulare. In questo esperimento, 1 mL di 5 mg/mL collagenase di tipo II in ADMEM/F12 è stato utilizzato per la digestione di 50 mg di tessuto prostatico.
    2. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 300 x g per 5 min, contare le cellule, risospenderle nella matrice della membrana seminterrato e piastra alla densità appropriata5,7 nelle cupole matrice su piastre di coltura organoide preriscaldate (placcatura è illustrato nella Figura 1A).
    3. Lasciare che le cupole si solidifichino e aggiungere supporti sulle cime delle cupole in modo che siano completamente coperte.
  2. Aumentare gli organoidi alla quantità desiderata per le applicazioni a valle. Il numero di cella può essere determinato con metodi di conteggio standard. Vedere la sezione specifica dell'applicazione del protocollo per ulteriori dettagli sulla densità.
  3. Utilizzando una pipetta P1000, disegnare il mezzo e pipetta su e giù per interrompere. Quando la matrice della membrana del seminterrato è completamente perturbata, trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL. Non posizionare più di 10 cupole per singolo tubo conico da 15 mL. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
  4. Estrarre il supernatante e lavare il pellet cellulare con 5 mL di PBS. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
  5. Estrarre il supernatante e risospendere il pellet in 4 mL di sostituzione della trypsin. Digerire per 5-10 min con agitazione a 37 gradi centigradi. Aggiungere un volume uguale di mezzo organoide : 10% FBS per inibire la sostituzione della trypsin. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
  6. Estrarre il supernatante e risospendere in 1 mL di PBS.
  7. Filtrare la sospensione con un filtro da 40 m per garantire una singola sospensione a cella. Quantificare il numero di cellulare utilizzando un emocitometro o un dispositivo di conteggio equivalente.
    NOTA: Se ottenere celle singole vitali è difficile, utilizzare l'ordinamento del flusso per ottenere una soluzione a cella singola.

3. Valutazione della capacità di formazione degli organiidi

NOTA: Per determinare la percentuale di cellule che possono generare un organoide, un saggio di semina può essere eseguito come proxy per il potenziale gambo/progenitore. La capacità di formazione degli organoidi è importante anche per definire un numero di semina cellulare per i saggi di fattibilità.

  1. Diluire la sospensione cellulare ottenuta al punto da 2,7 a 100 cellule per 10 gradi della sospensione utilizzando un mezzo organoide contenente 10 m inibitore della chinasi Rho Y-27632.
  2. Trasferire 1.100 celle (110 o l di sospensione) in un nuovo tubo conico.
  3. Aggiungere 285 -L della matrice della membrana del seminterrato e riutilizzare le cellule. Ciò si tradurrà in una concentrazione di matrice del 70%.
    NOTA: La diluizione della matrice della membrana del seminterrato durante la seeding riduce notevolmente la variazione delle dimensioni della cupola, causata dalla viscosità della matrice proteica.
  4. Cellule di semi in 35 - L di cupole a matrice in una piastra preriscaldata 24 pozzetto, con conseguente 200 cellule / bene. La piastra 3-5 esegue la replica per ogni campione (vedere anche il metodo di placcatura nella figura 1A e nel passaggio 2.1.2).
  5. Per garantire che le cellule rimangano all'interno della cupola, capovolgere la piastra e posizionarla in un'incubatrice cellulare per solidificare la matrice della membrana del seminterrato.
  6. Dopo 10 min, rimuovere la piastra dall'incubatrice e aggiungere il mezzo contenente l'inibitore della chinasi Rho.
  7. Rinfrescare il supporto ogni 2 giorni. Dopo 7 giorni, quantificare il numero di organoidi. Mantenere l'inibitore della chinasi Rho nei media durante l'esperimento.
  8. Contare il numero di organoidi stabiliti per cupola e calcolare la percentuale di organoidi formati dal numero totale di cellule placcate (200 cellule).
    NOTA: I rapporti di stabilimento organoid variano dal 3%-60% a seconda del tipo di cellula e del genotipo.

4. Determinazione delle risposte farmacologiche degli organoidi

  1. Continuando dal passaggio 2.7, seme 1.000-10.000 celle in una cupola a matrice. Utilizzare l'efficienza della formazione di organiidi e la velocità di crescita come proxy per determinare il numero di cellule finali.
    NOTA: i numeri di cella consigliati sono disponibili nella Tabella 1. Utilizzare da tre a cinque repliche per condizione per analisi. Utilizzare una concentrazione finale di 70% matrice di membrana seminterrato per ridurre gli errori di pipettaggio indotti dalla viscosità.
  2. Seme 35 - L di cupole a matrice in una piastra di 24 pozzi e lasciare che le cupole si solidifichino come fatto nella sezione 3 (vedere anche il metodo di placcatura in Figura 1A e passo 2.1.2). Aggiungere il mezzo contenente l'inibitore della chinasi Rho e il farmaco di scelta. Questo metodo può essere applicato a tutti i farmaci, ma in questo protocollo, un anti-androgeno di seconda generazione viene utilizzato a 10 M per esempio. Per determinare la concentrazione massima inibitoria (IC50), eseguire un log10 incrementale, e come un controllo, utilizzare il veicolo in cui il farmaco è stato disciolto.
  3. Rinfrescare il mezzo ogni due o tre giorni e analizzare gli organoidi il giorno 7 per determinare la risposta farmacologica del farmaco. I punti di riferimento possono variare tra la scelta dell'esperimento e della droga.
    NOTA: Gli organoidi non devono essere provato per eseguire questi saggi.
  4. Per mantenere intatti gli organoidi, utilizzando una pipetta P1000, disegnare il mezzo e pipetta su e giù per interrompere la matrice della membrana seminterrato.
  5. Quando la matrice della membrana del seminterrato è completamente perturbata, trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL. Non trasferire più di 10 cupole a matrice per tubo conico da 15 mL.
  6. Centrifuga a 300 x g per 5 min. Estrarre il supernatante e lavare con 5 mL di PBS.
  7. Risospendere gli organoidi in 1 mL di PBS e interrompere gli organoidi con la curiosazione e una pipetta Pasteur di vetro.
  8. Quantificare il numero di frammenti organoidi. Il seme 5 replica contenente 100 frammenti organoidi come descritto nel passaggio 2.1.2.
  9. Eseguire il saggio di fattibilità delle cellule come descritto di seguito nella sezione 7.

5. Isolamento dell'RNA dagli organoidi

NOTA: i metodi basati su colonne disponibili in commercio producono una buona quantità e qualità dell'RNA. Per garantire una buona quantità di RNA, utilizzare un minimo di una cupola per campione; tuttavia, utilizzando tre cupole è raccomandato, che può essere seminato in un unico pozzo di un 12 pozzo.

  1. Aggiungere il mercaptoetanolo (1%) al buffer di lisi glutathione nel kit di isolamento dell'RNA.
  2. Estrarre il mezzo dalle cupole della membrana seminterrato contenenti organoidi e aggiungere 750 -L di questo buffer. Pipetta su e giù con una pipetta P1000. Verificare che tutta la matrice della membrana del seminterrato sia stata sciolta.
  3. Aggiungere 750 l del 70% di etanolo e mescolare con il pipettaggio. Successivamente trasferire 700 l offe alla colonna, centrifugare a 12.000 x g per 1 min, e ripetere con il resto del lisato.
  4. Eseguire i fusi e il trattamento DNase a colonna secondo le istruzioni del produttore. RNA elute in 30-50 -L di acqua senza RNA.
  5. Misurare le concentrazioni utilizzando un fluorometro a OD : 260 nm e 280 nm e memorizzare a -80 gradi centigradi o continuare con le applicazioni a valle.

6. Isolamento proteico dagli organoidi

NOTA: per l'isolamento delle proteine, preparare il buffer RIPA standard contenente inibitori di fosforasi e proteasi (Tabella dei materiali). Si consiglia di utilizzare almeno tre cupole, che possono essere semiate in un singolo pozzo 12.

  1. Utilizzando una pipetta P1000, disegnare il mezzo dalla cella con le cupole della membrana seminterrato contenenti organoidi e pipette su e giù per interrompere la matrice della membrana seminterrato.
  2. Una volta completamente perturbata, trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
  3. Estrarre il supernatante e lavare con 5 mL di PBS ghiacciato. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
  4. Estrarre il supernatante e risospendere il pellet in 4 mL di sostituzione della trypsin. Digerire per 5-10 min mentre si agita a 37 gradi centigradi.
  5. Aggiungere un volume uguale di mezzo organoide al 10% di FCS per inibire la sostituzione della trypsin. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
    NOTA: Dopo la centrifugazione, nessuna matrice di membrana seminterrato dovrebbe essere visibile nel pellet.
  6. Estrarre il supernatante e lavare con 5 mL di PBS ghiacciato. Estrarre il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 300 litri di lisi tampone utilizzando un pipet P1000, quindi trasferire in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL.
  7. Incubare sul ghiaccio per 10 min e successivamente sonicare 2x per 30 s ciascuno ad acqua raffreddata con una temperatura di 4 gradi centigradi. Posizionare il tubo sul ghiaccio ed eseguire la quantificazione delle proteine utilizzando metodi standard.
  8. Denaturare la proteina aggiungendo solfato di sodio dodecyl (SDS) contenente la tintura di carico e far bollire per 5 min a 95 gradi centigradi. Memorizzare il lisates a -80 gradi centigradi o continuare con le applicazioni a valle.

7. Saggio di fattibilità cellulare con organoidi

NOTA: La fattibilità cellulare può essere valutata utilizzando il kit di analisi per la fattibilità delle cellule disponibile in commercio e un luminometro. Preparare i buffer secondo le istruzioni del produttore. Si raccomandano cinque repliche per condizione: una replica costituita da una cupola a matrice di membrana del seminterrato da 35 litri in un pozzo di un pozzo di 24 pozzetti.

  1. Estrarre il mezzo della coltura organoide, facendo attenzione a lasciare intatte le cupole della matrice.
  2. Aggiungere 65 -L di PBS e pipetta su e giù per interrompere la cupola a matrice.
  3. Aggiungere 100 l del tampone di analisi di fattibilità della cella e rimovire con il pipettaggio.
  4. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 10 min con agitazione.
  5. Trasferire 100 l di miscela su una piastra non traslucida adatta per il luminometro ed eseguire la lettura secondo le istruzioni del produttore per il kit di prova di fattibilità cellulare.

8. Preparazione degli organoidi per lo xenotrapianto

NOTA: Gli organoidi sono anche suscettibili di innesto sottocutaneo sia in entrambi gli animali compromessi immunitari, sia nei topi ipogeni. Per garantire che gli organoidi iniettati siano distinguibili in vivo, etichettare gli organoidi con un fluoroforo che esprime in modo stituamente5. Si raccomanda di eseguire un esperimento pilota per l'innesto utilizzando 5 x 105 cellule a 2 x 106 cellule per iniezione, con incrementi di 5 x 106 cellule, poiché l'efficienza dell'innesto varia tra le linee organoidi.

  1. Utilizzando una pipetta P1000, disegnare il mezzo e pipetta su e giù per interrompere la matrice di membrana seminterrato. Una volta completamente perturbata, trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
    NOTA: Non trasferire più di 10 cupole a matrice per tubo conico da 15 mL.
  2. Estrarre il supernatante e lavare con 5 mL di PBS. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
  3. Estrarre il supernatante e risospendere il pellet in 4 mL di sostituzione della trypsin. Digerire per 5-10 min mentre si agita a 37 gradi centigradi.
  4. Aggiungere lo stesso volume di mezzo organoide : 10% FBS per inibire la sostituzione della trypsin. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
  5. Estrarre il supernatante e risospendere in 1 mL di PBS. Filtrare la sospensione con un filtro da 40 m per garantire una singola sospensione a cella. Quantificare le cellule utilizzando metodi standard.
  6. Girare verso il basso e risospendere le cellule in PBS - Rho inibitore ad una concentrazione di 2 x 106 cellule per 100 L (vedi tabella 2 per le concentrazioni delle cellule e il numero assoluto di cellule necessarie per concentrazioni variabili). Utilizzare un volume uguale di matrice di membrana seminterrato per generare una sospensione 1:1. Posizionare la sospensione sul ghiaccio.
  7. Iniettare le cellule secondo protocolli standard e monitorare la crescita dello xenotrapianto utilizzando i metodi standard8.

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Risultati

Efficienza di seeding
La capacità di formazione degli organiidi è determinata dal fenotipo e dal genotipo. Le cellule basali della prostata di tipo selvaggio (WT) hanno mostrato una capacità di formazione organoide superiore (30%-40%) rispetto alle cellule luminali (3%) (Figura 1A). Dopo l'istituzione degli organiidi, la capacità di formazione aumentò drasticamente. In genere, il 25%-30% delle cellule derivate da un organo...

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Discussione

Comprendere i meccanismi molecolari alla base della resistenza anti-androgeni e scoprire potenziali vulnerabilità terapeutiche richiede il test delle risposte farmacologiche nei sistemi modello che imitano il cancro alla prostata. Di seguito è descritto un protocollo dettagliato per l'analisi affidabile delle risposte farmacologiche negli organoidi della prostata derivati dal paziente e geneticamente ingegnerizzati e la preparazione di questi campioni organoidi per applicazioni a valle.

Esisto...

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Dichiarazioni

C.L.S fa parte del consiglio di amministrazione di Novartis; è cofondatore di ORIC Pharmaceuticals e coinventor di enzalutamide e apalutamide; è consulente scientifico di Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra e PMV; ed è cofondatore di Seragon, acquistato da Genentech/Roche nel 2014. W.R.K. è coinventor e titolare di brevetti di tecnologia organoide.

Ringraziamenti

K.P. è supportato da NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. è supportato da HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; e Starr Cancer Consortium. W.R.K. è supportato da Dutch Cancer Foundation/KWF Buit 2015-7545 e Prostate Cancer Foundation PCF 17YOUN10.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
A83-01Tocris2939Componente del terreno dell'organoide: Concentrazione finale 200 nM
ADMEM/F12Tecnologie Gibco/Life12634028Componente del terreno dell'organoide
B27Tecnologie Gibco/Life17504-044Componente del terreno dell'organoide
Piastre per colture cellulariFisher657185
Cell Titer GloPromegaG7571
DHTSigma-AldrichD-073Componente del mezzo dell'organoide: Concentrazione finale 1 nM
DMSOFisherBP231-100
EGFPeprotech315-09Componente del mezzo dell'organoide: Concentrazione finale 50 ng/ml per il topo, 5 ng/nl per l'FGF10
umano Peprotech100-26Componente del mezzo dell'organoide specifico per l'uomo: Concentrazione finale 10 ng/ ml
FGF2Peprotech100-18BComponente del mezzo organoide specifico per l'uomo: Concentrazione finale 5 ng/ml
GlutamaxGibco/Life technologies35050079Componente del mezzo
organoide HEPESMADE IN-HOUSEN/AComponente del mezzo organoide: Concentrazione finale 10 mM
Matrigel (fattore di crescita ridotto e CorningCB-40230CComponente medio organoide
N-acetilcisteinaSigma-AldrichA9165Componente medio organoide: Concentrazione finale 1,25 mM
NicotinamideSigma-AldrichN0636Componente medio organoide specifico umano: Concentrazione finale 10 mM
NOGGINPeprotech o cellule 293t trasfettate stabili con costrutto Noggin (Karthaus et al. 2014)120-10CComponente del mezzo dell'organoide: Concentrazione finale 10% del terreno condizionato o 100 ng/ml
Penicillina/streptavidinaGemini Bio-Products400-109Componente medio dell'organoide
Inibitori della fospatasiMerck Millipore524629
Prostaglandina E2Tocris3632464
Inibitori della proteasiMerck Millipore539131
R-SPONDINPeprotech o cellule 293t trasfettate stabili con costrutto R-spondin1 (Karthaus et al. 2014)120-38Componente del mezzo organoide: Concentrazione finale 10% terreno condizionato o tampone RIPA da 500 ng/ml
Merck20-188
minikit RNA-easyQiagen74104
SB202190Sigma-Aldrich152121-30-7Componente del mezzo organoide specifico umano: Concentrazione finale 10 μ M
TryplEThermoFisher12605036
Y-27632SelleckchemS1049Organoide medio componente: Concentrazione finale 10 μ M

Riferimenti

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